家蚕核多角体病毒解旋酶基因启动子及增强子hr3功能分析

从BmNPVZJ8株克隆了解旋酶（helicase)基因ATG上游的510bp启动子,序列分析发现,该启动子同时具有早期和晚期RNA转录起始位点,将起始密码突变为ATT后,引入萤火虫荧光素酶（Luc)基因作瞬时表达分析,用表达质粒pBmhel510luc转染Bm-5和Sf-21细胞,解旋酶基因启动子能被细胞的RNA聚合酶识别,具有早期启动子的特性,且病毒因子对hel510启动子具有反式激活作用。杆状病毒同源重复区（hr)序列是病毒DNA复制起始点,又具有增强子功能,将BmNPVhr3序列克隆到hel510启动子的下游进行瞬时表达,结果表明,hr3可增强hel510启动子在昆虫细胞和家蚕幼虫中的转录活性分别在7000倍和1000倍左右。     

家蚕核多角体病毒解旋酶基因启动子功能区域缺失分析

杆状病毒DNA解旋酶是病毒复制所必需的。瞬时表达分析显示 ,家蚕核多角体病毒解旋酶基因启动子属于延迟早期基因启动子。通过PCR技术在该启动子区产生的一系列缺失分析表明 ,解旋酶基因启动子的基础转录调控区主要位于ATG上游 - 5 1 0～ - 4 1 0bp之间。当只保留ATG上游 98bp区段时 ,仍可测到该启动子的基础活性。在病毒因子存在下 ,将启动子区域删除到ATG上游 - 4 1 0bp时 ,对启动子活性影响不大 ;若继续删除 ,则其活性显著下降。据此推测对病毒因子响应的启动子区段应主要位于ATG上游 - 4 1 0～ - 30 9bp之间     

油桐尺蠖核多角体病毒多角体蛋白基因定位与克隆

以[~(32)P]-dATP标记含AcNPV DNA的EcoRI-I片段的重组质粒为探针,在35℃条件下对油桐尺蠖核多角体病毒(BsNPV)多角体蛋白基因进行了定位,将其分别定位在BamH Ⅰ-A,Bgl Ⅰ-A,Bgl Ⅱ-F,EocR Ⅰ-R,Hind Ⅲ-A,Kpn Ⅰ-Ⅰ,Pst Ⅰ-D,Xba Ⅰ-A(或B),Xho Ⅰ-F和G片段上,并以M13mp18为载体,克隆了Kpn Ⅰ-Ⅰ片段。     

昆虫病毒多角体蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

将含有大尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)多角体蛋白基因(ocu)的BamHl一H片段克隆到表达载体pDR 540的BamiHl位点,得到能抗高浓度氨苄青霉素(200μg／ml)的两个阳性重组体,其胞外总蛋白比亲本质粒高1．1-1．4倍。在大肠杆菌细胞中,BsNPV ocu基因在原核杂合启动子tac驱动下能高水平的表达,表达量达到0．8和4．7mg／ml。免疫沉淀反应证明,表达蛋白为BsNPV的包涵体蛋白,凝胶过摅法测定的平均分子量为32.1×103道尔顿。     

核多角体病毒在昆虫细胞系内的装配方式

本文对AcNpV、HaNPV和EsNPV在各自敏感细胞系内的装配过程作了研究。除在复制时间上稍有差别外,均具以下特点：核衣壳装配与病毒基质(Vs)和发夹结构(HC)有密切的关系,有些核衣壳尚需经剪切加工;有两种表型子代病毒,封存体(OB)和未埋入型病毒(NOV);前者在核内完成装配,后者可在核内、核膜上、胞质内或细胞膜上完成套膜装配,且与细胞膜系统密切相关;AcNPV复制晚期出现不完全装配现象．     

柞蚕核多角体病毒核多角体基因的定位和克隆

通过Southern转印杂交证明,柞蚕核多角体病毒(Antheraea pernyi nuclear polyhedrosis virus,ApNPV)核多角体基因位于该病毒基因组DNA Bam HⅠ D和E片段上,我们巳将这两个片段分别克隆到pAT153质粒中,并用末端杂交法确定了ApNPV核多角体基因的方向,对含有这一基因的片段进行了限制性内切酶图谱分析,进而对这一基因部分编码区进行了核苷酸序列分析,在用ApNPV这一段序列(222bp)与其他昆虫核多角体病毒AcNPV(AutograPha californica NPV,苜蓿丫纹夜蛾NPV);BmNPV(Bombyx mory NPV,家蚕NPV);OpNPV(Orqyia Pseudotsugata NPV,黄杉毒蛾NPV)核多角体基因相应区段相比较分析中,发现它们之间的同源核苷酸序列比率分别为77.5％、84％和80％。     

昆虫杆状病毒晚期启动子在大肠杆菌中启动CAT基因表达

将油桐尺蠖（Ｂｕｚｕｒａｓｕｐｐｒｅｓｓａｒｉａ）核多角体病毒晚期基因──多角体蛋白基因启动子及５′端编码区,以两种不同方式置于缺乏启动子的氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）基因上游,使其分别终止在不同翻译终止位点,其宿主菌具有明显不同的氯霉素抗性,最高达２００ｍｇ／Ｌ　ＬＢ培养基以上,表明昆虫病毒启动子能启动原核基因表达。对多角体蛋白基因启动子能在大肠杆菌中有效工作的原因进行了讨论。     

苜蓿丫纹夜蛾杆状病毒在四个异源连续细胞系内的传代复制

本文比较了苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)在贪食夜蛾IPLB-SF-21AE细胞及其克隆株IPLB-SF-21AEC细胞,棉铃虫SIE-HAH-806细胞和粘虫SIE-MSH-805细胞系内长期连续传代复制的情况,每代病毒复制的历程为7天,观察指标是,细胞内形成多角体的百分率,游离病毒粒子的TCID50,对幼虫活体感染性,以及受感染后细胞超微结构的变化,结果证实,AcNPV在异源IPLB-SF-21AE昆虫细胞系内连续复制至50代次后,依然具有正常的形态和感染性,这为在离体下长期有效地复制杆状病毒提供了可能,我们还发现,在离体系统内增殖的病毒,其正常形态和感染性的维持与选用敏感细胞的种类有关。     

专一地切割苜蓿夜蛾核多角体病毒多角体蛋白mRNA的ribozyme的设计与性质

本文针对苜蓿夜蛾Autographa californica核多角体病毒的多角体蛋白mRNA设计并合成了两个ribozyme。体外实验结果表明它们都能准确、高效地切割体外转录得到的mRNA片段。实验表明,在一定的范围内,切割百分率随着温度的升高、时间的延长和ribozyme浓度的提高而增加。Ca~(2+)、Mn~(2+)可以代替Mg~(2+)作为ribozyme切割反应所必需的二价金属离子。     

专一地切割苜蓿夜蛾核多角体病毒多角体蛋白Mrna的ribzyme*的设计与性质”

本文针对苜蓿夜娥Autographa californica核多角体病毒的多角体蛋白mRNA设计并合成了两个ribozyme体外实验结果表明它们都能准确、高效地切割体外转录得到的mRNA片段。实验表明,在一定的范围内,切割百分率随着温度的升高、时间的延长和ribozyme浓度的提高而增加。Ca²⁺、Mn²⁺可以代替Mg²⁺作为ribozyme切割反应所必需的二价金属离子。     

氯霉素乙酰基转移酶基因在家蚕核型多角体病毒P10基因启动子控制下的表达

昆虫核型多角体病毒(NPV)P10基因属于晚期基因,为强启动子所控制,又是病毒复制所非必需的基因。我们对前报的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)P10基因,应用PCR技术进行ATG区定点突变,在ATG被突变的同时形成一个BglⅡ酶切位点,得到一个不含ATG的BmNPV P10基因启动子。将长为230bp的经突变后的BmNPV P10基因5’端(包括启动子所有特征)片段克隆进pMMTV·CAT质粒中,构建成一个CAT基因在BmNPV P10基因启动子控制下的pBmPl0·CAT瞬间表达质粒。该质粒通过转染进入经野生型BmNPV感染的BmN细胞中,CAT得以表达。证明BmNPV P10启动子是比较强的启动子,可以在BmN细胞表达外源基因,具备了作为表达载体启动子的特性。     

SINPV基因组酶切图谱及多角体基因的序列分析

用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＸａｂＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＨｉｄｎⅢ、ＳｍａＩ酶解斜纹夜蛾核多角体病毒广州株基因组ＤＮＡ,分别得到２６、２６、２４、２０、１３、１７、９、１条片段,并算得基因组平均大小为１３６．０ｋｂｐ。以ＡｃＮＰＶ多角体基因的部分读码框为探针,经Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交将ＳＩＮＰＶ多角体基因定位于ＸｂａＩＯ片段上。将此片段克隆并序列分析,结果表明ＳＩ     

解毒酶基因的克隆及其在大肠杆菌和蓝藻中的表达(英文)

近几年来 ,在明确了杀虫药剂抗性机理的基础上 ,从杀虫药剂抗性的昆虫中分离出高抗性基因 (即解毒酶基因 ) ,将该基因克隆到表达载体 pRL 4 39上 ,得到表达载体 pRL B1,将其转化大肠杆菌HB10 1,获得了可以表达解毒酶基因的转基因工程菌株。同时构建了穿梭表达载体 pDC B1,并转化大肠杆菌HB10 1后 ,在抗生素氨卞霉素 (30 μg/mL)和卡那霉素 (30 μg/mL)平板上挑选阳性克隆 ,将阳性克隆的细胞、蓝藻和结合质粒以三亲结合转移的方式转入蓝藻。斑点杂交、Southern分析结果表明已经获得了Synechococcussp .PCC 794 2转基因工程藻。     

霍乱毒素B亚单位工程菌MM2的表达与lac启动子的关系

研究了不同碳源(葡萄糖、乳酸和乙酸)以及IPTG诱导对工程菌MM2表达霍乱毒素B亚单位(CTB)的影响,ctb基因位于lac启动子的下游。在YC培养基中分别加入0.048mol/L的葡萄糖、0.102mol/L的乳酸和0.167mol/L的乙酸,它们在完全氧化后可产生相同的能量。结果表明,加入葡萄糖会大幅度降低ctb基因的表达水平,其原因和培养过程中pH值下降有关;加入乳酸可提高ctb基因表达水平1.15倍,且不抑制菌体生长;加入乙酸可提高ctb基因的表达水平0.9倍,但对菌体生长有抑制作用。不同时间及不同浓度的IPTG诱导未能提高ctb基因的表达水平,说明lac启动子对ctb基因的表达没有影响或影响很小。