松材线虫和拟松材线虫体内细菌的透射电镜观察及分离鉴定

【目的】松材线虫是松树萎蔫病的病原,拟松材线虫在形态等方面与松材线虫极其相似。关于两种线虫与细菌的研究多集中于体表伴生细菌。本文要揭示松材线虫和拟松材线虫体内是否存在细菌。【方法】对松材线虫和拟松材线虫进行透射电镜观察;并采用1%升汞和抗菌素混合液对两种线虫虫体进行体表消毒后研磨,制备悬浮液涂布NA平板;通过生理生化测定和16S rDNA序列分析鉴定细菌种类。【结果】松材线虫和拟松材线虫透射电镜照片显示在两种线虫肠道内均发现细菌;体表无菌的松材线虫和拟松材线虫共分离到3株体内细菌;这3株细菌分别属于寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和爱文氏菌属(Ewingella)。【结论】松材线虫和拟松材线虫体内均存在细菌;这些细菌对这两种线虫可能具有一定的生理生态作用。本文是松材线虫和拟松材线虫体内存在细菌的首次报导。     

丝状真菌杀松材线虫代谢产物研究进展

松材线虫病是破坏我国森林生态系统最为严重的病害,具有极强的传播性和破坏性,防治此种病害迫在眉睫。基于对物理和化学方式防治松材线虫的研究,对环境友好度最高的生物防治具有更广的研究前景。丝状真菌及其次级代谢产物,来源于自然,与传统的化学杀线虫药剂相比,对环境影响较小,针对松材线虫的致死作用更为专一,因此,从丝状真菌的次级代谢产物中分离获得杀松材线虫活性产物并测定其结构和活性,对于松材线虫病的防治具有重要意义。本文对丝状真菌产生的具有杀松材线虫活性产物的结构、活性展开综述,发现近二十年共有57个活性产物被发现,且结构多种多样,活性差别较大,为了更好地开展此领域的研究,本文对所有产物的结构和活性进行了系统总结,最后又对该领域的研究进行了总结和展望,以期对松材线虫病的生物防治和丝状真菌杀松材线虫次级代谢产物的深入研究提供参考。     

松材线虫生防细菌的筛选、鉴定及其毒性因子的初步研究

从河南南阳不同农田的植物根部采取土壤样本,共分离获得了198株细菌。通过毒性测试和平板生测从中筛选出松材线虫生防细菌6株,其中NS-3菌株对松材线虫的杀灭活性最高。结合该菌株的形态学、生理学特征及16S rDNA序列分析等结果将该菌株归为芽孢杆菌属,命名为Bacillus sp.strain NS-3。将该细菌液体培养的上清液和上清蛋白粗提物分别处理松材线虫48h后线虫的死亡率分别达到50%和100%;线虫死亡后虫体消解。然而,细菌的上清蛋白粗提物经煮沸变性后,基本丧失了对松材线虫的侵染活性,结果显示细菌Bacillus sp.strain NS-3的杀线虫活性物质主要要存在于细菌培养上清液中,并且为热不稳定性物质。     

植物根际益生细菌代表性菌株贝莱斯芽孢杆菌FZB42对松材线虫的抑杀性

[目的]由松材线虫导致的松树萎蔫病是松树的毁灭性病害,也是我国最主要的林业病害之一.本研究测评了在农业上广泛使用的、我国微生物肥料行业主要菌种资源之一——贝莱斯芽孢杆菌,对松材线虫的潜在抑杀性能.[方法]选用贝莱斯芽孢杆菌的代表性菌株FZB42为材料,测定对不同条件下的菌液上清、不同菌株的菌液上清、细菌素plantaz...     

北部湾徐闻海域红树内生细菌物种多样性及其杀线虫活性研究

为发掘红树植物内生细菌资源和寻找新型微生物杀虫剂,该研究从北部湾徐闻海域采集7种红树植物共16份样品,设计10种分离培养基,使用稀释涂布法分析红树植物内生细菌的分布特征,通过16S rRNA分子生物学方法对内生细菌进行多样性分析,并利用秀丽隐杆线虫模型,通过杀线虫活性实验测试内生细菌乙酸乙酯提取物的杀线虫活性。结果表明:(1)从16份红树植物各组织器官中获得33株内生细菌,分布于19个科23个属。其中,芽孢杆菌属(Bacillus)为优势菌属,并发现了10株潜在的新种或新属。(2)筛选到具有显著杀线虫活性的菌株IMDGX 4725和IMDGX 4744,半数致死浓度(LC₅₀)分别为61.58、100.89mg·mL^-1。研究结果证实了徐闻海域红树具有多样性丰富的内生细菌,同时部分细菌具有较强的杀线虫活性,具有发现新型微生物杀虫剂的潜力。     

松材线虫的天然毒素研究进展

概述了松材线虫病的现行防治措施及存在问题,介绍了植物源和真菌源天然毒素毒杀松材线虫的研究现状及研究中遇到的问题,指出天然毒素在未来松材线虫病生物防治中的研究方向。     

松材线虫伴生菌中产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及其相关基因的克隆

[目的]从松材线虫伴生菌中筛选出高效降解纤维素的细菌菌株,初步鉴定后,对其相应的纤维素酶基因尝试克隆.[方法]首先从河南南阳松材线虫病疫区采集到的木材样本中,分离获得松材线虫.采用刚果红平板初筛法,从松材线虫伴生菌中获得具有分泌较高活性纤维素酶的细菌菌株.基于该菌株的形态学、生理学及16 s rDNA序列特征等对高活性菌株进行分类鉴定.设计兼并引物,从高活性菌株中克隆该菌株的纤维素酶基因,并进行序列分析.[结果]获得7株具有分泌较高活性纤维素酶的细菌菌株,其中编号为C8的菌株酶活最高.经鉴定该菌株归为肠杆菌属,命名为Enterobacter sp.C8.进一步从C8菌株中成功克隆出该菌株的一个全长1104 bp的纤维素酶基因(GenBank JQ845065),在NCBI比对后发现该基因分别与产气肠杆菌( Enterobacter aerogenes) KCTC 2190的纤维素合成酶亚单位BcsC的核苷酸序列有97％的同源性,氨基酸序列有92％的同源性 ;与克雷白氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)的endo-1,4-D-glucanase基因有82％的同源性,与不可培养的细菌内切纤维素酶基因有82％的同源性.[结论]本文首次从松材线虫伴生菌中筛选到了一株简单的产纤维素酶的细菌菌株并从中克隆出了一个新型纤维素酶基因,为下一步进行新能源的利用奠定了理论基础.     

杀线虫放线菌DA09202的鉴定及其活性物质的解析

从海南热带植物园土壤样品中分离获得一株具有较强杀线虫活性的放线菌菌株DA09202,通过形态特征、生理生化特征、16SrDNA序列测定及其系统发育分析,初步鉴定为金色链霉菌。菌株DA09202发酵液采用溶媒萃取、硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶过滤和制备薄层板层析,从中分离得到杀线虫活性化合物A23-1和A46-2。化合物A23-1经光谱和波谱分析(UV、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1HCOSY、HMBC、HSQC)以及文献对照,鉴定为4′,7-二羟基异黄酮,化合物A46-2的结构正在鉴定中。     

杀松材线虫的两株野生担子菌

为了筛选有效的杀松材线虫野生担子菌菌株,以期用于开发安全高效杀松材线虫生防制剂,从野外采集担子菌子实体,采用常规组织分离法获得纯培养菌株303株,以全齿复活线虫Panagrellus redivivus作靶标进行皿内菌丝杀线虫活性测定,获得2株高活性的菌株BSN003和BSN034,结合形态学和ITS序列分析,将菌株BSN003鉴定为Neonothopanus nambi,菌株BSN034鉴定为棕榈微皮伞Marasmiellus palmivorus;两菌株的菌丝在平板上对松材线虫Bursaphelenchus xylophilus均有较强的杀线虫能力,在长有菌落的CMA平板上接种松材线虫48h,菌株BSN003处理线虫的死亡率为100%,菌株BSN034处理线虫的捕食率为93.6%。本研究表明N. nambi和棕榈微皮伞是松材线虫生物防治的潜在资源。     

微杆菌Sneb159杀线虫活性物质的分离与鉴定

【目的】有关Microbacterium maritypicum在植物线虫生物防治方面的研究较少,探究菌株M. maritypicum Sneb159的杀线虫活性,明确菌株发酵液中具有杀线虫活性的物质,为生物农药的开发提供理论依据。【方法】本研究检测了菌株Sneb159发酵液对大豆胞囊线虫二龄幼虫的触杀活性;并以触杀活性为追踪,采用有机溶剂萃取、硅胶柱层析及半制备高效液相色谱等技术对菌株Sneb159发酵滤液中的活性物质进行分离纯化;采用核磁共振波谱对纯化物进行结构鉴定。【结果】菌株Sneb159具有杀线虫活性,在24 h和48 h处理组中线虫的死亡率均显著高于对照组。从菌株Sneb159发酵滤液中分离得到杀线虫活性物质A6,经结构鉴定确定该物质为苯乙酰胺。【结论】首次发现M. maritypicum对大豆胞囊线虫的触杀作用,并且明确活性物质为苯乙酰胺。结果表明菌株M. maritypicum Sneb159和苯乙酰胺在大豆胞囊线虫的生物防治方面具有较好的应用潜力。     

携带松材线虫对松墨天牛成虫肠道和气管细菌的影响

【目的】探究被松墨天牛Monochamus alternatus携带的松材线虫Bursaphelenchus xylophilus对松墨天牛肠道和气管细菌的影响。【方法】野外采集携带松材线虫的松墨天牛成虫后,取出完整肠道和气管进行细菌总DNA抽提后进行16S rDNA基因测序并拼接,并利用生物信息学方法分析松墨天牛成虫肠道和气管细菌组成、结构、丰度和多样性。【结果】携带松材线虫的松墨天牛成虫肠道和气管细菌菌群共检测到15门26纲66目110科201属296种,可操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)数目为444。携带松材线虫的松墨天牛成虫比未携带松材线虫的松墨天牛成虫肠道优势细菌菌群变化不显著,均为变形菌门(Proteobacteria)肠杆菌目(Enterobacterales);携带松材线虫的松墨天牛成虫气管优势细菌菌群为变形菌门肠杆菌目,未携带松材线虫的松墨天牛成虫气管优势细菌菌群为厚壁菌门(Firmicutes)乳杆菌目(Lactobacillales)。携带松材线虫的松墨天牛成虫较未携带松材线虫的松墨天牛成虫气管细菌多样性和丰度升高,细...     

三株芽胞杆菌菌株对松材线虫低温存活与繁殖的影响

为明确细菌在松材线虫生态适应性中的作用,本研究选择与致病相关的松材线虫伴生细菌GD1、马尾松内生细菌GD2以及具有杀松材线虫活性的湿地松内生细菌NJSZ-13为试验对象,测定经这3株芽胞杆菌菌株3个浓度低温驯化10、15和20 d后,在冷冻条件下松材线虫强毒虫株AMA3、中毒虫株AA3和弱毒虫株YW4的存活率和繁殖量。结果表明：低温驯化15 d和20 d后3株菌株对不同毒力线虫的活力影响较驯化10 d后的更显著。在低温驯化15 d、-20℃冷冻处理1 h后,5×10⁶ CFU/mL浓度菌株GD1处理下,虫株AMA3、AA3和YW4的存活率分别为77.22%、83.68%和84.26%,与对照差异显著;5×10⁵ CFU/mL浓度菌株GD1处理下,虫株AMA3、AA3和YW4的存活率分别为75.76%、80.67%和81.50%,与对照差异显著。5×10⁶ CFU/mL和5×10⁵ CFU/mL浓度菌株GD2处理下,与GD1处理组结果相似,菌株NJSZ-13处理组则与菌株GD1和GD2的结果相反。低温驯化15 d、-20℃冷冻处理1 h后,5×10⁶ CFU/mL浓度菌株GD1处理下,虫株AMA3、AA3和YW4的繁殖量分别为7 530、9 317和12 793条/皿,与对照（3 192、3 840和5 823条/皿）差异显著;5×10⁵ CFU/mL浓度菌株GD1处理时,3个虫株的繁殖量均与对照差异显著。而菌株GD2和NJSZ-13处理后,3个虫株的繁殖量均无显著变化。表明不同芽胞杆菌对松材线虫的低温适应性影响存在差异,松材线虫伴生细菌GD1和马尾松内生细菌GD2能增强其低温适应性,而湿地松内生细菌NJSZ-13菌株则相反。     

瑞香狼毒根中异新狼毒素A和新狼毒素B对松材线虫和拟松材线虫的触杀活性研究

从瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)根乙醇提取物中分离得到了两个二氢黄酮类化合物,结合核磁共振波谱学数据解析,确定其结构为异新狼毒素A(isoneochamaejasmin A)和新狼毒素B(neochamaejasmin B)。并采用实验室活体生物试验方法,研究了这两个化合物对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)和拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)二龄幼虫的触杀活性。结果表明,异新狼毒素A和新狼毒素B对两种线虫均具有一定的触杀活性,且在相同的处理时间和浓度下,新狼毒素B对两种线虫的触杀活性均强于异新狼毒素A。     

一株北里孢菌株的分离鉴定及其对松材线虫的致病性

【目的】筛选、鉴定出对松材线虫杀灭活性较高的放线菌菌株,并确定生防菌株的毒力因子。【方法】采用平板活性测试及代谢杀虫活性检测方法进行筛选,采用形态学及16S rDNA序列分析等进行鉴定。对发酵液中的活性物质稳定性分析后,利用醇沉、萃取、层析、气相色谱/质谱分析等方法分离纯化出杀虫毒力因子。【结果】从河南南阳宝天曼的腐木及枯枝落叶样品中共分离获得了79株放线菌,从中筛选出对松材线虫有灭活作用的放线菌6株,其中分离株C620菌株对松材线虫的灭活性最高:该菌株的发酵液处理松材线虫48、60 h后线虫的死亡率分别达到60.0%、81.5%。结合该菌株的形态学、生理学特征及16S rDNA序列分析等结果将其归为北里孢菌属中的一个种,菌株编号Kitasatospora sp.strain C620。该菌株的发酵液中杀线虫活性物质的热稳定性、光稳定性及耐储藏性均较强,在中性偏碱性环境较稳定;经pH纸电泳层析初步确定该物质属于碱性水溶性物质。对菌株C620发酵液分离纯化,得到活性化合物为1-苯基-3-(2-吡啶)-5-吡唑啉酮。【结论】获得一株松材线虫高效生防菌Kitasatospora sp.strain C620,其活性物质为1-苯基-3-(2-吡啶)-5-吡唑啉酮。     

松材线虫及其关键传媒墨天牛的研究进展

松材线虫Bursaphelenchusxylophilus (Steiner&Buhere,1 93 4Nickle,1 981 )是一种世界多国公认的重大外来生物。其原产地在美国 ,但松材线虫并不严重危害该国松林 ;日本受害最重 ,经过几十年的研究与防治 ,现已基本能控制松材线虫病大发生。自 1 982年我国南京中山陵首次发现松材线虫以来 ,其在我国的扩散趋势越来越明显 ,现已成为我国一种重要入侵病原生物。它不但对我国南方数百万公顷松林构成毁灭性威胁 ,影响我国经济和社会可持续发展 ,而且将破坏我国一些著名风景名胜区、文化遗产地。同时 ,松材线虫正成为一项技术壁垒 ,严重影响我国的进出口贸易。该文简要从松材线虫及其关键传煤墨天牛Monochamusspp .的生物学特性、分布状况 ,松材线虫病的蔓延条件及影响因素等方面概述国内外的研究动态 ,以期为我国对松材线虫的研究与防治工作提供参考     

松材线虫伴生细菌多样性的宏基组分析

摘要：【目的】松材线虫是松材线虫病的病原,且与其伴生细菌之间存在互作关系,它们构成一个微生态系统。本研究旨在揭示松材线虫-伴生细菌群落细菌多样性。【方法】采用16S rRNA基因文库和454测序对伴生细菌群落的宏基因组进行初步分析。【结果】依据97％序列相似性划分OTU（Operational Taxonomic Unit）,构建的16S rRNA文库包含25个OTU,分别属于Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria和Bacter     

不同致病力松材线虫和拟松材线虫种群繁殖对温度的响应

为探讨松材线虫Bursaphelenchus xylophilus和拟松材线虫Bursaphelenchus mucronatus在菌食和植食阶段的种群繁殖力对环境温度的响应及其与种群致病力的关系,本研究对不同致病力的松材线虫和拟松材线虫,通过单异活体培养(菌食)和接种寄主黑松(植食)两种方式,探讨了不同温度条件下线虫种群孵化率、繁殖量和后代性比等繁殖参数的变化情况。结果表明,在单异活体培养时,供试的松材线虫强毒和弱毒虫株以及拟松材线虫有毒和无毒虫株在25℃下均具有最高的卵孵化率;不同致病力的松材线虫和拟松材线虫种群具有不同的最适生长温度,松材线虫强致病力虫株ZJ在35℃出现最大繁殖量,弱致病力虫株YW4在30℃下繁殖最多,而拟松材线虫无致病力虫株JNL10和有致病力虫株15#则在25℃下繁殖量较大。但总体来看,在25～35℃下,松材线虫ZJ虫株和YW4虫株繁殖量无显著性差异,而拟松材线虫JNL10虫株和15#虫株的繁殖量具有显著差异。在寄主体内,15～20℃时松材线虫ZJ虫株和YW4虫株繁殖量无显著性差异,25～35℃时,松材线虫ZJ虫株的繁殖量明显高于YW4虫株;而在各个温度下,拟...     

双层分离法人工培养松材线虫

依据松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的生长习性,设计了一种将松材线虫和灰葡萄孢菌丝进行一定程度分离的人工培养松材线虫新方法,使松材线虫繁殖力、寿命等参数得到更准确地测量。实验中分别用双层分离法和浅盘法对雌虫的参数进行测定,雌虫的平均寿命分别为9.3 d和9.6 d,平均产卵期分别为7.1 d和7.9 d,平均子代数量分别为69.9和68.9,两种方法间没有显著性差异,证明了新方法的可靠性。此外,实验测得用双层分离法培养的松材线虫的子代发育率为60%,雌雄性别比为2.4∶1。较高的雌性比例可以导致较高的净生殖率,从而得到较高的种群增长率。同时用双层分离法对产卵和不产卵的雌虫的寿命进行了比较,结果表明不产卵的雌虫有更长寿命,证明"繁殖的代价"也存在于松材线虫中。     

一株解磷细菌的筛选、鉴定及其溶磷培养条件的优化

从土壤作物根际筛选分离出的一株解磷能力较强的溶磷菌P0417,对其进行16S r DNA基因水平上的初步鉴定,测定其溶解磷的能力,并对该菌的溶磷培养基条件进行优化。结果表明,经序列分析,确定该菌株P0417为洋葱伯克霍尔德氏菌。且其溶磷能力与培养液p H呈显著相关性,当培养基条件为葡萄糖10 g/L、草酸铵0.5 g/L、Na Cl 1.0 g/L时,菌株P0417对Ca3(PO4)2盐培养基具有较好的解磷能力,其解磷能力可达791.84μg/m L。     

松材线虫与伴生微生物的生态关系

松材线虫是重要的外来有害生物,造成松树大量死亡,带来严重的经济损失和生态破坏.松材线虫与伴生微生物存在密切的生态关系.本文综述了松材线虫伴生微生物的种类及其在松材线虫繁殖和致病过程中的重要生态作用,从微生态系统角度对松材线虫病进行探讨.伴生真菌能为松材线虫提供食物,维持松材线虫次生侵染循环,提高分散型第三龄幼虫在种群中的比例,利于松材线虫侵染扩散;伴生细菌能够提高松材线虫致病性,促进其繁殖,并菌有助于松材线虫降解松萜类物质,从而提高松材线虫的适应性.