精子介导转基因动物的研究进展

精子是高度分化的细胞,它具有潜在的结合外源DNA并在受精过程中将其转入到卵内的能力。随着受精卵的发育,外源基因将随机整合到受体基因组中,部分基因能在成体中表达,部分基因不仅能表达还能遗传给后代。一旦精子能表达外源基因,那么将很容易得到大量的转基因后代。因此,精子能携带外源基因入卵和产量丰富这两大特性使精子作为载体制备转基因动物成为一个简便的途径。精子载体法制备转基因动物无需昂贵的实验设备,亦无需专门的技术。因此,提出后就备受关注。介绍精子介导的转基因动物的制作原理及具体方法的研究进展。     

转基因动物育种的EK细胞途径

将外源基因导入动物体中的途径目前主要是使用向受精卵中注射DNA的方法,这是一种可重复的有用的方法,但其成功率很低,外源基因的整合、表达和稳定的筛选工作是在个体水平上进行的,这对许多大家畜来说是难以实现的工作。近年来,经过人们计多年的努力,综合了分子遗传学、发育遗传学和体细胞遗传学的当代成果,一种新的哺乳动物遗传工程的方法日益成熟,这就是转基因动物育种的EK细胞途径。     

提高转基因表达水平的策略

随着转基因相关技术的发展,转基因动物技术在许多方面得到了成功应用.但外源基因在体内的表达仍然难以预测,特别是大动物的转基因,由于制备效率低下,因而难以筛选出足够的高表达的阳性动物数.基因表达调控研究对提高外源基因在动物体内的表达水平提供了一些新手段,本就避免转基因的位置效应、控制外源基因在动物宿主基因组中的整合、提高转基因的表达效率、构建转基因载体和使用外源基因需要注意的问题等进行综述.     

精子载体法制备转基因动物的研究进展

精子载体法是一种低成本、简单快速制备转基因动物的方法.外源基因主要通过两种方式实现基因整合,一种是直接整合到精子的基因组中;另一种是通过精子携带进入卵细胞,然后整合到受精卵的基因组中.尽管现在已经有很多利用精子载体法获得了转基因动物的研究,但是基于精子在受精过程中,结合、内化、以及转运外源基因等方面能力的差异,转染效率仍有待提高.就利用精子载体法制备转基因动物过程中,精子载体法制备转基因动物的分子机制和方法方面进行系统的阐述和分析.     

SND1转基因小鼠的构建

目的:构建 SND1 过表达的转基因小鼠模型。方法:利用对小鼠 SND1 基因转录本构建 SND1 过表达载体pInsulator-CAG-3×FLAG-SND1,利用受精卵原核注射技术,将外源线性pInsulator-CAG-3×FLAG-SND1转基因载体注射到受精卵细胞核内,将存活受精卵进行胚胎移植制备 SND1 转基因小鼠,用PCR、RT-PCR技术鉴定转基因小鼠是否构建成功。结果:成功构建过表达 SND1 基因的转基因小鼠模型,为进一步研究 SND1 基因在动物体内的生物学功能奠定基础。     

体细胞基因打靶制备动物乳腺生物反应器的策略与应用

在转基因动物研究中,由于基因表达调控元件的人工拼接和外源基因在动物基因组中随机整合所带来的“位置效应”,致使转基因动物外源基因的表达水平不高并且差异较大。为此,利用定位整合优势,对以基因同源重组为基础的基因打靶技术进行了大量研究。介绍了就利用体细胞基因打靶和核移植技术制备动物乳腺生物反应器的策略和应用情况做一综述,并对提高基因打靶效率的各种策略,打靶细胞的选择,转基因细胞核移植的低融合事件以及基因打靶制备乳腺生物反应器的优越性进行分析。     

应用荧光原位杂交技术检测人β^E珠蛋白基因小鼠染色体上的整合状态

为将荧光原位杂交技术应用于基因定位研究中,探讨一种能有效地检测转基因动物染色体上外源基因整合状态的实验方法,对小鼠腹腔注射秋水仙素后,取转基因小鼠骨髓制备中期染色体,将传统的FISH方法加以改进,检测外源基因在转基因小鼠染色体上的整合状态。检测结果表明,外源人β^E珠蛋白基因已稳定地整合于小鼠染色体上,FISH能直观地反映外源基因在转基因动物染色体上的整合状态,该方法可对转基因动物及基因转移研究中的外源基因整合反进行染色体定位检测。     

显微注射法制备转基因小鼠的技术研究

转基因技术是发生工程学或胚胎操作技术中的一部分。这一技术包括有受精卵的采集,受精卵的体外培养,胚胎移植等技术,转基因动物制作是其应用技术之一,它是将外源ＤＮＡ片段用显微注射法直接注入受精卵原核,使外源ＤＮＡ随机整合到寄主基因组中而形成转基因小鼠。我们建立完善这一技术的目的是在实验动物的生产中为转基因动物的生产提供稳定可靠的保证。我们将ｐＣＸＴＧＡＰ、ｐＣＳＬＮ等基因分别注入受精卵原核制备相应的转基因动物模型,并从中总结较佳的操作技术。结果经检测阳性转基因小鼠占出生幼鼠的１６３８％。我们认为不仅要有精细的微注射技术、动物的选用和饲育、严密的胚胎操作都是转基因动物制作成功的重要条件。     

转基因动物及其在生物反应器中的应用与市场现状

转基因动物是指用DNA重组技术将人们所需要的目的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内,使外源目的基因随细胞的分裂而增殖并在体内表达,且能稳定地遗传给后代的动物。1982年美国华盛顿大学Palmiter等将大鼠生长激素基因导入小白鼠的受精卵里得到比正常体格大一倍的“超级小鼠”,此成果带动了转基因动物的一系列研究。     

PiggyBac在转基因小鼠制备中的应用

受精卵雄原核裸DNA注射是目前制备转基因小鼠的主要技术,而转基因表达成功率低是这种技术的主要缺点。piggyBac转座子系统已被报道用于制备转基因小鼠,但这一方法是否能够提高转基因的表达成功率尚不清楚。为此,我们利用毛色基因agouti为报告基因,采用piggyBac转座子系统以C57/BL6小鼠为背景进行转基因小鼠的制备。结果表明,将piggyBac转座酶cRNA和转基因载体进行受精卵雄原核共注射后,转基因阳性率为18.4%,转基因表达率为88.89%,显著高于单独进行转基因载体DNA受精卵雄原核注射法。同时,利用agouti基因作为报告基因,可根据毛色变化直接对表达阳性的转基因小鼠进行初步筛选,提高了筛选效率。     

氯化钠密度梯度离心法制备用于显微注射的外源DNA片段

DNA显微注射是生产转基因动物最可靠和最常使用的一种方法,外源DNA的纯度对显微注射的成功起着至关重要的作用。本文介绍用氯化钠密度梯度离心的方法制备用于显微注射的外源DNA片段。与传统的琼脂糖凝胶回收的方法相比较,用此方法制备的外源DNA片段对小鼠受精卵进行显微注射后,受卵体母鼠的胚胎存活率,以及子代小鼠的外源基因整合率均有明显的提高。这一方法可为进一步提高转基因动物的成功率,提供方法学上的参考。 Abstract:DNA microinjection is the most popular and reliable method of producing transgenic animals.The purity of foreign DNA plays an important role for the success of microinjection.In this study,we introduced the use of sodium chloride step gradients in fractionating foreign DNA fragment for microinjection.The data demonstrated that,compared with the conventional agarose gel extraction method,NaCl purification scheme of toreign DNA could improve the treated embryo survival and foreign DNA intergration rate markedly.     

禽类的基因转移

动物基因转移技术用得最早最多的是微注射法,鱼类因是体外受精受精卵易于获取,哺乳动物则因受精卵原核较大易于进行遗传操作,所以,这两类动物的转基因研究起步较早,进展也很快。禽类因难于用微注射法直接对受精卵进行操作,故其转基因研究的进展较慢。最早进行禽转基因途径的尝试,是Pandey和Patehell(1982)用辐射处理精子,因此法转入的DNA是完全随机的,故难于实现目标基因的转移。Souza(1984)用反转录病毒作为载体,通过感染幼鸡而导入,使外源鸡生长激素(cGH)基因得到了表达,血浆cGH水平增高,但转基因鸡并无促生长效应。后来,Scanes和Leung(1986)给鸡注射外源cGH,发现试验鸡仅早期有增重效果,1月龄之后与对照组则无体重差异。故近年     

我国转基因动物研究概况

转基因动物是指用实验方法导入的外源基因在染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。自从80年代初美国科学家首次将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵雄性原核中,获得了个体比对照大一倍的转基因“超级鼠”后,转基因猪、鱼、兔和羊等相继问世,为动物基因工程育种提供了新的途径。本文仅就笔者收集到的资料对国内转基因动物的研究作一简要介绍。     

转基因动物技术及其若干问题

转基因动物是用基因工程技术,将外源目的基因经由生殖细胞或早期胚胎导入动物胚胎染色体基因组内,使之稳定整合并能传给后一代的动物。被导入的外源目的基因称为转基因。经转基因操作成功的受精卵或胚胎所发育的第一代个体称为首建者。1974年Jaenisch等首次报道应用显微注射法将SV40注入鼠胚胎获得第一例嵌合型转基因小鼠。至今,转基因动物     

利用雄性生殖细胞建立转基因动物的研究进展

随着科学研究的不断深入及临床治疗的需要,人们对转基因动物的需求越来越大;但是传统的转基因动物技术大多操作复杂、成本高、效率低,从而限制了转基因技术的广泛应用。利用雄性生殖细胞作为载体介导外源基因导入受精卵来建立转基因动物具有操作简便、经济、易于推广的优点,发展前景广阔。该文就利用雄性生殖细胞建立转基因动物的发展历程和方法进行系统的阐述和分析。从利用精子和精原干细胞携带外源DNA两个方向展开,分别分析和评价了恒温共孵育法、脂质体介导法、电穿孔法、胞浆内单精子注射法、输精管注射法、体外转染精原干细胞法以及体内转染精原干细胞法七种实验设计方法。     

转基因动物及其在医学中的应用

转基因动物是通过将外源目的基因导入受精卵或早期胚胎细胞中,使其稳定地整合到受体的基因组中,并得到表达的动物。这一技术已用来在哺乳动物的乳汁中生产贵重的治疗用蛋白,生产供人类移植用的器官,制造人类跗疾病的动物模型。其前景十分广阔。     

猪生长激素基因在金鱼中的整合、表达与生物活性(英文)

自Ｐａｌｍｉｔｅｒ于１９８２年首次将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵,培育出“超级鼠”以来,转基因动物技术获得迅速发展。本文以低等脊锥动物为实验动物,探讨猪生长激素基因导入金鱼受精卵后的整合与表达、生物学效应及后代遗传等问题,为进一步研究外源基因在高等脊椎动物（包括猪）内整合与表达的调控机理提供方法上的参考。实验结果表明：采用显微注射方法,将羊金属硫蛋白基因启动子与猪生长激素基因重组的线型ＤＮＡ（Ｆｉｇ．１）片段导入金鱼受精卵中,获得成活实验鱼,经斑点（Ｆｉｇ．２）,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交（Ｆｉｇ．３）,筛选ＰＧＨ阳性的转基因鱼作为亲本交配,分别得到Ｆ１代和Ｆ２代。经斑点、ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析（Ｆｉｇｓ．４,５＆６）及放射免疫检测（Ｔａｂ．１）,表明外源基因在部分受体鱼中得到整合和表达,并能通过有性繁殖传递给后代,且仍具生长效应（Ｆｉｇ．７;Ｔａｂ．２）。本实验获得的转基因阳性金鱼数量有限,且只传了两代,似乎不足以说明转基因金鱼后代表观特征的遗传稳定,但转基因金鱼Ｆ１代中存在外源基因整合位点纯合的个体是可能的。这为建立转基因动物纯系奠定了基础。     

双原核注射提高转基因的整合效率(英文)

本文提出了受精卵双原核注射方法,利用共注射具有部分同源区的两个片段鼠乳消酸蛋白基因 (WAP) 调控序列控制下的人粒细胞集落刺激因子 (G-CSF) (Fig.1),通过PCR和Southern Blot检测了8细胞期外源基因的整合(Fig.2)。结果表明,与单一原核注射相比较,双原核注射转基因的整合率由单一原核注射的48.68%提高至62.65%(Table 1)。这为转基因动物建立,提高外源基因整合率提供了新途径。     

转基因小鼠技术中获得原核期受精卵最适时间的研究

显微注射法是制备转基因动物的首选方法,而原核清晰受精卵的获得是影响显微注射成败的关键。本文对小鼠HCG超排注射后大最原核期受精卵获得的最佳时间进行了研究,以提高显微注射成功率。结果显示采集雄性原核清晰受精卵的最佳时间段为注射HCG后25～27h。     

双原核注射提高转基因的整合效率

本文提出了受精卵双原核注射方法,利用共注射具有部分同源区的两个片段-鼠乳消酸蛋白基因（WAP）调控序列控制下的人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）（Fig.l),通过PCR和Southern Blot检测了8细胞期外源基因的整合（Fig.2)。结果表明,与单一原核注射相比较。双原核注射转基因的整合率由单一原核注射的48.68%提高至62.65%(T able1)。这为转基因动物建立,提高外源基因整合率提供了新途径。