葡萄WRKY18基因的克隆及表达特性分析

以抗性品种‘左优红’组培苗为材料,克隆得到WRKY18基因,测序结果显示:VvWRKY18基因片段大小为954 bp,编码317个氨基酸序列。生物信息学分析结果显示VvWRKY18蛋白分子量约为35.2416 k Da,等电点为8.22,不稳定系数为48.61,推测为不稳定蛋白;与已知的粳稻、高粱、毛果杨及拟南芥WRKY家族蛋白高度同源;亚细胞定位预测结果显示主要存在于细胞核中,属于第二类WRKY转录因子家族成员。实时荧光定量PCR分析显示,VvWRKY18在葡萄不同组织中均有表达,在花中表达量最高;多种逆境胁迫因子如盐、干旱和低温等诱导VvWRKY18上调表达,且在低温胁迫6 h时诱导表达量最高。另外,VvWRKY18受胁迫信号分子水杨酸、脱落酸、一氧化氮和过氧化氢诱导上调表达,且VvWRKY18在一氧化氮处理下的表达模式与低温诱导的类似,推测VvWRKY18可能通过调控一氧化氮信号分子代谢途径来调节葡萄对低温胁迫应答。     

葡萄病程相关蛋白1基因的克隆和表达分析

以葡萄品种‘左优红’组培苗叶片为材料,利用同源克隆法获得其病程相关蛋白1基因VvPR1的cDNA全长序列。扩增片段大小为486bp,编码161个氨基酸,分子量17.5kDa,等电点PI=8.69,含有6个保守半胱氨酸,4个allergenV5/Tpx-1related保守结构域。VvPR1与多种植物PR1高度同源。实时定量PCR检测结果表明VvPR1在葡萄叶片中相对表达量最高;霜霉病菌、低温、盐和干旱胁迫均可显著诱导其表达;水杨酸、脱落酸、茉莉酸、一氧化氮、过氧化氢和硫化氢等亦可诱导其大量表达,据此推测,VvPR1参与了多种生物胁迫和非生物胁迫过程。     

棉花GhMYB113基因的克隆与表达分析

该研究利用序列拼接并结合RT-PCR技术,从棉花叶片中克隆了1个MYB基因的cDNA序列,命名为GhMYB113。序列分析表明,该基因开放阅读框为738bp,编码246个氨基酸,含有2个MYB结构域,属R2R3-MYB类型转录因子。该基因的基因组序列长1 927bp,由3个外显子和2个内含子构成。氨基酸序列比对发现该蛋白与其他物种的MYB蛋白有较高的一致性。系统进化分析显示,棉花GhMYB113与现代杂交月季亲缘关系最近。qPCR分析发现,该基因在棉花根中优势表达,在干旱、高盐及低温胁迫后表达量均发生变化,推测GhMYB113可能在植物响应干旱、高盐及低温等非生物胁迫过程中起作用。     

水曲柳FmJAZ1基因在非生物胁迫中的响应模式和激素诱导表达分析

克隆FmJAZ1基因,明确其在低温和NaCl胁迫中的响应模式和激素诱导下的转录表达特性。通过基因克隆的方法得到水曲柳中的FmJAZ1基因,利用生物信息学软件对所得到的序列进行分析并构建系统进化树,对水曲柳FmJAZ1基因进行了时空表达特异性的分析,对根、茎、叶、芽、雄花、雌花、种子等7个部位以及在5-9月5个月份分别取样,对水曲柳进行低温(4℃)和盐胁迫(200 mmol/L NaCl)2种非生物胁迫处理以及脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、生长素(IAA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)等激素信号诱导处理,然后对试验材料进行荧光定量分析。克隆出全长为684 bp的核苷酸序列。生物信息学软件分析得到JZA1基因具有完整的开放阅读框,编码227个氨基酸,JAZ1蛋白不含有信号肽,不属于跨膜蛋白,为不稳定亲水性蛋白。时空表达结果显示,FmJAZ1基因在茎中表达量最高,且在8月份表达量最高;非生物胁迫结果表明低温处理后FmJAZ1在6h、24h表达量较高;而NaCl处理后,在24 h表达量较高,且该基因响应低温胁迫较NaCl胁迫迅速;激素信号诱导结果显示,处理后不同时间,基因表达量变化较为明显,其中GA3处理后3h最为明显,为对照组的77.3倍,分析了FmJAZ1基因在低温、NaCl胁迫和激素诱导下的表达模式。FmJAZ1基因充分响应了逆境胁迫和激素信号诱导,通过蛋白和基因层面对逆境进行响应,JAZ蛋白在其中起到了桥梁的作用,并扮演了重要的角色。     

葡萄F-box基因VvF-box5基因结构与表达分析

F-box蛋白广泛存在于真核生物中,主要参与细胞周期调控、凋亡及多种激素信号转导等过程;近几年发现,F-box蛋白还介导了植物对逆境胁迫的应答响应,对维持植物正常生长发育至关重要。干旱等非生物逆境胁迫严重影响了葡萄正常生长发育和果实品质,克隆并分析干旱响应基因对改良葡萄的抗性有重要意义。本研究根据葡萄干旱转录组分析结果,发现11个F-box基因在干旱胁迫下表达量明显上调;其中,VvF-box5基因位于葡萄第19条染色体上,对干旱胁迫的响应明显高于其他F-box成员;VvF-box5基因含有5个外显子和4个内含子,内含子均含有保守的GT…AG序列;VvF-box5基因包含1824 bp的开放阅读框,编码607个氨基酸,氨基酸序列的N端含有1个保守的F-box结构域,C端包含1个FBD和2个LRR结构域。启动子元件分析表明,VvF-box5基因含有多种逆境应答元件,包括GA响应元件GARE-motif、MeJA响应元件CGTCA-motif、干旱胁迫相关元件ERE、HSE和LTR、光应答顺式作用元件ACE、Box4和Sp1以及与细胞周期调节和发育相关的原件等。实时荧光定量PCR结果显示,在干旱、高盐、ABA和MeJA处理下,VvF-box5基因的表达量明显升高;亚细胞定位结果显示,VvF-box5蛋白主要定位于圆葱表皮细胞的细胞核中;VvF-box5的过表达明显提高了转基因拟南芥在干旱处理下的成活率。另外,本研究利用原核表达系统诱导6×His-VvF-box5融合蛋白的表达,并使用蛋白标记亲和层析柱纯化获得了6×His-VvF-box5融合蛋白,为下一步深入研究VvF-box5的功能鉴定基础。     

柠条锦鸡儿CkLEA1基因克隆及表达分析

植物受到逆境胁迫后,大量逆境响应基因会被诱导表达,LEA蛋白编码基因就是与植物抗旱、抗冷等非生物胁迫密切相关的一类基因.从已构建的柠条锦鸡儿干旱胁迫抑制性削减杂交文库中筛选到了一条LEA蛋白编码基因并进行了克隆.序列比对与系统进化分析显示该基因属于LEA3基因家族成员,命名为CkLEA1(GenBank登录号是KC309408).克隆得到该基因gDNA长469bp,包含两个外显子和一个内含子;cDNA长357bp,包含300bp的开放阅读框,推导编码99个氨基酸的蛋白质.利用荧光定量PCR技术对CkLEA1基因在各种逆境胁迫条件的表达情况进行初步研究表明,CkLEA1受干旱、ABA、冷、热、盐和碱等处理不同程度地诱导,推测其与柠条锦鸡儿响应逆境胁迫的机制有关.     

苎麻转录因子基因BnMYB3的克隆及表达分析

该研究采用RACE技术,从苎麻中克隆到1个MYB转录因子基因(BnMYB3)的全长cDNA序列(GenBank登录号为MF741320.1)。生物信息学分析表明,BnMYB3基因cDNA全长为1 216bp,包括900bp编码区序列,编码含有299个氨基酸的蛋白,其分子量约为33.63kD,理论等电点为9.16;该蛋白质含有2个典型的MYB结构域,属于R2R3-MYB。从苎麻基因组中克隆了BnMYB3基因1 681bp启动子序列,该序列包含ABRE、GARE-motif、CGTCA-motif和TGACG-motif等多个逆境相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,BnMYB3为组成型表达基因,在茎和叶中的表达量显著高于根;BnMYB3基因能够响应镉胁迫,且表达量随镉胁迫处理时间和处理浓度的增加而显著上升。     

黄花棘豆脱水素OoY_2K_4的鉴定及表达分析

该研究以黄花棘豆cDNA为模板,采用同源克隆法,从黄花棘豆转录组数据库中克隆获得1个响应逆境胁迫的胚胎发育晚期丰富蛋白基因,命名为OoY_2K_4;OoY_2K_4基因ORF为786bp,编码261个氨基酸,含有2个保守的Y片段和4个K片段,为典型的Y_2K_4类脱水蛋白亚家族成员;OoY_2K_4蛋白不具有跨膜结构域,不存在信号肽,亲水性极强,含有1个糖基化位点和17个磷酸化位点;亚细胞定位显示,OoY_2K_4蛋白定位于细胞质中。多序列比对发现,OoY_2K_4蛋白与其他物种第二组LEA蛋白(脱水素)序列高度保守;进化树分析显示,该序列与三叶草、蒺藜苜蓿和紫花苜蓿相似度最高,亲缘关系最近。采用qRT-PCR对OoY_2K_4基因在干旱、高盐、低温以及脱落酸、乙烯、赤霉素处理下的表达分析显示,干旱和高盐胁迫可显著诱导OoY_2K_4基因表达,而低温胁迫下基本无变化;激素处理均可诱导OoY_2K_4基因高效表达,其中脱落酸诱导下OoY_2K_4基因表达最显著。研究推测,OoY_2K_4基因可能通过依赖ABA的信号途径参与黄花棘豆对干旱和高盐逆境胁迫的应答反应。     

新疆无苞芥锌指蛋白基因的克隆及表达分析

利用同源克隆法从新疆无苞芥中克隆获得1个锌指蛋白基因(OpZFP)。序列分析表明,OpZFP基因的开放阅读框为684bp,推测编码含227个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示,OpZFP蛋白含有1个典型的C2H2型锌指结构,在C端含有一个可能具有转录抑制功能的EAR结构域。系统进化树分析表明OpZFP编码产物与拟南芥AtZFP1、琴叶拟南芥AlZFP1的进化关系较近。分离了OpZFP基因2 095bp的启动子序列,发现该启动子与拟南芥AtZFP1基因的启动子序列只有84.4%的相似性,启动子分析表明二者存在多处不同的顺式作用元件。半定量RT-PCR分析表明,OpZFP在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,在根中的表达量最高。OpZFP基因受高盐、干旱和低温等胁迫的诱导表达,表明该蛋白涉及多种胁迫相关的信号传导途径。     

水母雪莲通气组织形成的相关基因SmLSD1克隆及表达

该研究以水母雪莲为实验材料,通过RT-PCR结合RACE技术克隆了通气组织形成相关基因SmLSD1(GenBank登录号为OL690334),并对该基因在不同胁迫下的表达量及编码蛋白结构进行测定分析。结果表明：(1)水母雪莲SmLSD1基因全长965 bp,包含537 bp的开放阅读框,编码178个氨基酸。(2)同源序列比对发现,水母雪莲SmLSD1蛋白与菊科植物牛蒡LSD1的氨基酸序列相似性最高,达到98.31%。(3)亚细胞定位显示SmLSD1基因主要在细胞核和细胞膜上表达;原核表达显示,SmLSD1基因编码氨基酸的分子量约为18 kD。(4)荧光定量分析显示,SmLSD1基因在根、茎、叶中均有表达,且在叶片中表达量最高;在低温、低氧及紫外胁迫下,SmLSD1基因的表达量下调。研究推测,SmLSD1基因在水母雪莲通气组织的形成以及对逆境胁迫的响应中发挥着重要作用。     

外源ABA对冬小麦越冬期蔗糖代谢的影响

以抗寒品种‘东衣冬麦l号’和冷敏感品种‘济麦22’为试验材料,在三叶期时对叶片喷施ABA。在冬小麦越冬期间对叶片和分蘖节取样,研究外源ABA对越冬期低温下冬小麦的蔗糖含量及蔗糖代谢相关酶活性的影响。结果表明,外源ABA处理使低温下2个冬小麦品种积累了更多的蔗糖,尤其是‘东农冬麦1号’的分蘖节。零上低温时外源ABA促进了尿苷二磷酸一葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）在蔗糖的合成中起主要作用,在零下低温时外源ABA则促进了UGP在蔗糖分解中起作用;外源ABA提高了‘东农冬麦1号’叶片和分蘖节以及‘济麦22’分蘖节中蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶的活性,但‘济麦22’叶片中这两种酶的活性则受到ABA的抑制;外源ABA也不同程度地促进了2＋-小麦品种叶片和‘济麦22’分蘖节中酸性转化酶和碱性转化酶活性的提高,但却抑制了‘东农冬麦1号’分蘖节中两种酶活性的提高,表明抗寒性强的‘东农冬麦1号’对外源ABA可能更加敏感,其越冬器官分蘖节保持了较高的蔗糖水平,其蔗糖合成能力的提高将有利于冬小麦植株抵御低温,进而维持＋a＋k-的存活。     

水稻花药水分胁迫培养反应与植株水平抗旱性间的关系

以4个抗旱性不同的水稻品种为材料,研究水分胁迫对花药培养愈伤组织诱导、苗期生长量、成熟期单株产量,以及苗期生理生化指标的影响。结果表明,水分胁迫下,‘沪旱2B’和‘沪旱3号’的花药愈伤组织诱导率、苗期生长量和单株籽粒产量的受抑程度低于‘日本晴’和‘大华香粳’;苗期叶中的脯氨酸（Pro）含量以及过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的受抑程度也是‘沪旱2B’和‘沪旱3号’低于‘日本晴’和‘大华香粳’。表明供试材料离体花药对水分胁迫的培养反应与植株水平的抗旱性存在相关性。     

外源褪黑素对高温胁迫条件下黄瓜幼苗氮代谢的影响

以‘津优4号’（热敏感型）和‘美国保尔’（耐热型）黄瓜幼苗为试材,研究了叶面喷施褪黑素对高温胁迫条件下黄瓜幼苗氮代谢的影响。结果显示,高温胁迫下,（1）两种黄瓜幼苗硝态氮含量先升高后降低,‘津优4号’总氮和氨态氮含量先下降后持续升高,而‘美国保尔’总氮和氨态氮含量持续上升;（2）两种黄瓜幼苗硝酸还原酶（NR）活性均先上升后下降,而谷氨酰胺合成酶（Gs）、谷氨酸合成酶（GOGAT）和谷氨酸脱氢酶（GDH）均持续下降,‘美国保尔’的4种酶活性下降幅度显著低于‘津优4号’。研究结果表明,叶面喷施褪黑素可有效缓解高温胁迫对NR、GS、GOGAT和GDH的抑制作用,显著增加硝态氮含量,降低氨态氮含量,减轻氨态氮积累对黄瓜幼苗造成的毒害作用,增强高温胁迫条件下黄瓜幼苗氮素的代谢能力,减轻高温胁迫对黄瓜幼苗造成的伤害,提高黄瓜幼苗抵御高温胁迫的能力。     

高温胁迫下不同光强对‘赤霞珠’葡萄PSII活性及恢复的影响

本文研究了高温与不同光强结合处理对‘赤霞珠’葡萄叶片PSII活性及恢复的影响。结果表明,高温黑暗处理（40℃,0μmaol·m-2．s-1）导致叶片PSII最大光化学效率（Fv/Fm）、反应中心吸收的光能用于电子传递的量子产额（ψEo）与单位反应中心光能的传递（ETo/RC）降低明显,且无恢复趋势,K点相对荧光（Vk）、单位反应中心光能的吸收（ABS／RC）与捕获（TRo／RC）显著升高。高温弱光处理（40℃,200μmol·m-2．s-1）后的叶片PSII活性明显恢复,ETo／RC降低明显,TRo/RC无显著变化。高温强光（40℃,1600μmol·m-2．S-1）处理导致单位面积有活性反应中心数量（RC/CSm）抑制程度最大,恢复程度较低。实验结果说明,高温处理下黑暗对葡萄PSII功能活性及恢复均会造成抑制,而弱光可以显著缓解高温对葡萄叶片的胁迫作用,并促进PSII的恢复,强光导致胁迫下的PSII功能抑制最明显。     

6-BA预处理对低温弱光胁迫下辣椒幼苗叶绿素a荧光参数和膜脂过氧化的

研究6-BA预处理对低温（15℃/5℃）弱光（100μmol·m^-2·s^-1）下辣椒品种‘湘研16号’幼苗叶片中叶绿素a荧光参数和膜脂过氧化影响。结果表明,0．08mmol·L^-16-BA减缓低温弱光下辣椒幼苗光系统II（PSII）最大光化学效率（Fv/Fm）、PSH实际光化学效率（ΦPSII）和PSII反应中心光能捕获效率（Fv’/Fm’）的下降以及叶片膜透性和丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量的增加,但是提高了超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SCD）、过氧化物酶（peroxidase,POD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）以及抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase,APX）的活性。     

外源水杨酸预处理对高温胁迫下白菜耐热性和光合特性的影响

采用叶片喷施水杨酸（SA）的方法,研究高温胁迫下外源SA预处理对‘夏帝’和‘苏州青’2个白菜品种耐热性和光合特性的影响。结果表明：SA预处理降低了高温胁迫下白菜叶片的电解质渗透率、MDA和脯氨酸含量以及净光合速率（R）,从而缓解高温对质膜的过氧化伤害,并且通过提高可溶性糖和可溶性蛋白含量、SOD和POD活性来适应高温环境;然而SA预处理对气孔导度（GS）和蒸腾速率（功的影响在2个品种中变化相反,而对胞间CO2浓度（G）的影响差异不大。与耐热性较强的白菜品种‘夏帝’相比,耐热性较弱的品种‘苏州青’经SA预处理对缓解高温胁迫的影响效果更为明显。     

枣品种耐盐性与叶片生物膜结合态多胺水平和H~＋-ATP酶活性的关系

120mmol·L^-1NaCl胁迫30d,耐盐性强的‘金丝小枣’叶片细胞质膜、液泡膜共价结合态腐胺（Put）、亚精胺（Spd）、精胺（Spm）含量及多胺（PAs）总水平与对照无显著性差异,但耐盐性弱的‘冬枣’叶片质膜共价结合态Put、Spd、Spm含量和PAs总水平及液泡膜Spd含量均显著降低;‘金丝小枣’叶片类囊体膜共价结合态Put含量、PAs总水平较对照显著降低,‘冬枣’则是Put、Spd、Spm含量及PAs总水平均显著降低。盐胁迫下,‘金丝小枣’叶片细胞质膜、液泡膜、类囊体膜非共价结合态Put、Spd、Spm含量及PAs总水平下降,但其中仅类囊体膜Spd含量显著低于对照,而‘冬枣’的3种膜上非共价结合态的这些多胺及其总水平均显著低于对照。与对照相比,盐胁迫下耐盐性不同的2个枣品种,叶片细胞质膜、液泡膜和类囊体膜H＋-ATP酶活性均降低,但降低幅度因枣品种和生物膜种类不同而异,且H＋-ATP酶活性与相应膜结合态多胺水平存在极紧密的正相关关系。结果表明,膜结合态多胺参与枣品种耐盐性的表达,调节盐胁迫下枣叶细胞中溶质的跨膜运输。     

二色补血草OEE2基因的克隆和表达

从二色补血草中分离出一条含有完整开放读码框（ORF）序列的OEE2基因。该基因全长994bp,其中5’非翻译区27bp,3’非翻译区160bp,ORF全长807bp,共编码264个氨基酸,编码蛋白的分子量为28．2kDa,理论上的等电点为7．66。BlastP分析表叽二色补血草OEE2与马铃薯OEE2序列同源性最高,与喇叭水仙OEE2序列同源性最低,从9个物种的氨基酸多序列比对中可以看出,OEE2的氨基酸序列保守性较高。实时定量RT．PCR方法检测该基因对低温、NaCl和聚乙二醇（PEG）胁迫的基因表达模式的结果表明,PEG和低温能诱导OEE2基因在二色补血草叶中表达,这两种处理的OEE2基因表达量于胁迫48h后都达到高峰,而在NaCl胁迫下OEE2在二色补血草根和叶中表达都受抑制。     

基于叶绿素荧光成像及荧光参数分布特征的叶片光合异质性定量分析

植物叶片光合作用具有高度的空间异质性,叶绿素荧光成像技术为叶片光合异质性的研究提供了便利,但叶片光合异质性的定量分析并没有得到广泛应用。本文利用Imaging PAM叶绿素荧光成像系统,获得中亚热带地区越冬期小叶榕(Ficus microcarpa)阳生叶和阴生叶的叶绿素荧光参数图像,并利用仪器的分析软件对其进行分析,定量比较了阳生叶和阴生叶的光合异质性特征。研究发现：越冬期小叶榕阳生叶的光合异质性和光抑制程度明显高于阴生叶,变异系数可作为光合异质性的定量指标。低温强光导致阳生叶坏死率(P_LN)达4.30%,并有53.30%的区域处于严重光抑制(0v/F_m<0.627),但仍有42.27%的区域仅为轻度光抑制(0.627≤F_v/F_m<0.800)。而低温弱光并未造成阴生叶坏死和严重光抑制。通过对光系统Ⅱ(PSⅡ)的实际光合效率(Y(Ⅱ))、调节性能量耗散的量子产额(Y(NPQ))和非调节性能量耗散的量子产额(Y(NO))荧光参数异质性的定量分析表明,阳生叶...