感染性猪圆环病毒2型基因组DNA的分子克隆

本研究通过PCR扩增出猪圆环病毒2型(PCV—2)的全基因组(1768bp),克隆入pcDNA3载体的EcoR I酶切应点,获得含有PCV-2全基因组的重组质粒,命名为pcDNApcv2。将重组质粒大量扩增后,用EcoR I切出1768bp的PCV—2全基因组,在体外用T4DNA连接酶使其连接环化。用脂质体法将体外连接产物转染无PCV污染的PK—15细胞,经4次连续传代,用间接免疫荧光实验(IFA)及电镜观察证实已获得复制能力的PCV—2病毒。由此可见,本试验构建的环化的PCV—2全基因组DNA具有感染性。     

用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒(CAV)环形基因组DNA(全长2.3kb)的EcoRI位点和BamHI位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用PCR技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的CAV感染的MDCC-RP1细胞基因组DNA中,分别扩增出包含EcoRI和BamHI分割开的病毒基因组两部分(1.5kb和0.8kb)约1.5kb和约1.25kb的两个片段.再将其中相应序列拼接克隆进pUC18载体,获得包含CAV全基因组序列DNA片段的克隆质粒pCAV2.4.酶切分析表明,该质粒具有预期的BamHI位点、PstI位点、HindⅢ位点,而预期的EcoRI位点消失.重组质粒插入DNA片段的两端序列分析表明,质粒pCAV2.4是包含CAV全基因组序列的重组质粒,插入DNA片段序列中的EcoRI位点序列发生了一个碱基突变.     

鸡贫血病毒全基因组点突变体的体外构建及其在宿主细胞MSB1的转染研究

在已构建鸡贫血病毒（CAV）全基因组体外克隆（pCAV2.4)的基础上,设计一对特定引物,用CPR定向点突变方法扩增出含有完整的EcoRI位点的CAV全基因组（2.3kb）,并克隆入pUC18载体中,获得阳性克隆,命名为pCAVE^ 。经酶切鉴定和序列分析EcoRI位点两侧序列,原先不完整的EcoRI位点（－GACTTC－）已被定向点突变为完整的EcoRI位点（－GAATTC-)。对重组质粒pCAVE^ 以EcoRI酶切回收CAV全基因组DNA,在体外连接并经纯化后,经Effectene转染易感宿主细胞MSB1。将转染细胞培养上清连续传代8次以后,出现病毒复制（MSB1细胞培养基颜色不再变黄）。取此时细胞培养液感染无CAV的1日SPF小鸡,14天出现典型的鸡盆血症状和胸腺萎缩、骨髓脂肪变性等病变。获得了能在体外自主复制并组装成完整CAV病毒子的感染性核酸。     

鹅源腺病毒基因组DNA物理图谱的构建

将鹅源腺病毒Y81G4株全基因组DNA的HindⅢ酶切片段分别插入质粒pUC18, 成功构建了全基因组DNA文库.在此基础上,将重组质粒携带的插入片段切出、回收并分别用地高辛标记后作为探针,与经限制酶BamHI、EcoRI、PstI、Eco RV消化的病毒基因组DNA进行Southern Blotting,杂交结果经比较综合后获得了该病毒基因组DNA的HindⅢ、Ba mH I、EcoR I、PstI、EcoR V限制性内切酶的物理图谱.利用已发表的含有鸡EDS76病毒AA-2 株基因组DNA右末端的重组质粒pBE42作为探针,与本病毒两末端重组质粒进行Southern Blo tting,根据同源性杂交结果确定了本病毒基因组DNA物理图谱与EDSVAA-2株相应的方向. 本病毒基础因组DNA物理图谱的精确构建,为进行基因组结构分析,筛选复制非必需区,构建禽腺病毒载体打下了基础.     

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中克隆的研究

在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨羧基端基因片段功能打基础.采用PCR扩增方法获取P1结构基因.扩增产物用SalI和EcoRI酶切消化,回收1kb大小的DNA片段并与pUC19DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株.用X-gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定.经PCR扩增MPDNA获得1条5.0kbDNA片段.重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出2条带,1条为pUC19载体DNA带,另1条是1kb的插入片段.实验获得肺炎支原体P1蛋白结构基因及含P1蛋白羧基端DNA片段的重组克隆株.     

猪圆环病毒2型福建株的全基因组克隆与序列分析

根据GenBank上公布的猪圆环病毒2型全基因序列设计一对扩增PCV-2全基因的引物,建立扩增PCV-2全序列的PCR方法,并应用此方法从福建省不同地区采集的疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的仔猪肺组织病料中扩增出PCV-2全基因组(1 767 bp),将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-PCV-2,并对其进行序列测定,然后对全基因组进行同源性和遗传进化分析。结果表明,福建省不同地区采集的猪肺组织扩增出的PCV-2全序列与GenBank上公布的的全基因组同源性介于94.9%-99.8%之间,ORF1的同源性介于97.2%-99.9%,ORF2的同源性也很高,介于97.7%-99.8%之间。其中福州株、福清株和漳州株与中国农大报道的12株、郑州株5株、杭州4株、武汉株3株、上海株2株、扬州2株、南京1株和兰州1株共30株在一个进化分支上,同源性也高达99.3%。本研究有助于监测PCV-2的疫源和进化关系,为进一步深入研究福建省生猪猪圆环病毒来源奠定一定基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从疑患断奶仔猪多系统消耗综合症(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出ORF2全基因(702bp).将此片段克隆入pGEM-T easy载体,筛选获得重组质粒pTORF2,并对此质粒中的插入序列进行了测序分析,结果表明本试验克隆的ORF2与美国PCV-2分离株AF264039的核苷酸及氨基酸序列同源性均达到100%,与其他PCV-2毒株同源性分别为92.3%～98 6%和92.3%～96.6%.重组质粒pTORF2经BamH I、EcoR V双酶切,回收ORF2基因,转移入真核表达载体pSec-Tag2/HygroB的相应酶切位点之间,构建成重组质粒pSecTagORF2.此重组表达载体的构建成功为进一步研究ORF2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盒打下基础.     

猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析

参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒(porcine circovirus type 2,PCV-2)全基因组序列,设计一对PCV-2特异性引物,用该室分离的PCV-2豫A株感染PK-15细胞,从中提取PCV-2复制型基因组DNA,并以之为模板进行PCR扩增.回收PCR产物,构建重组测序质粒T-PCV-2.测序结果表明,猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组为1767bp,与GenBank收录的PCV-2国外分离株核苷酸的同源性可高达97%.序列分析表明,复制型豫A株的基因组包含10个读码框架,其中ORF1、ORF2是其两个最主要的读码框架,分别编码314、234个氨基酸.豫A株和PCV-1间的ORF1、ORF2的氨基酸序列同源性分别为85%、66%,与其它PCV-2毒株间的ORF1氨基酸同源性均在98%以上,而ORF2的氨基酸同源性为92%～97%.     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组犬2型腺病毒的构建

本试验以犬2型腺病毒全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2及其E3区重组质粒pVAX-E3为基础,通过DraⅢ和SspⅠ双酶切,缺失第25097bp-26141bp共1044bp的E3区片段,按与编码链相同转录方向插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV\-9株糖蛋白基因、SV40 polyA基因构成的总长2424bp的表达盒,获得重组基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2-CGS(34.7kb).以AscⅠ和ClaⅠ双酶切,游离重组基因组(32.7kb),在脂质体Lipofectamine TM 2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3缺失区携带狂犬病病毒糖蛋白表达盒的重组犬2型腺病毒CAV-2-CGS.Western印迹试验表明,CAV-2-CGS表达了狂犬病病毒糖蛋白.初步接种试验显示,重组病毒可以诱导犬产生狂犬病病毒特异性抗体.     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组犬2型腺病毒的构建

本试验以犬2型腺病毒全基因组重组质粒pPolyⅡCAV 2及其E3 区重组质粒pVAX E3 为基础,通过DraⅢ和SspⅠ双酶切,缺失第25097bp 26141bp共1044bp的E3区片段,按与编码链相同转录方向插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV9 株糖蛋白基因、SV40 polyA基因构成的总长2424bp的表达盒,获得重组基因组质粒pPolyⅡCAV 2 CGS(34.7kb)。以AscⅠ和ClaⅠ双酶切,游离重组基因组(32.7kb),在脂质体LipofectamineTM 2000 介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3 缺失区携带狂犬病病毒糖蛋白表达盒的重组犬2 型腺病毒CAV 2 CGS。Western印迹试验表明,CAV 2 CGS表达了狂犬病病毒糖蛋白。初步接种试验显示,重组病毒可以诱导犬产生狂犬病病毒特异性抗体。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。     

青蒿素生物合成机理研究现状

本文总结了目前有关青蒿素生物合成机理方面的研究,主要包括青蒿素生物合成中生理因子的影响,青蒿素生物合成中间体及前体,青蒿素生物合成细胞定位等。指出了存在的一些问题及今后的研究发展前景。