头孢菌素C乙酰化酶的半理性改造及7-ACA的生物合成

CPC乙酰化酶是一步酶法制备7-ACA的关键酶,针对它的研究具有重大的经济价值。为了获得对CPC具有更高催化活性的CPC乙酰化酶,以Pseudomonas sp SE 83来源的Ⅲ型CPC乙酰化酶CA Ⅲ为亲本,借助分子对接的手段确定了它与CPC结合的关键氨基酸残基,并确定将这些关键氨基酸残基突变为侧链基团更小的氨基酸残基,对CA Ⅲ的编码基因利用多点定点突变试剂盒完成定点突变后借助p ET32a质粒在E.coli BL21(DE3)中实现了可溶性表达,获得了对CPC催化活性更高的重组突变体reCA Ⅲ~M,其比酶活为26.7 IU/mg,较原酶提高了3.44倍。此外,初步研究了利用reCA Ⅲ~M进行一步酶法生产7-ACA的工艺,40 IU/g CPC的加酶量、25℃的条件下反应12 h,CPC的转化率和7-ACA的得率分别可达96.3%和63.4%,表明该酶具有良好的应用前景。CPC乙酰化酶的分子改造上取得的较为理想的结果,为该酶进一步的分子改造及应用奠定了坚实的基础,也为其它酶的分子改造提供了可资借鉴的经验。     

化学修饰对青霉素G酰化酶活性的影响

为进一步阐明大肠杆菌AE 109青霉素G酰化酶(PA,E.C.3.5.1.11)的结构与功能关系,研究了数种修饰剂对酶活性的影响;同时测定了四种作用物存在下对各修饰剂修饰酶的影响。结果表明Ser残基处于酶的活性部位,Met残基可能处于与底物结合的部位,His和Cys残基与酶的活性无关。     

P.versicolor龙虾D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶的X射线晶体学研究——分子置换法结构测定

由P.versicolor龙虾尾肌提取的HOIO-D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),已长出可供Χ射线衍射用的晶体。初步Χ射线晶体学研究确定:此酶晶体属於C2空间群,不对称单位内含有半个分子,分子坐落在二重轴上。以Homarus Amercanus龙虾GAPDH结构为模型结构,应用分子置换技术进行了低分辨率Χ射线结构分析,结果表明:分子内亚基排列具有222对称性,分子Q轴平行于晶体学二重轴b,分子P和R轴分别平行于晶体学a和c轴。按分子置换法推出的结构模型算得5A分辨率的晶体学R因子为0.46。并获得了一套5A。分辨率的电子密度图。此酶的几种同晶型晶体,特别是荧光NAD衍生物晶体的较高分辨率的结构分析工作正在进行中。     

猪心线粒体F_1-ATP酶的水解活性与色、酪氨酸残基相关的构象的关系

线粒体H~ -ATP酶具有双向功能,即ATP的合成与ATP的水解。H~ -ATP酶的头部F_1具有催化这二种功能的活性部位,F_1的活性表现位与它结合核苷酸的类型、数目以及亲和力有关。至于F_1分子活性部位中什么结构与这两种功能有关,目前尚不肯定。自1960年以来关于线粒体F_1的水解功能与其结构中氨基酸残基关系的研究,多采用特异的化学试剂去修饰某些氨基酸残基,然后测其水解活力被抑制的情况。Senior认为不是含—SH基的半胱氨酸而是酪氨酸残基,还可能包括色氨酸残基与ATP的水解有关。也有报道认为是与组氨酸、谷氨酸或精氨酸残基有关。现在蛋白质结构     

大肠杆菌AS1.357 L-天门冬酰胺酶的选择性化学修饰

用九种化学修饰剂研究了大肠杆菌AS1.357 L-天门冬酰胺酶分子中的五种不同氨基酸侧链基团与催化活性的关系。结果说明,渡酶活力与硫氧墓完全无关;与色氨酸、精氨酸和组氨酸亦无直接联系;而酪氨酸残基和羧基的修饰引起酶活力急剧下降。其中酪氢酸残基巳被证实是该酶活力的必需基团,处于该酶分子的活性部位。     

尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶A2的新晶型结构

从尖吻蝮蛇毒中分离出一种酸性磷脂酶A2 ,得到了一种新的晶型。用分子置换法测定其晶体结构 ,结构的分辨率达到 0 .2 8nm。该结构给出 2 1.9%的晶体学R因子 (R free =2 5 .7% )和合理的立体化学参数。与已报道的晶型相似 ,不对称单元的两个独立分子形成二体 ,揭示了这种二体的稳定性。二体的形成过程也伴随着 14～ 2 3肽段显著的构象变化 ,这一肽段属于磷脂酶A2 的界面识别部位。氨基酸序列分析表明 ,带正电荷的 34位残基是所有第二类具有溶血活性磷脂酶A2 的共同特点。NaCl对晶体的堆积具有显著的影响 ,从而导致晶胞参数的明显改变。与已报道的晶型不同 ,在酶分子的疏水通道内观测到了 2 甲基 2 ,4戊二醇 (2 methyl 2 ,4 pentanediol,MPD)分子     

3-磷酸甘油醛脱氢酶胍变性时的活力及构象变化

酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶在盐酸胍溶液中的内源荧光及剩余活力的变化结果提示:apo酶及holo酶的活力在胍浓度为0.5M左右可完全丧失.同时伴有内源荧光强度的下降,光谱宽度的增加和335nm最大发射峰的红移(提示了色氨酸残基的暴露).与已经报导的肌肉酶(内源荧光强度在胍浓度为0.4—1.2M范围相对稳定)不同,酵母酶内源荧光在此浓度范围内表现为逐渐降低.在0.7M胍溶液中,内源荧光变化动力学过程只能测出一相,而酶失活动力学过程为快慢两相,快相动力学速度常数至少大于内源荧光降低速度常数三个数量级以上.以上结果提示:低浓度胍可引起该酶的完全失活,活性部位的空间构象比酶分子的构象更易受到变性剂的扰乱;有一个色氨酸残基位于或靠近酶的活性部位.     

电荷传递反应可以敏感地考察铜锌超氧化物歧化酶活性部位的构象变化

Fe(CN)₆^4-与铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)间的电荷传递反应发生在酶的活性部位,电荷传递反应的速度和幅度对由变性引起的酶活性部位的构象变化非常敏感.对于所有的变性酶样品,电荷传递反应的速度都不同程度的下降,这与每个样品的活力下降相对应.反应速度的下降反应了酶变性后引起的活性通道构象及其间静电场的破坏.在不同pH条件下变性的酶样品,其电荷传递反应幅度的变化表明,活性部位His残基的静电相互作用对变性过程中活性部位的构象变化可能是重要的.由电荷传递反应参数得到的活性部位构象变化速度与酶的失活速度接近.     

高峰淀粉酶的分子可及性的研究

依据高峰淀粉酶的晶体结构数据对它的分子可及性进行了计算和分析,得到了极性与非极性氨基酸的分布、极性原子与非级性原子对可及性的贡献、催化活性中心裂隙的构象、Ｃ末端结构域空间拓扑等信息。活性部位氨基酸残基的可及性研究结果与酶－底物复合物模型相符。     

嗜酸氧化亚铁硫杆菌的谷胱甘肽还原酶的结构模建和底物分子对接

极端环境微生物嗜酸氧化亚铁硫杆菌的谷胱甘肽还原酶(GR)可能在它的抵抗极端酸性,有毒和氧化性的生物浸出环境中发挥至关重要的作用.通过同源模建技术和分子动力学模拟,它的一个三维结构被构建,优化和检验了.获得的结构被进一步用于搜索绑定位点,跟辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和底物谷胱甘肽(GSSG)进行分子柔性对接,并以此识别关健残基.对接结果显示,位于活性残基Cys42和Cys47之间的二硫键夹在FAD的活性位点和底物GSSG的二硫键之间.它们之间的距离非常靠近,这跟底物反应机理的初始步骤的情况十分一致.相互作用能表明8个酶中残基Cys42,Cys47,GIu443B,Glu444B,His438B,Ser14,Thr447B和Lys51是固定或激活GSSG的关键残基,这跟以前的实验事实相吻合.此外,根据相互作用能我们还新发现7个重要残基(Arg449B,Pro439B,Thr440B,Thr310,Va143,Gly46 and Va148).所有这些残基在其它物种中的相应物中也都是保守的.这些结果有助于进一步的实验研究和理解其催化机理,进而揭示这种细菌的抗毒机理,服务于工业应用.     

金黄色葡萄球菌核酸酶C末端去9肽对酶蛋白溶液构象的影响

通过多维异核核磁共振方法,结合运用荧光和圆二色等光谱方法,比较研究了V8菌株金黄色葡萄球菌核酸酶（含149个氨基酸残基）,酶蛋白1－140片段（SNase140)以及在TMP（thymidine 5′-monophosphate)和Ca^2 存在下的SNase140的溶液构象状态。探讨了酶蛋白C末端去9肽后对酶蛋白构象和活力的影响。研究指出,远离酶蛋白活性部位残基间相互作用的变化,将通过酶蛋白两个亚结构域之间所形成的氢键,影响酶蛋白活性部位的空间构象,从而影响酶蛋白的活力。     

马氏钳蝎中性神经毒素BmK M4 0.20nm晶体结构测定

BmKM4是一种中性蝎神经毒素,在BmK系列中具有中等毒性,属GroupⅢα-型毒素.纯化样品结晶为六方晶体,空间群为P61.运用X射线衍射分析技术,通过分子置换法在0.20nm分辨率水平测定了BmKM4晶体结构,并对模型结构进行了修正.最后的晶体学R因子为0.142,自由R因子为0.173,模型的标准键长偏差为0.0015nm,标准键角偏差为1.753°.在一个不对称单位里加入了64个水分子.精化的结构显示第10位残基含有1个反常的非脯氨酸顺式肽键.将精化后的结构与GroupⅡα-型蝎毒素BmKM8(酸性弱毒素)的结构进行比较,并以此为基础讨论该cis肽键可能的结构意义.     

江浙蝮蛇毒性碱性磷脂酶A2新单斜晶型晶体结构测定

江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A2具有溶血和抗凝血活性。在不含正辛基吡喃葡萄糖苷（n-octyl β-o-glucopyranoside,简称β－OG）结晶条件下,培养出该酶新单斜晶型晶体。采用X射线晶体学方法,成功地解出了不对称单位含4个分子的新单晶型结构。在分子置换研究中心运用自身与交叉旋转函数的联合分析,在结构修正中使用非晶体学对称性制约,最终结构模型具有可接受的晶体学R因子和合理的立体化学参数。与已报道的结合β－OG的单斜晶型结构类似。新晶型中分子也形成具有二重对称性的、被界面识别部位连接的二体,两个二体再通过非晶体学二重轴联系形成一个赝222对称的四聚体。 结晶条件改变对四体在晶胞中的堆砌产生重要影响,导致晶胞参数的显著变化,然而对二体和四体本身影响较小,表明单斜晶型中观察到的二体与四体是稳定的。     

家蚕磷酸吡哆醛激酶cDNA的克隆和酶活表征

吡哆醛激酶 (EC 2.7.1.35) 在 ATP 和 Zn2 的存在下,催化吡哆醛的磷酸化反应生成磷酸吡哆醛 (PLP)。在生物体内许多酶促反应中,PLP 是一种重要的辅酶因子。家蚕和哺乳动物一样,需依赖食物中的维生素 B6前体来合成 PLP。文章描述了利用家蚕基因组数据库序列信息及使用 PCR 方法,克隆出编码家蚕吡哆醛激酶的 cDNA (GenBank 登录号:DQ452397)。克隆到的 cDNA 含有一个 894 bp 的完整可读框,编码一条分子量为 33.1 kDa,含 298 个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质序列与人类吡哆醛激酶蛋白序列具有 48.6%的同一性,包含吡哆醛激酶家族共有的特征保守序列,但其氨基酸残基数比哺乳动物和植物克隆到的吡哆醛激酶残基数均少 10 多个残基。多序列比对结果显示,吡哆醛激酶中几个有关键功能且在哺乳动物和植物中均保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换为其他种类氨基酸残基。采用 T7 启动子和 T7 聚合酶表达系统对克隆到的 cDNA 进行了原核表达并对表达粗提产物进行了酶活检测。实验结果显示表达得到的可溶性蛋白产物占其总蛋白量为 10%,细胞粗提物具有活力为 30 nmol/min/mg 的吡哆醛激酶活性,结果证实了克隆到的 cDNA 编码家蚕中的吡哆醛激酶。     

酸性木聚糖酶XynⅡ活性中心关键氨基酸残基的鉴定

目的:鉴定来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的酸性木聚糖酶XynⅡ活性中心关键氨基酸残基。方法:对XynⅡ进行SWISS-MODEL同源建模和BLAST序列比较,分析XynⅡ中所有可能作为催化残基的保守氨基酸,采用定点突变手段对其进行鉴定研究。结果:只有Glu-79和Glu-170位于酶与底物作用的活性中心,它们分别位于β折叠股B6和B4上,推测Glu-79和Glu-170为XynⅡ活性中心关键氨基酸残基。将Glu-79和Glu-170突变为酸性的Gln,突变酶E79Q,E170Q在大肠杆菌和毕赤酵母中表达后,活性均丧失。结论:79位、170位Glu是木聚糖酶XynⅡ活性中心的关键氨基酸残基,为该酶进一步的结构与功能研究提供了理论基础。     

葡萄糖淀粉酶色氨酸残基及底物结合位点的研究

 本文用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)对葡萄糖淀粉酶进行特异性修饰,当酶分子表面有3个色氨酸残基被修饰后,酶活力完全丧失。用邹氏图解法测得酶活性中心有一个色氨酸残基是必需的。如果在酶液中加入不同的底物再用NBS氧化,用荧光发射和荧光猝灭光谱检测表明,底物对酶分子有不同程度的保护作用。在被测试的三种底物中,这种保护能力依为糊精>淀粉>麦芽糖。     

A_(21)—Asp人胰岛素突变体2.4埃分辨率晶体结构研究

A_(21)-Asp人胰岛素(A_(21)D-HI)是经由蛋白质工程途径制备的突变体,具有高稳定特性.本文报道在2.4埃分辨率A_(21)-HI X-射线晶体结构的测定,所获结构模型经能量制约的最小二乘技术(EREF)精化,最后的晶体学一致性因子R=0.192,共价键长与标准值的平均偏差为0.019埃.在(2F-F_e)电子密度图上,突变残基A_(21)-Asp清晰可见.与天然胰岛素比较,除践基A_(21)外,突变体分子的构象在该分辨率未见显著变化,具有重要结构意义的残基A_(21)-NH与B_(23)-Co之间的主链氢键在两个独立分子中都仍然保持,A链末端羧基与B_(22)-Arg的侧链胍基间的盐键在分子中也仍然保持.在这一基础上,讨论了突变体与分子的化学稳定性和生物活力的关系.     

用于B→O血型改造的不同α-半乳糖苷酶的比较

α 半乳糖苷酶因可水解人B型红细胞表面的α 半乳糖残基 ,使B抗原结构变成O抗原结构 ,而成为B→O血型改造的工具酶 .对可能具有酶解B抗原活性的 3种α 半乳糖苷酶 ,即来源于大豆、咖啡豆和人的α 半乳糖苷酶的结构和功能进行了比较研究 .首先 ,利用序列分析工具对 3种酶蛋白的一级结构和特性进行了比较 ;随后 ,将编码大豆和人的α 半乳糖苷酶的cDNA克隆入毕赤酵母中进行表达 ,对筛选所得表达菌株进行诱导培养 ,并从培养上清中纯化重组的大豆和人α 半乳糖苷酶 ;分别测定大豆、咖啡豆和人α 半乳糖苷酶的生物化学性质以及它们的底物特异性 ;最后 ,以纯化的重组酶对人B型红细胞进行酶解 ,并测定酶解后红细胞的结构与功能 .结果表明 ,人源的α 半乳糖苷酶不适于酶解B抗原 ,而大豆来源的α 半乳糖苷酶不仅可作为B→O血型改造的工具酶 ,而且比咖啡豆来源的α 半乳糖苷酶更具优势     

细胞色素C中肽段相对运动的动力学分析

我们利用经验势函数作为蛋白质分子内部相互作用势的依据,使用自己编写的程序对细胞色素C中残基80～83构成的肽段的动力学性质进行了计算,并在郎之万方程近似下进行了粗略的讨论.有关的X射线晶体学研究发现,该肽段在细胞色素C的氧化态和还原态构象上有明显的差异;我们的计算结果说明,这种构象变化不可能起因于该肽段的随机摆动.     

低活性hTNF-α突变蛋白的免疫原性分析

肿瘤坏死因子-alpha(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)在多种疾病如类风湿关节炎等自身免疫病发病机理上起着至关重要的作用。TNF-α生物抑制剂,在临床上具有很好的疗效。由于TNF-α是一种高活性的炎症因子,直接将其作为疫苗,会对机体产生很大的毒性副作用。故需要对天然的TNF-α进行点突变研究,找到生物活性很低的但同时保持良好的免疫原性的突变分子。本研究对人TNF-α活性部位4个关键氨基酸残基(K11,Y87,Y119,A145)进行了点突变和突变蛋白的免疫原性研究。发现Y119N、Y119G、Y87H、Y87H/A145R、K11Y、K11F这6个突变蛋白的生物活性较天然TNF-α下降90%以上,而免疫原性不受点突变的影响。