表达中东呼吸综合征冠状病毒S蛋白的重组痘苗病毒的构建及免疫效果初步评价

目的:以痘苗病毒天坛株为载体,构建表达中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)S蛋白的重组病毒疫苗,并进行免疫效果评价。方法:通过PCR扩增获得去除跨膜区的S蛋白基因片段SQ,并构建重组痘苗病毒载体质粒p JSC11Lac Z7.5SQ,将重组质粒与痘苗病毒同源重组并单斑纯化获得重组病毒毒株RVVMERS-SQ,重组病毒免疫小鼠后用酶联免疫吸附实验(ELISA)和假病毒微量中和实验检测其诱发的S蛋白体液免疫反应水平。结果:构建了表达MERS-Co V去跨膜区S蛋白的重组病毒RVVMERS-SQ,其免疫小鼠后诱发了强的S蛋白体液免疫反应,血清Ig G抗体滴度为1∶3200,中和抗体滴度达到1∶1000。结论:重组痘苗病毒RVVMERS-SQ可在BALB/c小鼠体内诱发强的免疫反应,为MERS-Co V疫苗的研发提供了实验基础。     

中东呼吸综合征疫苗研究进展

中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome,MERS)是由中东呼吸综合征冠状病毒(MERS Coronavirus,MERS-CoV)引起的一种呼吸系统疾病。目前该病已经蔓延到全球25个国家,造成1400余人感染,近500人死亡,并有4个国家报道骆驼感染MERS病例。研发相关疫苗成为预防该病非常重要的措施。研究人员在病毒载体、重组蛋白、DNAs、纳米粒子、MERS-CoV重组的基础上进行了大量的候选疫苗开发,其中一些还在实验动物身上进行了效果试验。本文就当前一些候选疫苗研究进展进行总结概括,以期更多人力物力投入到研发安全有效的疫苗当中。     

中东呼吸综合征冠状病毒假病毒系统的建立及其在中和抗体检测中的应用

目的:为了避免中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染与中和试验中操作活病毒带来的生物安全隐患,构建只具有一次感染能力而无复制能力的MERS假病毒,建立MERS假病毒系统,并应用于中和抗体检测。方法:构建含有MERS-CoV S基因的重组质粒pcDNA3.1-MERS-S,与缺失Env基因、含有萤光素酶报告基因的HIV-1骨架质粒pNL4-3.Luc.RE共转染293T细胞,收获含有假病毒的上清;通过Western印迹、细胞感染实验和血清中和试验,确定是否包装出MERS假病毒,及是否能有效应用于细胞感染与中和试验。结果:MERS假病毒pMERS-S培养上清经Western印迹鉴定出相对分子质量为25×103的HIV-1 P24蛋白和相对分子质量为180×103的MERS-CoV S蛋白;与阴性对照假病毒pEnv-相比,pMERS-S能有效感染MERS-CoV敏感细胞系Huh-7,在感染细胞中产生荧光信号,感染细胞的假病毒量与产生的荧光信号呈明显的量效关系;在MERS假病毒中和试验中,pMERS-S能被MERS-CoV中和抗体中和而失去感染力,反映抗体对MERS-CoV的中和活性。结论:建立了不依赖于BSL-3高等级生物安全条件的MERS假病毒系统,并有效应用于中和抗体检测,为MERS-CoV疫苗、药物评价及病毒致病机制研究提供了良好的技术支撑手段。     

环介导逆转录等温扩增技术检测中东呼吸综合征冠状病毒基因

建立了基于浊度仪和羟基萘酚蓝(Hydroxy naphthol blue,HNB)颜色变化的简单、快速和灵敏的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)检测方法,应用于中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)的检测。针对MERS-CoV的核衣壳蛋白基因(Nucleocapsid,N)设计6条特异引物,在等温条件下(63℃)进行60min扩增反应。通过实时浊度仪记录扩增曲线和扩增前在反应体系中加入HNB观察颜色变化两种方式进行检测结果判定。本文对不同人类冠状病毒及常见呼吸道病毒进行了特异性验证,对梯度稀释的体外转录MERS-CoV全N基因RNA进行了定量和检测限分析,同时与已发表的实时荧光定量PCR(rRT-PCR)进行比较。结果显示,本研究建立的RT-LAMP方法特异性高,对于每反应管103至106的拷贝数RNA,出峰时间与每反应管N基因RNA拷贝数对数值有稳定的线性关系。基于浊度仪和颜色判定的RT-LAMP检测方法检测限分别为500拷贝和1 000拷贝。因此,该方法有望应用于MERS-CoV感染的快速筛选,具有在基层医疗卫生机构和现场推广和应用的潜力。     

严重急性呼吸综合征、中东呼吸综合征和2019冠状病毒病治疗研究进展

严重急性呼吸综合征2019(sever acute respiratory syndrome,SARS)、中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome,MERS)和2019冠状病毒病(corona virus disease 2019,COVID-19)对全世界人民造成了严重的经济损...     

中东呼吸综合征冠状病毒S1蛋白在昆虫细胞中的重组表达及免疫效果评价

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统重组表达中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)S1蛋白,并对其免疫效果进行评价。方法:构建含有MERS-Co V S1基因的重组杆状病毒质粒,转染Sf9细胞包装杆状病毒;重组病毒传代3次获得种子病毒,感染Sf9细胞,收获感染上清,通过镍离子亲和层析纯化获得S1重组蛋白;用纯化的S1蛋白免疫BALB/c小鼠,采用ELISA检测免疫小鼠血清抗原特异性的抗体水平;采用假病毒中和试验检测血清中抗体的中和活性。结果:获得了表达MERS-Co V S1蛋白的重组病毒株,在昆虫细胞中表达并纯化了S1重组蛋白;利用重组表达的S1蛋白免疫小鼠3次,血清S1特异性Ig G抗体滴度可达1∶102 400,免疫小鼠血清稀释至1/5120后中和百分比仍达50%以上。结论:利用昆虫细胞重组表达的MERS-Co V S1蛋白具有良好的免疫原性,并能有效诱导产生高滴度中和抗体,为发展MERS-Co V重组蛋白疫苗奠定了基础。     

中东呼吸综合征冠状病毒RT-RAA快速检测方法的建立及应用

建立基于重组酶介导的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)核酸检测方法。本研究设计、合成特异性中东呼吸综合征冠状病毒基因的重组酶介导检测(RAA)引物及探针,制备MERS-CoV假病毒颗粒阳性对照品,通过一系列条件优化建立了MERS-CoV的快速、灵敏、特异的RT-RAA检测方法,分别与荧光定量RT-PCR检测方法做比较,并且采用首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品、其它类似呼吸道病毒样本以及英国QCMD的MERS-CoV室间质评灭活样本做临床验证。结果显示:建立的RT-RAA方法检测中东呼吸综合征冠状病毒灵敏度为10拷贝,高于本实验室建立的荧光RT-PCR方法灵敏度(100拷贝),且检测时间(4.8～13.6min)大大低于荧光RT-PCR检测时间(90min);用该方法检测中东呼吸综合征冠状假病毒颗粒为阳性,而检测其他8种对照呼吸道病毒均呈阴性;检测临床阳性样本也与实际结果相符。本研究建立的中东呼吸综合征冠状病毒RT-RAA检测方法灵敏、特异、快速,可用于中东呼吸综合征冠状病毒感染的现场快速诊断和流行病学调查。     

中东呼吸综合征冠状病毒多重荧光定量RT-PCR检测技术的建立

建立中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染的筛查与诊断应用的核酸检测方法。本研究建立了基于MERS-CoV三个分子靶标(upE,ORF1b,N2)的双重以及三重的三种荧光定量RT-PCR检测技术方法,分别与前期建立的单重荧光定量RT-PCR(upE或N2)检测方法做了比较,并且采用MERS-CoV病毒毒株、上海提供的口岸发烧病人样本以及由首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品和全血的样品做了临床验证。结果显示:采用MERS-CoV病毒毒株作为模板,三种新建立的多重检测方法与单重荧光定量RT-PCR检测方法最低检测限均能达到10PFU/mL,且与其他常见呼吸道病毒的阳性样本均无交叉反应,特异性良好。对临床样品的验证中,上海病人咽拭子样本均为阴性,而中国首例MERS输入病例的急性期咽拭子样品均为阳性,而全血样的检测结果显示N2靶标有较高检出率,明显优于基于upE单一靶标。本研究所建立的基于MERS-CoV三个分子靶标(upE,ORF1b,N2)的双重以及三重荧光定量RT-PCR检测技术方法用于MERS-CoV感染的实验室诊断,具有较高灵敏度与特异性及适用性。     

高致病性中东呼吸综合征冠状病毒识别细胞受体分子机制的破译

冠状病毒属巢状病毒日（Order：Nidovirales）冠状病毒科（Family：Coronaviridae）冠状病毒属（Genus：Coronavirus）,为一类具囊膜的RNA病毒。     

中国首例输入性中东呼吸综合征冠状病毒结构基因与附属基因的序列分析

针对中国首例实验室确诊输入性MERS-CoV感染病例,采用鼻咽拭子样品进行核酸提取、基因扩增与测序,获得MERS-CoV_ChinaGD01结构蛋白与附属蛋白编码基因,包括S基因、E基因、M基因、N基因、ORF3、ORF4a、ORF4b、ORF5和ORF8b基因序列。根据S基因进化分析发现中国输入性病例中MERS-CoV虽有少数位点变异,但仍与近年沙特流行株相近,属于MERS-CoV亚型5,N、E、M等结构基因核苷酸变异较少。附属蛋白进化分析表明:ORF3、ORF4a、ORF4b、ORF5均有一定的核苷酸替换,而ORF8b相对保守。总之,中国首例输入性MERSCoV与已发表序列相比总体表现为保守,但在部分基因序列上有一定的变异。这是中国首例输入性MERS-CoV的第一次基因分析结果报道,可为该MERS-CoV感染特点的进一步研究及相关疾病的防控提供参考。     

2019新型冠状病毒及其诊疗与防控：回顾与展望

2019新型冠状病毒的暴发持续至今,导致了世界各地数以百万计的感染个例,更夺去了数十万人的生命.世界卫生组织在2020年2月将此病毒引起的疾病定名为2019冠状病毒病(Coronavirus disease 2019,COVID-19),而国际病毒分类委员会也将此病毒命名为SARS-CoV-2. COVID-19的典型...     

真核表达MERS-CoV刺突蛋白亚单位的信号肽序列优化研究

中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)的刺突蛋白(Spike,S)亚单位1(S1)是引起宿主免疫反应和产生中和抗体的主要靶抗原,也是疫苗研发和病原检测的重要靶标,选用适宜的真核表达系统高效表达S1蛋白是进行相关研究的基础。为确定MERS-CoV S1在哺乳动物细胞中高效分泌性表达的信号肽序列,构建了含高斯荧光素酶(Gaussia luciferase,GLuc)、人组织纤溶酶原激活剂(Tissue plasminogen activator,tPA)及小鼠免疫球蛋白G的2a亚型(Mouse immunoglobular G subtype 2a,MIgG2a)7个信号肽(原始序列和改造序列)序列的MERS-CoV S1表达质粒,瞬时转染细胞后,通过Western Blot检测并比较细胞培养上清和裂解液中S1的表达水平及分泌表达效率(条带密度灰度扫描比),并对哺乳动物细胞表达的S1蛋白的纯度与抗原特性进行了分析。结果表明7种信号肽在293T、BHK21和ExpiCHO-S^TM三种细胞系统中介导MERS-CoV S1的高效分泌表达的效率各有不同,其中tPA-1信号肽介导S1抗原在ExpiCHO-S^TM中具有较高的分泌表达效率与产量,纯化的S1蛋白保持了较好的抗原性。本研究为进一步研发基于MERS-CoV S1的亚单位疫苗及免疫学检测试剂奠定了基础。     

二肽基肽酶4为人类中东呼吸道综合征冠状病毒MERS-CoV功能性细胞受体

中东呼吸道综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV）是继SARS冠状病毒（SARS-CoV）之后新近出现的又一种能够引发严重呼吸道感染的人类新发冠状病毒. MERS-CoV于2012年9月首次在中东一些国家被发现,截至2013年9月7日,MERS-CoV已经引起114例感染病例,其中54人死亡,死亡率约50%. 病毒受体研究为MERS-CoV等人类新发冠状病毒进化和跨种传播机制提供重要依据．最近,Raj等在Nature发表文章,首次报道了二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4,DPP4;又名CD26）为MERS-CoV感染细胞的功能性受体．MERS-CoV功能性受体的发现为人类新冠状病毒溯源和跨种进化研究、病毒传染和流行病学特征分析以及抗病毒药物和疫苗研究提供重要基础.     

Characterization of HCoV-229E fusion core: implications for structure basis of coronavirus membrane fusion

Human coronavirus 229E (HCoV-229E), a member of group I coronaviruses, has been identified as one of the major viral agents causing respiratory tract diseases in humans for nearly 40 years. However, the detailed molecular mechanism of the membrane fusion mediated by the spike (S) protein of HCoV-229E remains elusive. Here, we report, for the first time, a rationally designed fusion core of HCoV-229E (HR1-SGGRGG-HR2), which was in vitro produced in GST prokaryotic expression system. Multiple lines of experimental data including gel-filtration, chemical cross-linking, and circular diagram (CD) demonstrated that the HCoV-229E fusion core possesses the typical properties of the trimer of coiled-coil heterodimer (six alpha-helix bundle). 3D structure modeling presents its most-likely structure, similar to those of coronaviruses that have been well-documented. Collectively, HCoV-229E S protein belongs to the type I fusion protein, which is characterized by the existence of two heptad-repeat regions (HR1 and HR2), furthermore, the available knowledge concerning HCoV-229E fusion core may make it possible to design small molecule or polypeptide drugs targeting the membrane fusion, a crucial step of HCoV-229E infection.