哺乳类基因工程的一些实验操作 实验13 基因文库的筛检

一、噬菌斑原位杂交筛检 1．按照实验9中的平板扩增抽提法的1-4操作 步骤，将重组噬菌体感染的宿主菌同上层培养基混匀 后倒在底层培养基上，37℃ 倒置培养过夜（用2天前 倒的平板）     

哺乳类线粒体基因组

作为真核细胞的一种重要细胞器的线粒体含有独立的并自主复制和转录的DNA基因组。虽然线粒体蛋白质的大部分系核DNA编码,但有一小部分是线粒体DNA(mt DNA)编码,并由线粒体的蛋白质合成系统合成。线粒体蛋白质合成系统中的rRNA和tRNA也是mt DNA编码。mt DNA的复制、转录以及蛋白质合成系统均有其本身特点,既与非线粒体真核系统有所不同,又有别于原核细胞中者。因此,线粒体基因组的研究在生物学上有重要意义。此外,线粒体的起源和进化是许多生物学家所感兴趣的和长期争论的问题,而mt DNA的进化比较     

哺乳类线粒体基因组

作为真核细胞的一种重要细胞器的线粒体含有独立的并自主复制和转录的DNA基因组。虽然线粒体蛋白质的大部分系核DNA编码,但有一小部分是线粒体DNA(mt DNA)编码,并由线粒体的蛋白质合成系统合成。线粒体蛋白质合成系统中的rRNA和tRNA也是mt DNA编码。mt DNA的复制、转录以及蛋白质合成系统均有其本身特点,既与非线粒体真核系统有所不同,又有别于原核细胞中者。因此,线粒体基因组的研究在生物学上有重要意义。此外,线粒体的起源和进化是许多生物学家所感兴趣的和长期争论的问题,而mt DNA的进化比较     

水稻基因文库的构建

本文以λ系列EMBL4DNA作载体,在国内条件下建成了水稻(Oryza sativa)“Mudgo”褐稻虱抗性品种(λMBL4／OSM(Bam-Sau3A)]和“南粳15”水稻白叶枯病抗性品种[λ—EMBL4/OSNG15(Bam-Sau3A]的两个基因文库。所得重组子值分别为1．6×10⁶pfu和9．6×10⁶pfu,均超过了建库要求的理论值。     

鲤鱼基因文库的构建

建造基因文库是开展真核生物基因工程工 作的第一步,又是保存濒危物种的基因及分离 克隆特定基因的必要手段。目前国内外有关这 方面的报道很多,在基因的操作技术上,也有许 多新的方法产生,使之日趋完善。鱼类是有特 殊经济意义的物种,基因工程应用于鱼类虽尚 属起步阶段,但有良好的前景,应予以重现。     

野生大豆基因文库的构建

以氯化铯密度梯度离心法纯化噬菌体λEMBL4,将纯化的EMBL4 DNA用BamH1/SalI双酶切制成载体。用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取野生大豆(种名待定)大分子DNA,Sau3A部分酶解,从琼脂糖凝胶中回收10—22kb“目的”DNA片段,与载体连接,体外包装成重组噬菌体。所得重组子值为8×10(?)pfu(噬菌斑形成单位),达到了构建野生大豆基因文库要求的理论值。以栽培大豆7S贮藏蛋白a′-cDNA作探针,用噬菌斑原位杂交法从文库中筛选出一个阳性克隆。     

霍乱弧菌染色体基因文库的构建

利用限制性内切酶Ｓａｎ３Ａ将霍乱弧菌１７８（埃尔托生物型,小川血清型）染色体ＤＮＡ进行部分酶切后,分离２０～５０ｋｂ的ＤＮＡ片断,与经过ＢａｍＨＩ酶切的柯斯质粒ｐＨＣ７９连接重组,通过体外包装系统形成噬菌体颗粒,感染受体菌Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１,构建成霍乱弧菌１７８染色体基因文库。为霍乱弧菌中未知基因的克隆及其它研究打下了基础。     

哺乳类基因工程的一些实验操作

分子遗传学和基因工程已日益成为国内遗传学教学和科研的重要组成部分,为了有 效地提高教学质量和科研水平,除了讲授这些领域中的基本原理和最新进展外,很重要 的是应该广泛开设有关的实验,推广和交流实验操作技术,以便让更多的遗传学工作者 掌握和运用分子遗传学和基因工程的技术去开展工作。为此,我们应《遗传》编辑部之 约,准备分别介绍哺乳类基因工程的十几个基本实验操作,分期刊登在《遗传》上。但是, 基因工程所用技术涉及的学科领域很多,即使是同一项实验,不同实验室的操作程序也 不尽相同;再加上这方面的进展堪称是日新月异,不断地有改进和创新,因此,这里介绍 的是其中的一部分,而且只是我们实验室所熟悉惯用的操作。沦海遗珠,在所难免,挂一 漏万．祈请墓宏。凡有错误不妥之处,还请批评指正。     

国际稻IR_(26)核基因组基因文库建成

基因文库是遗传工程的一种新技术。目前国内外在人类与动物中已经建成了多种基因文库,但在植物中则建成的还很少,水稻更尚未见报导。一般建造基因文库常用一种λ噬菌体的缺陷型Charon4A作为载体,我们则采用了近年来由Collins等所创造、运载量较大而操作却比较简便的一种新型杂种质粒——科斯质粒(Cosmid)作为载体,首次建成了带有多种抗病基因的国际水稻IR_(26)。核基因组基因文库。     

构建胆固醇氧化酶的短杆菌基因文库

以内切酶Sau3AI部分水解产胆固醇氧化酶短杆菌的染色体DNA,以质粒pUC18为载体,JM109为宿主,采用碱性磷酸酯酶CIP去除内切酶BamHI水解后质粒的5’端磷酸根,提高质粒的重组率,构建了供筛选胆固醇氧化酶基因的基因文库     

国际稻IR_(26)核基因组基因文库建成

基因文库是遗传工程的一种新技术。目前国内外在人类与动物中已经建成了多种基因文库,但在植物中则建成的还很少,水稻更尚未见报导。一般建造基因文库常用一种λ噬菌体的缺陷型Charon4A作为载体,我们则采用了近年来由Collins等所创造、运载量较大而操作却比较简便的一种新型杂种质粒——科斯质粒(Cosmid)作为载体,首次建成了带有多种抗病基因的国际水稻IR_(26)。核基因组基因文库。     

哺乳类基因工程的一些实验操作 实验4 琼脂糖凝胶电泳

一、琼脂箱凝胶的制备 1．电泳槽与点样孔梳的选择进行琼脂糖凝胶 电泳的电泳槽通常有水平板型和垂直板型两种。这里 我们选择较简便，应用最广的平板型电泳槽。点样孔 杭可根据样品数目、点样量等作出选择。对于一定量 的样品来说．，宽而薄的梳子可产生较细而平直的带，适 合于酶切图谱的分析等，较狭的梳子可增加待测样品 检出的灵敏度，适合于印迹杂交检测哺乳类基因组中 单拷贝基因或DNA样品的量较少等情况。点样孔梳 选定后，再根据凝胶的厚度，就可算出每一点样孔中可 以加入的样品体积。     

链霉菌基因克隆载体及基因文库的构建

利用麦迪霉素产生菌中分离的质粒pSMY1(10．8kb),将pIJ30的硫链丝菌素抗性基因(tsr)克隆到psMY1上,获得了具有硫链丝菌素抗性选择标记质粒pSJ10。通过DNA体外缺失,片段播入、λ-COS片段的插入及与大肠杆菌质粒的重组等基因技术,获得了一系列psMY1衍生质粒,包括双标记质粒pSM3,大肠杆菌／链霉菌穿梭质粒pBMJ2和穿梭粘粒pNMJ1。通过对这些质粒的分析,确定了质粒psMY1的复制必需区为3．06kd的EcoRI—sphI片段。质粒pSJ10、pSM3、pNMJ1具有可选择标记,多个单一确切的可克降位点,有一定范围的宿主并能在链霉菌中稳定存在等特点,故可作为链霉菌基因克隆的载体。其中pNMJl(11．15kb)是大肠杆菌／链霉菌穿梭粘粒,能有效地运载28—38kb的外源DNA片段,并能在体外包装λ噬菌体外壳,转导大肠杆菌。利用载体pNMJl,通过λ-噬菌体蛋白体外包装,在大肠杆菌中建立了螺旋霉素产生菌的基因文库,其基因覆盖率可达90％。重组DNA分子可通过转化转移到链霉菌中。     

实验1 哺乳类高分子量DNA的提取

分子遗传学和基因工程已日益成为国内遗传学教学和科研的重要组成部分,为了有效地提高教学质量和科研水平,除了讲授这些领域中的基本原理和最新进展外,很重要的是应该广泛开设有关的实验,推广和交流实验操作技术,以便让更多的遗传学工作者掌握和运用分子遗传学和基因工程的技术去开展工作。为此,我们应《遗传》编辑部之约,准备分别介绍哺乳类基因工程的十几个基本实验操作,分期刊登在《遗传》上。但是,基因工程所用技术涉及的学科领域很多,即使是同一项实验,不同实验室的操作程序也不尽相同;再加上这方面的进展堪称是日新月异,不断地有改进和创新,因此,这里介绍的是其中的一部分,而且只是我们实验室所熟悉惯用的操作。沧海遗珠,在所难免,挂一漏万,祈请鉴宥。凡有错误不妥之处,还请批评指正。     

家蚕的基因文库

本文报导了家蚕Bombyx ,pro基因文库的构建。Sau3A 部分酶解的12-20kb家蚕染色体DNA片段被克隆在λEMBL4的BamHl位点,得到重组噬菌体数5.5×10⁵Pfu,超过了建库要求的理论值。进一步鉴定表明：重组噬菌体呈Spi^-表型;插入的DNA.片段各不相同;并巳从库内筛选到含有与蚊虫酮酶趴基因同源顺序的阳性重组体,这些结果显示了基因文库的可靠性。     

大麻哈鱼基因文库的构建及其生长激素基因的克隆

本文主要论述了黑龙江省特有鱼种,大麻哈鱼全基因文库的构建方法以及从所构建的1.9×10~(?)噬菌体成斑单位/ugDNA基因文库中克隆出生长激素基因片段的研究结果,作者使用DM-BL3入噬菌为载体,将大麻哈鱼肝总DNA的15-20Kb片段重组到载体中,再包装成新的重组噬菌体,以含虹鳟鱼生长激素DNA部分序列的PAF51为探针,经[~(12)P]dCTP标记后,与噬菌斑杂交,自显影,获得3个阳性斑,复筛获得90％以上阳性斑,酶切回收生长激素基因片段,实验证明,已成功地获得大麻哈鱼生长激素基因片段,可供进一步亚克隆或转移研究使用。     

哺乳类基因工程的一些实验操作 实验7 放射性同位素标记DNA探针

一、切[3移位（Nick translation)标记 DNAI. 配制试剂(1) 10XNT（切口移位）缓冲液：50mMMgCI21 0.1M R-M,基乙醇10.5m Tris·HCI pH7.8/0.，毫克1 毫升小牛血清白蛋白。 (2)2XAct缓冲液：20tnM Tris·HCl PH7.5/ JOmM MgCI,/2毫克/ 升小牛血清白蛋白。 (3) 1:4000 DNasel ＾液：1毫克DNase I/ I,升lomm HCI. B液：取人液5微升，加2XAc。液22.5微升和双 重蒸馏水22.5微克， 终体积为50微升（DNase I 1:10)0 取B液1.25微升，加498.75微升2 X Act缓冲 液。终体积为500微升（DNase 11:4000)a (4) dATP, dTTP, dCTP和dGTP各用重蒸水 配成2mM。体积1毫开。 2． 标记放射性同位素的反应按下列次序在 Eppendorf离心管中加入试剂：DNA探针（0.1-1.0 微克）z微升；IOXNT缓冲液2.5微升；dATP 1.5 微升；dG'TP 1.5微升；dTTP 1，，微升；ddH,0 y微 升；。一，'P-dCTP (3,000居／米摩(mmol), 10微居／微 米）5微升；DNase I (1:4 , 000)Ci/mmol, 0.5-1微 升。使总体积为25微升。置冰上1小时，加DNA多 聚酶I，单位，14℃水浴1-1.5小时，加0.2M EDTA 2.5微升终止反应。     

苏芸金芽孢杆菌HD-1质粒基因文库的构建

本文报告以λ系列charnn 28为载体,通过限制核酸内切酶Bam HI部分酶解获得“目的”质粒DNA片段,构建了苏芸金芽孢杆菌HD—1的质粒DNA基因文库,所得重组子值超过要求的理论值。为进一步研究苏芸金杆菌HD—1的基因结构以及基因功能奠定了基础。     

抗鞘翅目δ－内毒素 及毒素基因文库的构建

研究了对鞘翅目昆虫有毒效的5个苏云金芽孢杆菌新蔚株YM一03、s曲04 04、YKI4－01、SH11—05、sphl6－O1伴孢晶体的蛋白质组成,以柳蓝叶甲为供试虫测定了它们的LC50。值,其中YM—03毒力最高。测定了YM－03晶体蛋白N－末端部分氨基酸序列。用琼脂糖凝胶电泳快速检测了5株菌的质粒组成,证明其质粒图型各不相同。以广谱的cosmtd质粒pLAFRI为载体,通过限制酶EcoRI部分酶解获得“目的”DNA片段,构建了菌株YM－03的总DNA文库,对17个抗性克隆的质粒进行酶切分析表明,其中古有外源片段的克隆占总数的76％,超过要求的理论值。以人工合成的杀鞘翅目基因的18bp保守序列片段为探针,筛选了近1200个抗性克隆,获得了3个阳性克隆,LE392(pBYM2)、LE392(pBYM3)和LE392(pBYM4),毒力测定试验表明LE392(pBYM3)和LE392(pBYM4)有一定表达,表明其携带有δ－内毒素基因。     

不吸水链霉菌基因文库的构建及初步筛选

采用碱裂解法从不吸水链霉菌提取染色体DNA,用Sau3AI对染色体DNA进行部分水解,利用透析袋法回收3.5～9kb之间的DNA片段。以pUC18为载体,用BamHI对其进行酶切,再用热敏磷酸酶去磷酸化,酶切产物与外源DNA按一定比例混合后,加入T4DNA连接酶进行连接。连接产物用受体菌E.coliDH5α进行转化,根据α-互补性质产生的颜色反应,挑选白色菌落,构建了相应的不吸水链霉菌基因文库。分别利用特异性探针2-1-1及1-2-1对不吸水链霉菌基因文库进行筛选,利用DIG-Ⅱ-dUTP对特异性探针进行标记,与基因文库中的阳性转化子进行Southern杂交,通过显色反应对杂交结果进行检测,由于时间关系,暂未筛选出阳性克隆,但这些工作对以后的相关实验研究具有很好的借鉴作用。