携带EB病毒潜伏膜蛋白基因转基因小鼠的制备

EB病毒潜伏膜蛋白(LMP)具有致癌活性,构建含金属硫蛋白基因-1(MT-1)调控区和LMP基因的pBR322-MT-LMP质粒,用显微注射法将MT-LMP转基因接种于小鼠受精卵内制备转基因小鼠的动物模型.结果:a.注射后卵的存活率和仔鼠出生率分别为73%和13%;b.转基因鼠尾部组织DNA分析,PCR法证明二只小鼠有LMP基因扩增带,Southern杂交亦显示PCR阳性鼠有特异的LMP杂交信号,这说明LMP基因已整合于鼠基因组,整合率为8%.结果说明,构建携带LMP基因的转基因动物模型已成功.     

心脏特异性高表达hAPE1基因小鼠的构建与鉴定

本研究拟建立心脏特异性表达hAPE1转基因小鼠,为研究hAPE1基因功能及其突变与心脏发育和心血管疾病的关系提供工具动物。将人APE1(human APE1,hAPE1)基因插入到心脏特异性启动子α-肌球蛋白重链(α-MHC)下游,构建了心肌细胞特异性表达hAPE1的转基因表达载体,显微注射法导入C57BL/6J小鼠受精卵中,经胚胎移植获得转基因首建者小鼠,建立hAPE1转基因小鼠,PCR鉴定转基因小鼠基因型,Western blotting鉴定h APE1蛋白在心脏中的表达并筛选高表达的转基因品系。研究表明,将含有心肌细胞特异性α-MHC启动子和hAPE1基因的转基因载体进行显微注射于小鼠胚胎中,接着将胚胎移植入假孕母鼠的输卵管中发育,建立了心脏组织特异性高表达hAPE1转基因小鼠品系,获得子代小鼠40只。PCR检测发现有15只小鼠在其基因组上整合有hAPE1基因,Western blotting检测hAPE1在这些小鼠心脏中高度特异性表达。本研究成功获得了在小鼠心肌细胞中特异性表达hAPE1的转基因小鼠,为研究基因在心脏发育与相关疾病中的功能提供了有利的工具。     

携带绿色荧光报告基因的EBV-LMP1真核表达载体构建与鼻咽癌细胞中的表达

潜伏膜蛋白1(LMP1)是由EB病毒编码的致瘤蛋白,众多研究表明LMP1蛋白可通过NF-κB、p38 MAPK、c-JNK等多条重要信号通路引起鼻咽癌细胞的生物学行为改变。我们从EB病毒阳性的B95-8狨猴淋巴瘤细胞中克隆EB病毒LMP1 c DNA,构建携带绿色荧光基因的真核表达质粒p IRES2-Zs-Green1-LMP1,通过脂质体转染的方法将质粒导入鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2中,利用质粒所携带的绿色荧光蛋白表达粗略计算转染的效率,通过免疫细胞化学(ICC)、RT-PCR、Western-Blot检测该质粒的表达。本实验室所构建的p IRES2-Zs-Green1-LMP1表达质粒能在鼻咽癌细胞内表达LMP1蛋白,为后续的实验研究奠定基础。     

MTA1转基因小鼠的构建及鉴定

目的将人的MTAl外源基因整合到C57BL／6J小鼠中,构建稳定高表达MTAl的小鼠模型。方法通过RT—PCR方法克隆人的MTAl编码序列,将MTAl插入真核表达载体pcDNA3．1构建pcDNA3．1-MTAl载体,回收片段后利用显微注射技术将目的基因片段注入到受精卵的雄原核中,使用MTAl特异性的引物经PCR鉴定出基因型阳性的转基因小鼠,再利用Western—blot及免疫组化方法检测MTAl在转基因小鼠全身级织表达情况。结果成功构建了MTAl转基因注射片段。在320枚显微注射受精卵中挑选出300枚存活卵移植到10只ICR小鼠假孕受体的输卵管中,10只ICR小鼠均怀孕,移植成功率为100％,共生出子代鼠80只,经PCR检测其中共有9只整合了MTAl基因,整合率为11．25％。经PCR鉴定MTAl整合阳性的F1代小鼠,再经Western—blot和免疫组化分析检测MTAl表达水平在脑、肺、肝、肠等组织中表达明显增高,肾、骨骼肌表达无差异。结论成功构建了脑、肝、肺、结肠高表达MTAl的转基因小鼠,为进一步MTAl研究奠定了良好的研究模型。     

应用cDNA微阵列技术研究EB病毒LMP1介导的鼻咽癌中转移相关基因的表达

探讨EB病毒基因组编码的癌蛋白LMP1对鼻咽癌细胞中转移相关基因表达的影响.采用蛋白质印迹法检测在强力霉素(Dox)诱导下,鼻咽癌细胞系pTet-on-LMP1 HNE2(L7细胞)中LMP1表达的时效和量效关系.应用cDNA微阵列技术建立诱导性LMP1介导鼻咽癌细胞中转移相关基因差异表达谱;运用RT-PCR验证cDNA微阵列筛选差异基因表达的可靠性.与LMP1不表达的L7细胞比较,LMP1高表达的L7细胞中7个基因的表达显著上调,12个基因的表达显著下调.随机选择其中4个基因进行RT-PCR,结果显示,这些基因表达阳性,且与微阵列中的变化趋势一致.LMP1可能通过激活和/或抑制一些转移相关基因的表达而参与鼻咽癌转移过程.     

Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白转基因小鼠的建立

目的:建立Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)的转基因小鼠。方法:用分子克隆的方法构建包括肺表面活性蛋白A(SP-A)启动子、SARS-CoVN蛋白基因、β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因和人生长激素(hGH)polyA的转基因载体pSP-A-N。以显微注射的方法将8.3kb的转基因片段引入小鼠受精卵。通过PCR、Southern印迹和LacZ染色检测子代小鼠中转基因的整合及表达。结果:共注射952枚受精卵,移植至42只假孕母小鼠的输卵管中发育,获得子代小鼠128只,经PCR、Southern印迹鉴定,其中11只小鼠基因组上整合有SARS-CoVN蛋白基因,整合率为8.6%。鉴定结果显示,11只转基因首建者小鼠中有1只表达外源基因并能正常传代。LacZ染色结果表明N蛋白基因在转基因小鼠Ⅱ型肺上皮细胞中特异表达。结论:成功构建了Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS-CoVN蛋白的转基因小鼠,为深入研究该基因的病理生理学效应奠定了基础。     

钙蛋白酶抑制蛋白转基因小鼠的构建和鉴定

目的：将人的钙蛋白酶抑制蛋白（ calpastatin, CAST）外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建高表达CAST的转基因小鼠模型。方法利用Gateway技术构建pRP．EX3d-EF1A-CAST-IRES-eGFP载体,回收片段后通过显微注射法将目的基因片段注入到C57 BL/6 J小鼠受精卵中,将其胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内获得子代小鼠。采用PCR方法鉴定出阳性的转基因小鼠,确定首建鼠,通过与C57BL/6J小鼠回交后互交数代建系。利用RT-PCR和Western blotting方法检测CAST基因和蛋白在各组织中的表达情况。结果将90枚注射受精卵移植到3只假孕鼠中,3只均怀孕,移植成功率100％,产下23只子鼠,经PCR鉴定得到2只转基因阳性首建鼠,阳性率为9％。子代小鼠进行RT-PCR检查显示,CAST基因在转基因小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌中均有表达;Western blotting检查显示,CAST蛋白表达在转基因小鼠中显著高于同窝阴性小鼠。结论通过显微注射法成功构建CAST高表达的转基因小鼠,为进一步研究CAST奠定了良好的模型基础。     

山羊β—酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子Ⅸ

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子Ⅸ（human clotting factor Ⅸ,hFⅨ)的可行性,构建了包括山羊β-酪蛋白基因启动子和外显子1、内含子1、外显孔子2共约6.7kb片段以及hFLX全长cDNA序列和部分经改造的内含子1的乳腺表达载体,通过转基因技术获得12个原代转基因小鼠（9♂,3♀）,整合率为11.2%,经ELISA和Western blot鉴定8只转基因母鼠乳汁中有hFⅨ的表达并拥有很高的凝血活性,其中一只的表达量高达52.9mg/L,其凝血活性亦高达279.2%,FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合小鼠的不同染色体上,结果证明所构建的山羊β-酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFⅨ基因在小鼠乳腺中高效表达,并能保持hFⅨ的生物活性。     

SND1转基因小鼠的构建

目的:构建 SND1 过表达的转基因小鼠模型。方法:利用对小鼠 SND1 基因转录本构建 SND1 过表达载体pInsulator-CAG-3×FLAG-SND1,利用受精卵原核注射技术,将外源线性pInsulator-CAG-3×FLAG-SND1转基因载体注射到受精卵细胞核内,将存活受精卵进行胚胎移植制备 SND1 转基因小鼠,用PCR、RT-PCR技术鉴定转基因小鼠是否构建成功。结果:成功构建过表达 SND1 基因的转基因小鼠模型,为进一步研究 SND1 基因在动物体内的生物学功能奠定基础。     

山羊β-酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子IX

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子IX(human clotting factor IX,hFIX)的可行性,构建了包括山羊β-酪蛋白基因启动子和外显子l、内含子1、外显子2共约6.7kb片段以及hFIX全长cDNA序列和部分经改造的内含子l的乳腺表达载体,通过转基因技术获得12个原代转基因小鼠(9♀,3♂),整合率为11.2%.经EuSA和western b1ot鉴定8只转基因母鼠乳汁中有hFIX的表达并拥有很高的凝血活性,其中一只的表达量高达52.9mg/L,其凝血活性亦高达279.2%.FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合于小鼠的不同染色体上.结果证明所构建的山羊β-酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFIX基因在小鼠乳腺中高效表达,并能保持hFIX的生物活性.     

上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2转基因猪胚胎成纤维细胞的构建与鉴定

目的 构建上皮组织特异性表达鼻咽癌来源潜伏膜蛋白1（N-LMP1）和人补体受体2（CR2）真核表达载体,转染猪胚胎成纤维细胞并筛选整合有N-LMP1和CR2基因的细胞克隆,为构建与EBV感染相关的猪鼻咽癌模型奠定基础.方法 通过直接合成ED-L2启动子和N-LMP1,从人B淋巴细胞中的RNA经RT-PCR扩增出CR2,将上述3个片段逐个连接到真核表达载体pN1上,构建上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2的载体pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2;用脂质体转染猪胚胎成纤维细胞,经药物G418 筛选和PCR鉴定阳性克隆.结果 成功构建上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2的真核表达载体pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2,并成功整合到猪胚胎成纤维细胞的基因组中,获得了整合有目的 基因N-LMP1和CR2的猪胚胎成纤维细胞克隆.结论 获得了上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2 的猪胚胎成纤维细胞克隆,为通过细胞核移植方法获得表达N-LMP1和CR2转基因猪提供了供体细胞.     

A simplified tumour model established via Epstein-Barr virus-encoded, nasopharyngeal carcinoma-derived oncogene latent membrane protein 1 in immunocompetent mice

The expression and immune modulation of Epstein-Barr virus-encoded oncogene latent membrane protein 1 (N-LMP1) is essential in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma. In previous studies, cell transformation has been induced by the expression of EBV-encoded N-LMP1 in non-tumour BALB/c-3T3 cells and these cells have then been used to form tumours in T-cell-deficient nude mice. However, studies using this model have been limited by the lack of a competent immune system. To facilitate the study of immune components in N-LMP1-driven oncogenesis, we herein developed a simplified N-LMP1-derived tumour model in immunocompetent mice. Cell transformation was induced by the expression of N-LMP1 in BALB/c-3T3 cells, and these transformants were used to induce oncogenesis in BALB/c mice. In contrast to the 100% successful tumour-induction rate in nude mice treated with monodispersed transformed cells, the tumour incidence in BALB/c mice was only 5-36%. However, the transplantation of tumour fragments into BALB/c mice yielded a reproducible tumour-induction rate of >85%, which is acceptable for most of the research needs. This novel model of N-LMP1-directed oncogenesis in an immunocompetent environment may serve as an important platform for the future assessment of N-LMP1-targeted tumour therapies.     

脂肪细胞因子 CTRP4转基因鼠的构建与鉴定

目的：建立人CTRP4基因的转基因小鼠,为脂肪细胞因子CTRP4的体内功能研究奠定基础。方法首先构建人CTRP4的转基因小鼠线性化表达载体,再利用显微注射的方法将载体注射入小鼠受精卵,从而构建人CTRP4的首建鼠（ Founder ）并与野生型小鼠交配繁殖得到F1代阳性小鼠,再通过近亲繁殖与测交的方法,得到CTRP4转基因纯合子小鼠,并通过PCR和western blot 的方法对纯合子小鼠进行鉴定。结果得到人CTRP4转基因小鼠纯合子小鼠两个品系,western blot鉴定该转基因小鼠心脏,肝脏,脑,肾脏等多种组织中均呈现CTRP4高表达。结论成功构建了人CTRP4转基因小鼠纯合子小鼠。     

高表达人源SP15对小鼠生长和生殖的影响

目的:探究高表达人源SP15对小鼠生长和生殖的影响,为研究NYD-SP15在生物体中的功能提供动物模型。方法:将人源NYD-SP15 cDNA以及Cre序列插入PCAG启动子下游,构建NYD-SP15转基因表达载体,并通过原核注射,构建全身性表达NYD-SP15的转基因小鼠;将获得的NYD-SP15转基因小鼠与C57/BL6小鼠交配,PCR鉴定转基因小鼠是否有Cre插入,筛选出人源NYD-SP15表达的小鼠,统计转基因小鼠体重变化和后代阳性情况。结果:通过PCR鉴定及公司测序验证,我们成功构建了NYD-SP15转基因过表达载体。并通过PCR鉴定小鼠基因型,筛选出可以表达人NYD-SP15的转基因小鼠。比较转基因小鼠与同窝野生型小鼠体重,发现转基因小鼠体重与同窝野生型小鼠相比无明显区别,说明在体内过表达NYD-SP15对小鼠体重无明显影响。通过对后代阳性小鼠出生情况统计发现F2代阳性小鼠出生率较F1代明显降低。结论:人源NYD-SP15在小鼠体内能正常表达,对其生长无明显影响,但其后代阳性出生率呈逐代下降趋势,推测该原因可能与NYD-SP15在睾丸中表达有关。     

时空表达可控的转基因动物模型调控体系的研究

目的在血管内皮细胞建立时空表达可控的转基因动物模型调控体系。方法培育两个配套的转基因动物品系,利用组织专一性启动子确保转基因表达的空间专一性,利用四环素诱导系统对转基因表达在时间上实施调控。结果将血管内皮细胞特异性表达的VE cadherin基因启动子与人工融合的转录因子tTA基因连接,建立转基因小鼠品系VE cadherin:tTA;将tetoperon的启动子与myrAkt1连接,建立转基因小鼠品系TET:myrAkt1。两系鼠杂交的子代,筛选的阳性纯合子,能可控性地在血管内皮细胞特异性表达目的基因Akt1PKB。结论利用VE cadherin基因启动子和tet off诱导表达系统,可以达到在时间上和空间上都能人为控制目的基因在血管内皮细胞上特异性表达的目的。     

转基因小鼠乳腺表达G-CSF的研究

用PCR法从正常中国人脐带血提取总DNA作为模板,扩增出1.5 kb的人G-CSF基因组基因。序列分析证实其正确性。将其插入小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的起始密码子ATG前的KpnⅠ位点,使其受控于2.6kb的WAP调控序列,构建成乳腺表达载体pWGG。回收经EcoRⅠ酶切后的8.7kb片段用于显微注射。共注射1200枚受精卵,移植34受体母鼠,产仔鼠85只。经PCR检测和DNA印迹分析,证实获得两只整合有人G-CSF基因的雄性鼠,整合率为2.37％。建立的转基因鼠系表明,采用ELASA方法对F1代雌鼠乳汁检测,成功地表达出人G-CSF。表达量为120～250ng/ml。这一结果表明转基因的表达具有乳腺特异性。这为在大动物中实施转基因提供了依据。     

人载脂蛋白A1基因转基因小鼠的建立

目的建立系统性表达人载脂蛋白A1(APOA1)基因的转基因小鼠。方法 将人APOA1基因插入系统性表达启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立人APOA1转基因C57BL/6J小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平,血生化分析检测不同月龄转基因小鼠与同龄野生型小鼠的血脂指标。结果建立了2个不同表达水平的人APOA1基因的转基因小鼠品系;转入的人APOA1基因在血液、肝脏、心脏、肾脏、脾脏、血管组织中均有明显表达;血生化分析结果显示不同月龄转基因小鼠的血浆高密度脂蛋白胆固醇水平高于同龄的野生型小鼠,甘油三酯水平低于同龄野生型小鼠。结论成功建立了系统性表达人APOA1基因的转基因小鼠,为研究高血脂以及高血脂相关的心血管病提供了工具。     

心脏特异性表达KCNQ1^（V180L）转基因小鼠的建立及表型分析

目的建立心脏特异性表达KCNQ1^V180 L转基因小鼠,为研究KCNQ1基因功能及其突变与心律失常性心脏疾病的关系提供工具动物。方法把KCNQ1^V180 L基因插入α-MHC启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6J KCNQ1^V180 L转基因小鼠,PCR鉴定转基因小鼠的基因型,采用Western Blot鉴定KCNQ1^V180 L在心脏组织中的表达,记录转基因小鼠死亡情况,超声分析转基因小鼠心脏结构形态和功能改变,心电分析转基因小鼠心肌电生理变化。结果建立了2个心脏组织特异性表达KCNQ1^V180 L转基因小鼠品系。转基因小鼠离乳前即出现猝死;超声检查显示转基因小鼠左心室内径变短,心室壁变厚,短轴缩短率增加;心电分析显示其心室复极异常。结论 KCNQ1^V180 L转基因小鼠具有临床长QT综合征类似的病理改变,可作为研究KCNQ1基因功能及其突变与心律失常发病机制的疾病动物模型。