嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药的分子机制

【目的】调查从浙、苏、皖等地水产动物中分离的23株致病性嗜水气单胞菌的耐药谱并探索喹诺酮类抗生素耐药菌株的耐药分子机制。【方法】根据美国临床实验室标准化协会药敏判断标准(2011版)测定23株嗜水气单胞菌耐药谱并筛选喹诺酮类抗生素耐药株;对筛选的耐药菌株和体外诱导耐药菌株的gyrA和parC基因耐药决定区进行分析;用二倍稀释法测定加入多重耐药外排泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙前后耐药菌株对恩诺沙星最小抑菌浓度的变化,同时检测喹诺酮类药物相关的外排泵基因qepA、oqxA和mdfA;并检测质粒介导的喹诺酮耐药的qnr家族基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD和qnrS。【结果】所有菌株都存在对5种以上药物的耐药性;39.1%(9/23)的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药,其中55.6%(5/9)对恩诺沙星耐药。耐恩诺沙星的5株菌株均携带qnrS,而不携带qnrA、qnrB、qnrC、qnrD基因,也不携带外排泵基因qepA、oqxA和mdfA。其中耐药菌株AH19同时存在gyrA与parC基因双突变、质粒介导的耐药基因qnrS和主动外排泵三种耐药机制,菌株AH4、AH7和AH20存在gyrA与parC基因双突变和质粒介导的耐药基因qnrS两种耐药机制,AH6存在gyrA基因突变和质粒介导的耐药基因qnrS机制,体外诱导耐药菌株ATCC7966-QR相对于原始菌株ATCC7966发生了gyrA与parC基因双突变。【结论】喹诺酮类药物作用靶位的改变和质粒介导的耐药基因qnrS的存在是本研究中涉及的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药的主要作用机制,主动外排泵机制是个别菌株存在的耐药机制。     

嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药的分子机制

摘要:【目的】调查从浙、苏、皖等地水产动物中分离的23 株致病性嗜水气单胞菌的耐药谱并探索喹诺酮类抗生素耐药菌株的耐药分子机制。【方法】根据美国临床实验室标准化协会药敏判断标准(2011 版)测定23株嗜水气单胞菌耐药谱并筛选喹诺酮类抗生素耐药株;对筛选的耐药菌株和体外诱导耐药菌株的gyrA和parC基因耐药决定区进行分析;用二倍稀释法测定加入多重耐药外排泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙前后耐药菌株对恩诺沙星最小抑菌浓度的变化,同时检测喹诺酮类药物相关的外排泵基因qepA、oqxA和mdfA;并检测质粒介导的喹诺酮耐药的qnr家族基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD和qnrS。【结果】所有菌株都存在对5种以上药物的耐药性;39.1%(9/23)的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药,其中55.6%(5/9)对恩诺沙星耐药。耐恩诺沙星的5株菌株均携带qnrS,而不携带qnrA、qnrB、qnrC、qnrD基因,也不携带外排泵基因qepA、oqxA和mdfA。其中耐药菌株AH19同时存在gyrA与parC基因双突变、质粒介导的耐药基因qnrS和主动外排泵三种耐药机制,菌株AH4、AH7和AH20存在gyrA与parC基因双突变和质粒介导的耐药基因qnrS两种耐药机制,AH6存在gyrA基因突变和质粒介导的耐药基因qnrS机制,体外诱导耐药菌株ATCC7966-QR相对于原始菌株ATCC7966发生了gyrA与parC基因双突变。【结论】喹诺酮类药物作用靶位的改变和质粒介导的耐药基因qnrS的存在是本研究中涉及的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药的主要作用机制,主动外排泵机制是个别菌株存在的耐药机制。     

嗜水气单胞菌耐四环素的蛋白质组学初步研究

采用四环素次抑菌浓度对嗜水气单胞菌进行选择,筛选得到耐四环素的嗜水气单胞菌菌株,其MIC（最低抑菌浓度）为出发菌株的8倍。通过比较对照菌与耐药菌总蛋白质的双向电泳图谱,获得3个差异显著的蛋白点。对这3个差异蛋白质进行肽质量指纹及其生物信息分析,分别鉴定为核糖体小亚基蛋白、药物排出系统蛋白和乙酸乙酰辅酶A转移酶亚基。文中对嗜水气单胞菌耐四环素的机理进行了初步探讨。     

嗜水气单胞菌感染现状及耐药分析

目的调查湖州市中心医院嗜水气单胞菌感染现状和耐药情况。方法采用常规方法分离,用VITEK-32全自动微生物分析仪进行菌种鉴定为嗜水气单胞菌或豚鼠气单胞菌,依据葡萄糖产气反应鉴定为嗜水气单胞菌。并根据配套药敏卡进行药敏试验。结果共分离到34株嗜水气单胞菌,主要来自痰液、胆汁、腹腔引流液或腹水。嗜水气单胞菌对哌拉西林、替卡西林、阿莫西彬克拉维酸、妥布霉素、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星、复方新诺明耐药率为52．9％～73．5％。结论目前嗜水气单胞菌也呈现多重耐药现象,临床上应予以重视。     

水产品中嗜水气单胞菌耐药性研究进展

嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila具有广泛的致病性,是水生动物最常见的致病菌之一。由于抗生素不合理使用、质粒以及耐药基因的水平转移等因素,来自零售市场、超市和餐厅的即食海鲜产品中,均可分离出大量的嗜水气单胞菌耐药菌株及其耐药基因。因此,探明关键控制点、寻求有效缓解抗生素耐药性的防控策略至关重要。文中介绍了我国嗜水气单胞菌的耐药现状,嗜水气单胞菌的主要侵染及耐药机制,以及目前削减和防控耐药性的主要手段和策略,并对水产品耐药性研究方向和重点作出展望。     

嗜水气单胞菌毒力基因的研究进展

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)隶属于气单胞菌科(Aermonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas),为人、畜及水生动物共患的条件致病菌。该菌广泛存在于水环境中,是多种水产动物的主要致病菌。国内外学者对其进行了许多研究,现普遍认为嗜水气单胞菌的致病性与其产生的毒素密切相关。随着分子生物技术的发展,已有许多学者从分子水平上对嗜水气单胞菌进行了研究,为阐明嗜水气单胞菌的致病机理提供了一些理论依据,并建立起针对几种主要毒力因子的检测手段。本文将嗜水气单胞菌目前的研究策略、部分主要毒力因子及其检测手段作一综述,以期为嗜水气单胞菌致病机理的研究及嗜水气单胞菌病的防治提供参考和借鉴。       

嗜水气单胞菌致病性研究进展

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,AH)是我国养殖鱼类的重要病原,对其侵袭机制和毒力因子的研究有重要的意义。本文对嗜水气单胞菌的生物学特性、致病机制、毒力因子及其防治措施进行了综述。     

嗜水气单胞菌毒力基因在传代过程中的稳定性研究

为了解嗜水气单胞菌毒力基因在传代过程中的稳定性,对传代前后嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,A.hydrophila)的毒力和毒力基因进行测定和检测.采用急性毒性试验方法测定10株嗜水气单胞菌原代、第10代及第20代的菌株对异育银鲫(Carassais auratus gibebio)的半数致死量,通过聚合酶链式反应(PCR)检测原代、第10代及第20代的菌株中5种毒力基因aerA、hlyA、ahpA、altA及ast的变化情况.试验结果表明,嗜水气单胞菌在传代过程中毒力基因分布相对较稳定.但是ahpA基因极易发生变异,在培养基上连续多次传代后,毒力逐渐减弱甚至消失.可推知,ahpA基因与毒力相关性最大,并易受传代影响.     

嗜水气单胞菌zntR调控的生理功能及其机制研究

【目的】ZntR是一种金属调控蛋白,可催化锌外排基因的转录激活,防止细胞内二价Zn离子过量,但其对细菌生理功能的影响目前尚不清楚。【方法】本研究构建了嗜水气单胞菌ATCC7966(Aeromonas hydrophila,A.h)的zntR缺失株及补救株,对菌株的生物被膜形成能力、溶血活性、运动能力和响应金属离子胁迫等生理表型进行评估。【结果】敲除zntR基因的菌株对锌和铬离子胁迫敏感、对钴离子胁迫耐受,并且生物被膜形成能力下降、运动能力增强,这些表型在其补救菌株中均能得到恢复。进一步利用DIA定量蛋白质组学技术比较野生株和zntR缺失株的蛋白表达差异,发现ZntR还可能参与双组分系统、细菌的趋化性等代谢通路的调控。【结论】该研究结果可为今后深入探讨zntR转录因子参与细菌生理功能的调控机制提供理论依据。     

嗜水气单胞菌ntrC调控的生理功能及其机制研究

[目的] NtrC是一种与DNA结合的转录调控因子,在激活氮同化基因的转录和维持氮源供应中具有重要作用,本研究拟探究其对嗜水气单胞菌生理功能的影响及其作用机理。[方法] 本研究采用同源重组方法构建了嗜水气单胞菌ATCC 7966 ntrC的缺失株,并以野生株为对照,对缺失株的生理表型进行测定和分析,利用定量蛋白质组学技术比较野生株和ntrC缺失株的蛋白表达差异。[结果] 发现敲除ntrC基因后,嗜水气单胞菌在缺氮、渗透压、重金属离子、氧化以及不同抗生素胁迫下的耐受性都发生显著变化,且这些表型在其补救菌株中均能得到恢复。定量蛋白质组学分析发现,野生株和ntrC缺失株的差异表达蛋白可能参与氨基酸生物合成、抗坏血酸和醛糖酸盐等代谢通路的调控。[结论] 本研究阐明了ntrC在嗜水气单胞菌中的重要作用及其对细菌生物学功能的影响,探讨了ntrC直接或间接调控的蛋白与生理表型之间的联系,研究结果可为未来水产致病菌的防治提供理论支持。     

嗜水气单胞菌菌落多重PCR方法的建立及应用

[背景]嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对水产动物、畜禽和人类均有致病性.基因表达的溶血素、气溶素和肠毒素是重要毒力因子,在致病性嗜水气单胞菌早期检测及防治中尤为重要.目前采用菌落直接提取DNA用于多重PCR研究的相关报道较少.[目的]基于菌落PCR方法建立针对嗜水气单胞菌溶血性基因、肠毒素基因...     

黄芩苷对嗜水气单胞菌生物膜形成的影响及体内外的抑菌作用

[目的]探讨中药单体黄芩苷对嗜水气单胞菌在体内外生长及生物膜形成的影响.[方法]体外实验中,利用牛津杯法检测抑菌圈直径,结晶紫法检测生物膜的形成,通过泳动实验检测黄芩苷对嗜水气单胞菌运动性的影响,紫外吸收法检测细胞膜完整性,用透射电镜技术观察黄芩苷对细菌形态的影响.体内实验利用草鱼为对象检测黄芩苷对嗜水气单胞菌增殖的影...     

嗜水气单胞菌中转录因子AHA_1581对细菌生理功能调控机制的研究

[目的] LuxR家族转录因子能够抑制或刺激不同功能类型基因的表达,来维持细胞功能的稳定性。嗜水气单胞菌是水产养殖中重要的致病菌之一,目前对该菌中的LuxR家族转录因子功能的研究还较少。[方法] 本研究利用含有sacB标记的自杀载体pRE112和同源重组技术敲除LuxR家族转录因子AHA_1581基因。[结果] 生理表型测定结果发现,ΔAHA_1581的运动与胞外蛋白的酶活增强、生物被膜形成能力降低,且耐受低温、卡那霉素、庆大霉素胁迫,但是对K₂Cr₂O₇更加敏感。进一步对野生型Ah和ΔAHA_1581的定量蛋白质组学分析,共鉴定到2654个蛋白,其中59个蛋白下调表达,142个蛋白上调表达。生物信息学分析表明AHA_1581参与调控双组分调节系统、丙酮酸代谢、碳代谢、TCA循环等细菌重要生理过程,以及细菌耐药基因和毒力因子的差异表达。[结论] 了解AHA_1581基因在调控细菌毒力以及生物过程中所起的重要作用,对预防和控制嗜水气单胞菌引起疾病的发生和传播可能具有重要的科学意义。     

连翘提取物对嗜水气单胞菌群体感应系统的影响

【背景】传统抑菌剂的大量使用导致细菌产生多重耐药性与抗性,而基于细菌群体感应靶点调控的新型抑菌剂可缓解细菌耐药性与抗性,是未来抑菌剂的发展方向之一。【目的】研究连翘(Forsythiasuspensa)提取物对嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)群体感应系统的影响及可能的作用机制,为新型抑菌剂的开发提供理论依据。【方法】以紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)CV026为报告菌株,以嗜水气单胞菌为供试菌株,采用倍比稀释法测定连翘提取物对2种菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),通过微量法测定提取物对嗜水气单胞菌生长、群集运动及蛋白酶活性的影响,利用高效液相色谱串联质谱法分析提取物中的主要成分,采用分子对接模拟探究提取物对嗜水气单胞菌群体感应系统的作用机制。【结果】连翘提取物对紫色杆菌CV026和嗜水气单胞菌的MIC均为16.00mg/mL。在亚抑菌浓度下,连翘提取物处理显著抑制了CV026紫色菌素的产生,最大抑制率高达56.30%。经8.00mg/mL连翘提取物处理后,嗜水气单胞菌的群集运...     

抑制嗜水气单胞菌乳酸菌的筛选、鉴定及抑菌作用

从健康成年尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）肠道中分离纯化得到乳酸菌,采用牛津杯双层平板法筛选具有抑制嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)活性的乳酸菌菌株,借助16S rRNA分子鉴定乳酸菌种类。通过排除有机酸和过氧化氢干扰及蛋白酶敏感性等试验分析抑菌活性最佳乳酸菌的抑菌活性物质成分,并进行热、酸碱稳定性和扫描电镜观察等确定抑菌活性物质对嗜水气单胞菌的抑菌作用。结果显示,尼罗罗非鱼肠道中有3株乳酸菌对嗜水气单胞菌表现出良好的抑菌效果,经鉴定后分别为植物乳酸菌（Lactobacillus plantarum）和唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）。其中,菌株LX3的抑菌活性最佳,抑菌圈直径可达到（25.25±0.23） mm且对多种蛋白酶敏感,经不同温度和酸碱性处理后抑菌活性物质仍保持较高的抑菌活性,特别是在pH 12和100 ℃处理后,抑菌圈直径仍达到（13.87±0.12）和（16.65±0.26） mm。此外,扫描电镜观察发现菌株LX3抑菌活性物质主要破坏了嗜水气单胞菌的细胞结构,使细胞内容物流出,致其死亡。上述结果表明,尼罗罗非鱼肠道中拥有较为丰富的抑制嗜水气单胞菌乳酸菌资源,尤其是菌株LX3显示出良好的抑菌活性与抑菌作用,这对于替代抗生素防治嗜水气单胞菌引发的相关鱼类疾病具有重要价值。     

大黄醇提物对嗜水气单胞菌抑菌活性及其机制

研究大黄醇提物对嗜水气单胞菌的抑菌活性及机制。主要采用牛津杯法和液体倍比稀释法;通过扫描电镜、SDS-PAGE、二维电泳及串联质谱等方法探讨大黄醇提物对嗜水气单胞菌的抑菌机制。结果显示,大黄醇提取物对嗜水气单胞菌有明显的抑制效果,抑菌圈为(24.5±0.2)mm,MIC和MBC均为3.91 mg/m L;在药物作用下,菌体表面变粗糙,细胞膜受损并出现破裂;在经药物处理4 h后,细菌蛋白含量明显下降(P0.05),2-DE电泳发现3个差异性蛋白。结果表明,大黄醇提物对嗜水气单胞菌的抑制作用机制是破坏其细胞膜结构及影响特定蛋白的表达。     

Formation of viable but non-culturable state (VBNC) of Aeromonas hydrophila and its virulence in goldfish, Carassius auratus

In this study we investigated the viable but non-culturable (VBNC) state of Aeromonas hydrophila and its virulence in goldfish. Aeromonas hydrophila cultured in a 0.35% NaCl solution at pH 7.5 and at 25 °C for 50 days showed the VBNC state. In the VBNC state we were unable to detect viable bacteria by the plate count method but we did find 10⁴ cells/ml by the direct viable count microscopical method after staining with fluorescein diacetate and ethidium bromide. The virulence comparison in goldfish showed that bacteria cultured at 25 °C for 1 day in a 0.35% NaCl solution were more virulent than bacteria cultured for 28 days. VBNC bacteria showed lower virulence in goldfish compared to 28-day-cultured bacteria by intraperitoneal injection.The results from the study suggest that A. hydrophila can remain in the aquatic environment for prolonged periods in the VBNC state but those cells are not pathogenic to goldfish.     

Antagonism of Aeromonas hydrophila by propolis and its effect on the performance of Nile tilapia, Oreochromis niloticus

Propolis, a resinous substance collected by Apis mellifera bees from various plant sources and mixed with secreted beeswax, is a multifunctional material used by bees in the construction, maintenance, and protection of their hives. The collected propolis sample, from High Egypt, was dark-green with olive-odor. The minimal inhibition concentration (MIC) of propolis-ethanolic-extract, against Aeromonas hydrophila, was 80 μg Propolis-ethanolic-extract and crude propolis (1%) were added to artificial basal diet with (30% crude protein) to evaluate their efficacy on the fish growth-performance, immunostimulation and resistance to A. hydrophila. Two hundred and twenty-five Oreochromis niloticus (8 ± 0.45 g/fish) were divided into three equal treatments (T) of triplet replicates. The fish of T₁ were fed on basal diet (control). The fish of T₂ were given the basal diet, containing propolis-ethanolic-extract. The fish of T₃ were given the basal diet containing crude propolis for 28 day. The fish were intraperitoneally challenged by A. hydrophila (0.2 × 10⁷ cells ml⁻¹) at the end of the feeding period and kept for 15 more days.The best growth rate and feed conversion ratio were obtained with T_2. The increase in the average daily gain, specific growth rate and feed efficiency ratio were highly significances in T₂ followed by T₃ when compared with the control group. The HCT-level and monocyte-counts were increased (T₂). No significant change, in the large lymphocytic-count was found among the three treatments (28–27–28%), while the neutrophil-count was significantly decreased (7%) with T₂ and increased (13.11%) with the control. A significant increase in serum lysozyme and serum bactericidal activities was found with T₂. The RLP against A. hydrophila was high with T₂ and T₃.The propolis-ethanolic-extract enhanced the growth, immunity and resistance of O. niloticus against A. hydrophila more than the crude propolis.