摩根摩根菌β-内酰胺酶检测及耐药性分析

目的了解摩根摩根菌临床分离株产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、头孢菌素酶（AmpC）、金属酶（MBLs）、碳青霉烯酶（KPC）情况,并分析其对17种常见抗菌药物的耐药性。方法 ESBLs和AmpC及MBLs采用三维试验检测,碳青霉烯酶采用改良Hodge试验进行检测,并以K-B法测定17种常见抗菌药物的耐药性。结果 102株摩根摩根菌单产ESBLs 15株,检出率为14.71%;单产AmpC 8株,检出率为7.84%;单产金属β-内酰胺酶（MBLs）3株,检出率为2.94%;所有菌株中未检出碳青霉烯酶（KPC）;同产ESBLs及AmpC 6株,检出率为5.88%;未发现其他双产酶菌株。摩根摩根菌非产酶分离株对17种抗生素的耐药率均低于50.0%;摩根摩根菌产酶分离株对亚胺培南、美罗培南培南的耐药率低于15.0%,与非产酶菌株相比,差异无统计学意义（P〉0.05）;对其余抗生素的耐药率均明显高于非产酶菌株（P〈0.05）。同产ESBLs＋AmpC与耐亚胺培南摩根摩根菌分离株呈多重耐药。结论我院摩根摩根菌分离株产生多种β-内酰胺酶,且对常用抗生素耐药性比较严重,建议临床医师合理使用抗生素,以免耐药菌株的产生。     

217株铜绿假单胞菌产β-内酰胺酶状况及血清学分型的调查研究

目的了解广州地区铜绿假单胞菌（PA）3种主要β-内酰胺酶（金属β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶和AmpC酶）的产生情况和血清型分布,观察这些铜绿假单胞菌的耐药差别.方法用法国生物梅里埃公司的VITEK-2细菌鉴定与药敏系统进行217株铜绿假单胞菌的鉴定与药敏,对可疑产金属β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶、AmpC酶的菌株,用双纸片协同试验和头孢西丁三维试验进行3种酶的表型确证,同时采用玻片凝集试验对这些菌进行血清分型.结果217株铜绿假单胞菌的β-内酰胺酶产酶率为20.7%（45/217）,其中产金属β-内酰胺酶的有26株,占12.0%（26/217）,产AmpC酶的有11株,占5.1%（11/217）,产超广谱β-内酰胺酶的有8株,占3.7%（8/217）;对氨曲南、头孢吡肟、头孢他啶、环丙沙星、亚胺培南、左旋氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸和美洛培南这些临床常用抗生素,产酶菌较不产酶菌敏感性明显降低（P均小于0.05）;217株铜绿假单胞菌的血清分型以G型为主,占39.6%（86/217）,其次为L型,占19.8%（43/217）;产酶菌株的血清型以B和L型为主.结论广州地区引起临床感染的铜绿假单胞菌产生的β-内酰胺酶以金属酶最常见,其次为AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶;产酶株对临床常用抗生素敏感性降低;广州地区铜绿假单胞菌的血清型以G型为主,产酶菌株以L和B型为主,临床上治疗铜绿假单胞菌引起的感染应根据实验室的药敏结果选择抗生素.     

超广谱β-内酰胺酶SHV-18的表达纯化及活性验证

目的：产超广谱β-内酰胺酶是肠杆菌科细菌和肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶类抗生素耐药的重要机制,该类酶主要水解青霉素类、头孢菌素类以及单环酰胺类抗生素。自从1983年第-次有关p内酰胺酶的报道开始,至今已经发现超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的种类超过400种,其中SHV型是最常见的ESBLs类型之一。本研究主要探讨了超广谱β-内酰胺酶SHV－18的原核表达载体的构建、酶的纯化和活性验证。方法：利用肺炎克雷伯菌ATCC700603全基因组为模板,应用分子生物学技术钓取SHV-18基因,构建pET22b（＋）-SHV－18表达质粒,经测序鉴定后,转化大肠杆菌Transetta（DE3）,IPTG诱导表达并亲和纯化,进-步通过抗生素水解实验,检测其水解活性,测定其酶动力学参数。结果：成功构建了可以以裂解上清形式高效表达SHV-18的工程菌。通过亲和纯化最终获得纯度达到90％以上的β-内酰胺酶SI-IV-18。获得的SHV-18蛋白能够水解青霉素G、头孢拉定、头孢唑肟、头孢他啶、头孢吡肟等多个抗生素。结论：获得了对青霉素和头孢菌素类具有水解活性的超广谱β-内酰胺酶SHV-18,并对其酶动力学参数进行了检测。在实验室研究了β－内酰胺酶SHV－18对不同抗生素的水解特性,更加有利与指导临床抗生素的合理使用。     

TEM-1型β内酰胺酶的原核表达纯化及活性验证

目的:产β-内酰胺酶是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等对β内酰胺类抗生素耐药的主要机制之一,该酶能水解青霉素、头孢菌素、碳青酶烯类等多种抗生素,其中TEM型是发现最早且种类最多的β内酰胺酶。探讨TEM-1型β内酰胺酶原核表达载体的构建、酶的纯化及活性验证。方法:利用PCR技术,以大肠杆菌全基因组为模板钓取TEM-1基因,构建p ET22b(+)-TEM-1表达质粒,经测序鉴定后,转入大肠杆菌Transetta(DE3),IPTG诱导表达、亲和纯化,并通过抗生素水解实验验证其酶活性。结果:构建了可溶性表达TEM-1的工程菌,通过亲和纯化最终获得纯度达90%以上的TEM-1型β内酰胺酶,该酶可水解氨苄西林。结论:获得了对氨苄西林具有水解活性的TEM-1型β内酰胺酶,并对其进行了酶动力学参数检测,验证其抗生素水解特性,有利于对临床抗生素的合理应用做出指导。     

头孢他啶耐药褪色沙雷菌β-内酰胺酶检测及耐药性分析

目的了解头孢他啶耐药褪色沙雷菌临床分离株产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、头孢菌素酶（AmpC）及碳青霉烯酶情况,并分析其对14种常见抗菌药物的耐药性。方法 ESBLs、AmpC采用三维试验进行检测;碳青霉烯酶采用改良Hodge试验进行检测;药物敏感试验采用K-B法测定。结果 112株头孢他啶耐药褪色沙雷菌ESBLs、AmpC检出率较高;未发现同产ESBLs、AmpC及碳青霉烯酶3种酶的菌株。产ESBLs、AmpC褪色沙雷菌对亚胺培南、美罗培南的耐药率低于6.00%,与非产酶菌株相比,差异无统计学意义（P〉0.05）;对头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢比肟的耐药率均明显高于非产酶菌株（P〈0.01）。另外,同产ESBLs＋AmpC头孢他啶耐药褪色沙雷菌分离株与单产酶株相比,对头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢比肟、复方新诺等多种抗生素耐药率差异有统计学意义（P〈0.01或P〈0.05）。碳青霉烯酶株对14种常见抗生素多重耐药或泛耐药。结论我院头孢他啶耐药褪色沙雷菌分离株对常用抗菌药物的耐药性较高,耐药性的产生与细菌产多种β-内酰胺酶有关。     

肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶检测及耐药性分析

目的 了解肺炎克雷伯菌临床分离株产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)、头孢菌素酶(AmpC)、金属酶(MBLs)、碳青霉烯酶(KPC)情况,并分析其对19种常见抗菌药物的耐药性.方法 ESBLs和AmpC及MBLs采用三维试验检测,碳青霉烯酶采用改良Hodge试验进行检测,并以K-B法测定19种常见抗菌药物的耐药性.结果 582株肺炎克雷伯菌单产ESBLs 168株,检出率为28.86％;单产AmpC52株,检出率为8.93％;单产KPC 38株,检出率为6.53％;所有菌株中未检出MBLs;同产ESBLs及AmpC43株,检出率为7.39％;同产ESBLs及KPC 12株,检出率为2.06％,同产AmpC及KPC 10株,检出率为1.72％,未发现同产ESBLs、AmpC及KPC 3种酶菌株.单产ESBLs、单产AmpC、同产ESBLs+ AmpC肺炎克雷伯菌分离株对亚胺培南、美罗培南培南的耐药率低于3.0％,与非产酶菌株相比,差异无统计学意义(P＞0.05);对其余抗生素的耐药率均明显高于非产酶菌株(P＜0.01).另外,同产ESBLs+ AmpC肺炎克雷伯菌分离株与单产ESBLs、单产AmpC株相比,对头孢他啶、头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星和复方新诺明等多种抗生素表现为明显升高(P＜0.01或P＜0.05).单产碳青霉烯酶株、同产ESBLs及KPC、同产AmpC及KPC菌株对多粘菌素B的耐药率为28.94％～33.33％,其余抗生素的耐药率均高于50.0％;单产KPC株与非产酶菌株相比,对所有抗生素的耐药率均明显升高(P＜0.01).结论 肺炎克雷伯菌分离株产生多种β-内酰胺酶,且对常用抗生素呈高度耐药,建议临床医师合理使用抗生素,以免耐药菌株的产生.     

肺炎克雷伯菌AmpC β-内酰胺酶检测及耐药性分析

目的对肺炎克雷伯菌持续高产AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）检测及耐药性分析,揭示其耐药机制,指导临床合理用药.方法采用改良酶提取物三维试验法,在常规NCCLS纸片扩散法基础上接种大肠埃希菌ATCC 25922,在头孢西丁和头孢曲松药敏纸片周围放射性切出琼脂小槽,待测菌的酶粗提物在槽内扩散,分别进行AmpC和ESBLs测定.结果121株肺炎克雷伯菌AmpC酶总检出率为2.5%,ESBLs检出率45.5%,AmpC＋ESBLs检出率为0.8%.它们对青霉素类,第1、第2、第3代头孢菌素,头霉素类,单环β-内酰胺类,氟喹诺酮类,磺胺类及一些酶抑制剂复合抗生素耐药率为50%～100%不等.哌拉西林/他唑巴坦耐药率小于50%,未检出亚胺培南的耐药菌株.结论产生ESBLs和Ampc酶是肺炎克雷伯菌对头孢菌素类抗生素耐药的主要机制,ESBLs和AmpC酶的肺炎克雷伯菌对多种抗生素耐药,应加强对β-内酰胺酶的检测和其感染者的治疗.     

一株β-葡萄糖苷酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究

【目的】分离获得β-葡萄糖苷酶高产菌株,确定该菌分类地位,并对其所产β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行初步研究。【方法】采用七叶灵显色法从土壤样品中筛选β-葡萄糖苷酶产生菌,再用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)显色法进行复筛;通过形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列相似性分析等方法确定其分类学地位;利用超滤、疏水层析、阴离子层析、分子筛层析法对β-葡萄糖苷酶进行分离纯化;以PNPG为底物,测定β-葡萄糖苷酶的最适反应pH及最适反应温度,通过双倒数作图法确定β-葡萄糖苷酶催化不同底物水解的米氏常数Km值。【结果】从土壤样品中筛选得到一株β-葡萄糖苷酶高产菌株ZF-6C,初步鉴定为Bacillus korlensis;芽胞杆菌ZF-6C所产β-葡萄糖苷酶的分子量约为90 kD,最适反应pH和温度分别为7.0和40°C,该酶具有水解β(1,4)糖苷键的活性,最适底物为邻硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷,Km值为0.73 mmol/L。金属离子Ca2+、Pb2+增强酶活,而Cu2+、Fe2+抑制酶活。【结论】首次报道从Bacillus korlensis中分离得到β-葡萄糖苷酶,Bacillus korlensis ZF-6C所产β-葡萄糖苷酶在分子量、最适反应条件及底物特异性等方面均不同于已知酶,可能为一结构新颖且催化效率较高的β-葡萄糖苷酶。     

β—内酰胺类抗生素超敏感菌的分离与特性

在β-内酰胺抗生素筛选过程中,超敏感菌是主要的筛选模型之一。这种菌株一般由耐药性革兰氏阴性菌经诱变而产生,它对β—内酰胺类抗生素具有高度敏感性,而对其(?)抗生素存在一定的耐性,利用它可检测微生物产生的微量的β-内酰胺类抗生素。本文叙述了一株来源于绿脓杆菌的超敏感菌的分离过程,并观察了它对抗生素的敏感性等有关的微生物学特性。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)半乳糖可诱导表达系统特性的研究

把大肠杆菌β一半乳糖苷酶基因克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子GALl的穿梭表达质粒pYES2中,并把得到的重组质粒分别转化到两种不同遗传性状的宿主菌中,其中一株菌为蛋白酶活性缺失90％以上的pep4-3突变菌株。通过比较两株重组菌产生的β一半乳糖苷酶活性水平发现在所述实验条件下,蛋白酶缺失突变菌株中产生的β一半乳糖苷酶活水平不仅均要高于另一对照菌株,并且pep4-3突变菌株表现出受葡萄糖阻遏的严紧程度高及对诱导反应迅速等特点。此外,带有重组质粒的pep4-3突变菌株在葡萄糖阻遏培养基中最大生长量和重组对照菌株基本相同,但β一半乳糖苷酶在pep4-3突变菌株中的表达对细胞生长的影响明显小于对照菌株。