重组人IL-1ra在大肠杆菌中的可溶性表达

利用PCR技术从含有IL-1ra的质粒上扩增IL-1ra基因,经过序列测定后插入表达载体pTIG-Trx,并转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。经SDS-PAGE分析显示,IL-1ra表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达产物出现相对分子量大约为17000的一条新生蛋白质带,其大小与预期结果一致,经Western和ELISA分析,证明该带即为目的蛋白,SDS-PAGE显示目的蛋白全部以可溶性蛋白的形式存在。超声破碎后,上清经金属螯和层析纯化获得纯度约为98％的蛋白样品。     

IL-1β的基因克隆及在原核中的表达

从人外周血中分离出白细胞,提取其总RNA,根据文献报道的IL－1β的核苷酸序列合成5’和3’端引物,用RT－PCR的方法获得了IL－1β的基因cDNA,并在大肠肝菌中获得了高效表达,表达量占全菌的40％,并对表达产物进行了分离纯化和活性分析,获得了纯度大于98％的样品,该样品表现出明显的生物学活性。     

人白细胞介素1受体拮抗剂cDNA克隆及其表达影响因素

采用ＰＣＲ技术成功地从人胎盘ｃＤＮＡ文库中扩增出人白细胞介素１受体拮抗剂（ｈＩＬ １ｒａ）成熟蛋白编码区基因,并以此为模板突变其ｃＤＮＡ５;其克隆产物经物理图谱证实与文献报道完全一致,利用含不同ＳＤ的同一表达质粒分别表达含不同５的ｃＤＮＡ,结合文献分析其表达影响因素,同时对ｈＩＬ １ｒａＥ．ｃｏｌｉ表达产物的可能存在形式进行了推论。     

巨桉EgrWAT1基因克隆和功能初步分析

为探究WALLS ARE THIN (WAT1)在木本植物中木材形成以及响应胁迫中的作用,利用生物信息学工具进行分析,并以巨桉（Eucalyptus grandis）为材料克隆EgrWAT1S及其另一转录本EgrWAT1L,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)探究其在不同组织、节间以及响应胁迫时的表达模式。结果表明：EgrWAT1S在韧皮部表达量较高,而EgrWAT1L主要表达在根部。在茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）处理和盐胁迫以及缺磷、缺硼处理时,其表达存在着明显不同的模式,在MeJA、SA处理时甚至存在着相反的表达模式。这些结果表明EgrWAT1L基因可能通过转录调控来影响EgrWAT1S表达和进一步的蛋白翻译来响应激素和胁迫处理。为进一步研究WAT1基因在巨桉生长发育过程中的作用和调控方式提供基础,也为将来桉树的分子育种提供可能。     

差减抑制杂交技术在植物研究中的应用

差减抑制杂交技术在医学研究中应用较多,而在植物研究中的应用较少,近几年有所增加。本文介绍了目前差减抑制杂交技术在植物发育、逆境胁迫或人为诱导条件下差异基因表达以及不同组织中差异基因表达和突变等研究方面的应用。随着研究的不断深入,差减抑制杂交技术将在植物新基因的发现和克隆中发挥更大作用。     

地榆鞣质对环磷酰胺致小鼠骨髓抑制的保护作用研究

为了观察地榆鞣质对骨髓抑制的保护作用,本文采用腹腔注射环磷酰胺致小鼠骨髓抑制模型。造模成功后,将骨髓抑制小鼠按体重随机分为:模型组、集落刺激因子组、地榆鞣质20、10、5 mg/kg三个剂量组,另设正常对照组。连续灌胃10 d,每天一次,以外周血液白细胞数量、骨髓细胞DNA含量和CD34+的表达以及骨髓细胞O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)蛋白的表达为评价指标,研究地榆鞣质对CTX所致骨髓抑制的治疗作用。结果显示地榆鞣质可显著升高小鼠外周血WBC(P0.05);显著升高小鼠骨髓DNA含量(P0.05);显著促进CD34+的表达(P0.05);显著促进MGMT蛋白的表达(P0.05)。通过本研究可以看出地榆鞣质可显著拮抗CTX所致小鼠骨髓抑制。     

HSV转基因表达IL-1ra抑制P77PMC大鼠的惊厥发作

利用PCR基因克隆及基因转染技术 ,构建含人IL 1ra(IL 1receptorantago nist,IL 1ra)cDNA的质粒型单纯疱疹病毒 (herpessimplexvirus ,HSV)载体 ,再由HSV 1tsK株包装成假病毒颗粒 ,然后注入P77PMC听源性惊厥易感大鼠侧脑室 ,观察LacZ基因和IL 1ra在脑内的表达情况及对P77PMC大鼠惊厥程度的影响 .结果表明 :( 1 )LacZ在脑内神经和非神经细胞可持续表达 8周以上 ;( 2 )侧脑室注射pHSV IL 1ra假病毒可明显抑制P77PMC大鼠的惊厥发作 .原位杂交和免疫荧光染色发现脑膜和脉络丛上皮细胞及某些神经细胞有IL 1ramRNA和蛋白的表达 .结果表明HSV载体可有效地将IL 1ra基因转入脑内 ,并能明显抑制P77PMC听源性惊厥易感大鼠的惊厥发作 .     

红景天苷对骨髓抑制贫血小鼠造血祖细胞增殖的影响

采用造血祖细胞培养技术,观察红景灭苷体内给药和细胞培养直接用药对骨髓抑制贫血小鼠造血祖细胞增殖和骨髓有核细胞数目的影响.结果显示,体内用药能显著增加BMC数目,促进BFU-E、CFU-E、CFU-GM和CFU-Meg集落形成(P<0.05);在一定浓度下,体外用药也能显著促进BFU-E、CFU-E、CFU-GM和CFU-Meg集落形成(P<0.05).结果提示,红景天苷可能通过间接或直接作用刺激骨髓抑制贫血小鼠造血祖细胞的增殖来促进造血功能的恢复.     

拟南芥AtCDPK1基因克隆与转化马铃薯的研究

以野生拟南芥生态型(Col-0)为材料,利用PCR和DNA重组技术,克隆了拟南芥钙依赖蛋白激酶基因(AtCDPK1)。AtCDPK1基因全长为2 269bp,碱基序列与已知基因At1g18890完全一致。构建AtCDPK1基因的植物表达载体pCHF3-CDPK1,并利用农杆菌介导法将pCHF3-CDPK1转入马铃薯品种‘费乌瑞它’的脱毒试管微型薯中,经筛选与植株再生,共获得50个抗性再生植株。PCR检测显示,有36个植株基因组中含有AtCDPK1基因。RT-PCR分析证实,AtCDPK1基因在这些马铃薯植株的基因组中均能正常转录表达。这一结果为进一步开展AtCDPK1基因功能分析及转基因抗旱马铃薯新品种选育研究奠定了基础。     

小鼠Smad3基因的克隆及其在小鼠组织中的表达

采用PCR获得的Smad3cDNA片段作为探针筛选小鼠脑cDNA文库 .克隆了小鼠全长的Smad3基因 .对小鼠Smad3基因的全编码区进行了序列测定 .结果表明 ,小鼠SMAD3与人SMAD3氨基酸同源性高达 99% .与小鼠Smad2基因相比 ,碱基同源性高达 91 8% .Northern杂交显示 ,Smad3基因在小鼠胚胎发育和各成体器官中普遍表达 .原位杂交显示 ,Smad3基因表达在小鼠胚胎期E16 5d的软骨、骨髓和皮肤角质细胞中     

山药异淀粉酶基因克隆及其在淀粉代谢中的作用北大核心CSCD

为了明确异淀粉酶基因(ISA 3)在山药淀粉代谢中的作用,该研究以‘毕克齐’和‘大和长芋’山药为试验材料,测定了块茎中淀粉及组分含量和异淀粉酶活性等;采用RT-PCR技术克隆了ISA 3,并进行生物学分析及山药块茎不同膨大期和不同组织间ISA 3基因的表达等。结果表明:(1)山药‘大和长芋’的直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量均显著高于‘毕克齐’,且两品种的淀粉含量随生长发育的变化均呈先升高后降低的趋势,并均于种植后120 d时达到最高,但‘毕克齐’的异淀粉酶(ISA)活性在整个膨大期均高于‘大和长芋’。(2)成功克隆获得山药ISA 3开放阅读框长1584 bp,编码527个氨基酸;ISA3为亲水性蛋白。(3)不同品种块茎在膨大时期的ISA 3基因表达趋势不同,‘毕克齐’中呈先显著上调随后下调,而在‘大和长芋’中表达总体下调,且在山药的叶、茎和块茎中均有表达,存在明显的组织特异性。(4)ISA活性与山药淀粉及支链淀粉含量呈显著和极显著正相关关系,但ISA活性与ISA 3的表达量呈负相关关系。研究表明,异淀粉酶参与了山药块茎中淀粉的合成,且主要对支链淀粉的合成起关键作用,ISA 3基因的表达可能对异淀粉酶活性和淀粉的合成起负调控作用。     

小鼠Toll样受体3基因的克隆及真核表达

采用RT-PCR方法从小鼠巨噬细胞中克隆小鼠Toll样受体3(TLR3)基因,基因测序表明获得了小鼠全长TLR3cDNA,构建了真核表达质粒p3XFLAG-CMV-7.1-TLR3.重组质粒转染293T细胞,Western blotting检测蛋白表达,表达蛋白质的相对分子量与预计相符.采用TLR3的阳性刺激物poly(I∶C)刺激重组质粒转染的293T细胞,双荧光素酶报告基因系统检测发现能激活下游转录因子NF-κB的转录活性,并能诱导TLR3下游细胞因子IL-6和TNF-α的表达.小鼠TLR3基因的克隆和表达,为研究TLR3介导的信号通路及其在抗病毒免疫中的作用打下基础.     

人G—CSF基因组基因的克隆及其在转基因小鼠乳腺表达的研究

采用ＰＣＲ方法以正常中国人脐带血提取总ＤＮＡ为模板,扩增出１．５Ｋｂ的粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）基因组基因,序列分析证实其正确性,将其插入小鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的起支密码子ＡＴＧ臆的ＫｐｎＩ位点,使其受控于２．６ｋｂ的ＷＡＰ调控序列,从而构建乳腺表达载体ｐＷＧＧ。回收经ＥｃｏＲＩ酶切后的８．７ｋｂ片段用于显微注射,共注射１２００枚受精卵,移植至受体３４母鼠,产生仔鼠８５只,经ＰＣＲ检测     

cDNA RDA法克隆小鼠鼻咽部组织特异性表达基因

采用ｃＤＮＡ代表性差异分析法（ｃＤＮＡ ＲＤＡ）克隆小鼠鼻咽部组织特异性表达基因。通过三轮消减杂交后,获得了七个差异片段。随机选择两个差异片段ＴＤＰ１和ＴＤＰ４,经ＤＮＡ印迹和ＲＮＡ印迹证实了ＴＤＰ１在鼻咽部特异性表达,而ＴＤＰ４在鼻咽部及食道均有表达,并没有特异性。进一步对这两片段测序分析,并与Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ等数据库同源比较,推测ＴＤＰ１和ＴＤＰ４是两个新的基因片段,但是仅ＴＤＰ１在小鼠鼻咽部     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

小鼠Daintain/AIF-1 基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因 载体的构建

目的:对Daintain/AIF-1(大炎肽/同种异体移植炎症因子-1)基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法:提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果:PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1(pGL3-Basic-DT)载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论:Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

垂体腺苷酸环化酶激活肽基因的合成表达与活性研究

根据文献报道垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)的氨基酸序列,推导出其核苷酸序列并设计成部分互补的6条寡核苷酸片段,利用DNA合成仪人工合成、纯化这6条寡核苷酸片段,通过片段退火、连接、克隆及测序鉴定获得了PACAP基因.将PACAP基因克隆至pGEX-4T-3质粒中转化BL21进行表达分析,融合蛋白约占细胞总蛋白的30％,其中部分为可溶性,部分以包涵体形式存在.通过亲和层析纯化GST-PACAP融合蛋白,该蛋白质能促进PC12细胞轴突生长及脊髓神经元存活.     

垂体腺苷酸环化酶激活肽基因的合成表达与活性研究

根据文献报道垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)的氨基酸序列,推导出其核苷酸序列并设计成部分互补的6条寡核苷酸片段,利用DNA合成仪人工合成、纯化这6条寡核苷酸片段,通过片段退火、连接、克隆及测序鉴定获得了PACAP基因.将PACAP基因克隆至pGEX-4T-3质粒中转化BL21进行表达分析,融合蛋白约占细胞总蛋白的30％,其中部分为可溶性,部分以包涵体形式存在.通过亲和层析纯化GST-PACAP融合蛋白,该蛋白质能促进PC12细胞轴突生长及脊髓神经元存活.     

抑制性消减杂交技术（SSH）及其在基因克隆上的应用

简要概述了抑制性消减杂交技术的基本原理、基本过程、优越性、主要缺陷及其在基因克隆方面的应用进展。