发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3所产鼠李糖脂结构及性能的影响

为研究发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3所产鼠李糖脂结构及性能的影响,从鼠李糖脂的结构组分、性能和应用效果等方面展开研究。薄层实验证明两种鼠李糖脂均含有单糖脂和双糖脂。液质分析发现以橄榄油作碳源时,鼠李糖脂中双糖脂(Rha-Rha-C5-C6:1和Rha-Rha-C8-C8:2)比例更大,约为73.09%。而地沟油作碳源时,单糖脂(Rha-C10-C10和Rha-C16-C16:2)的比例更高,约为76.91%。橄榄油和地沟油为碳源的鼠李糖脂的临界胶束浓度(CMC)分别为55 mg/L和80mg/L。相同投加量时,前者乳化性和乳化稳定性均优于后者。NY3菌降解含油污泥时,投加双糖脂含量高的鼠李糖脂会使C16-C30直链烷烃的去除率更高。     

以甘油为底物鼠李糖脂高产菌株的诱变选育

通过诱变选育,将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)RG-14利用甘油发酵生产鼠李糖脂产量由13.6g/L提高到16.5 g/L。突变株经过5次连续传代培养,菌株仍维持稳定的鼠李糖脂产量,表明该菌株具有较好的遗传稳定性。利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术分析诱变后菌株发酵甘油生产鼠李糖脂的组成,结果显示鼠李糖脂由Rha-C8-C8、Rha-C8-C10、Rha-C10-C10、Rha-C10-C12∶1、Rha-C10-C12、Rha2-C8-C10、Rha2-C10-C10、Rha2-C10-C12∶1和Rha2-C10-C12组成,其中单、双鼠李糖脂的相对丰度分别为54.8%和45.2%。当以工业粗甘油代替精甘油为底物时,该菌株鼠李糖脂产量达到14.2 g/L,表明其具有较好的应用潜力。     

产鼠李糖脂生物表面活性剂大肠杆菌的构建与优化

目前鼠李糖脂生物表面活性剂主要由条件致病的铜绿假单胞菌生产获得,从而影响工业应用。为了开发一种相对安全的鼠李糖脂生产菌,将带有不同强度组成型合成启动子的鼠李糖基转移酶基因(Rhamnosyltransferase gene,rhl AB)以单、中、高3种拷贝数分别在大肠杆菌ATCC 8739中异源表达,实现了不同产量的鼠李糖脂异源合成。对rhl AB基因和rha BDAC基因簇(TDP-L-鼠李糖合成的基因簇)进一步利用合成启动子进行组合调控,筛选获得了最优生产鼠李糖脂工程菌——大肠杆菌TIB-RAB226。对大肠杆菌TIB-RAB226进行发酵温度优化,鼠李糖脂产量达到124.3 mg/L,是优化前的1.17倍。通过分批补料发酵,12h时鼠李糖脂产量达到209.2 mg/L。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的5类质核比不同的鼠李糖脂同系物。本研究可为异源合成产鼠李糖脂提供重要参考。     

以抽油烟机废油为原料发酵产鼠李糖脂的研究

鼠李糖脂是一种具有巨大潜力的阴离子生物表面活性剂,可应用于石油、食品、农业、日化工业等领域。探讨以抽油烟机废油为碳源发酵产鼠李糖脂的可能性,以铜绿假单胞菌WB505为出发菌体,在7 L发酵罐中鼠李糖脂的产量达到12.3±0.52 g/L。利用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析出所产鼠李糖脂的组成,结果显示其主要含Rha-C_(10)-C_(10)和Rha_2-C_(10)-C_(10),其中单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的总相对丰度分别为49.7%和50.3%。所产鼠李糖脂的临界胶束浓度(CMC)为45.0 mg/L,能将表面张力从60.5±0.81 mN/m降至25.3±0.68 mN/m,乳化系数E24均60%,并且对苯的乳化系数达到80.3±0.85%。以抽烟机废油为底物生产鼠李糖脂降低底物成本,为抽油烟机废油提供一种循环再利用处理方式。     

铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂菌株的筛选

从多种来源筛选高产鼠李糖脂的菌株,并研究菌种发酵特性和鼠李糖脂产物的理化性质。采用CTAB平板初步筛选鼠李糖脂合成菌株,通过分析菌株的16S r RNA基因序列确定细菌种属,采用薄层色谱、红外光谱分析产物性质。结果显示,利用CTAB平板初筛获得163株阳性菌株,初步发酵确定10株高产细菌鼠李糖脂的产量为12.2-17.7 g/L,10株细菌均鉴定为铜绿假单胞菌。挑选产量最高的菌株B12,分别以甘油、菜籽油、花生饼粉或葵花籽饼粉为碳源进行发酵,发现菜籽油为合成鼠李糖脂的最佳碳源。进一步对比在35℃、37℃和40℃的发酵水平,发现37℃条件下鼠李糖脂产量最高,为26.8 g/L。最后,对鼠李糖脂发酵产物进行了初步纯化,并进行了薄层色谱和红外光谱分析。菌株B12能够合成较高水平的鼠李糖脂,可能成为工业生产的候选菌株。     

响应曲面法优化铜绿假单胞菌DN1的产鼠李糖脂条件

鼠李糖脂是近年来具有广阔应用前景的生物表面活性剂之一,因应用范围广和环境友好等特点,使其成为潜在的合成表面活性剂的替代品。本研究以一株能产生鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DN1为研究对象,采用Plackett-Burman设计和响应曲面方法(RSM)对其产鼠李糖脂的发酵条件进行优化。Plackett-Burman试验设计表明,磷酸盐、C/N比和p H值对鼠李糖脂的产量具有显著影响。在此基础上,采用RSM对3个显著因素的最佳水平范围进行研究,结果表明当磷酸盐为1.71 g/L、C/N比为15.5、p H值为6.5时,其理论最佳鼠李糖脂产量为40.4 g/L,与实测鼠李糖脂产量39.84 g/L非常接近。摇瓶优化后的鼠李糖脂产量较优化前的22.9 g/L提高了73.97%。     

废弃食用油脂生物合成鼠李糖脂研究进展

碳源的成本过高限制了鼠李糖脂的工业化生产及应用,废弃食用油脂作为一种廉价易得的碳源,越来越多的研究者开始关注用它发酵生产鼠李糖脂.废弃食用油脂的种类、投加量对鼠李糖脂的产量、结构、性质均会产生影响,目前研究中用废弃食用油脂作碳源,鼠李糖脂产量最高可达24.61g/L、表面张力最低达到24mN/m、产物CMC最低可达40.19mg/L.此外,本文还总结了菌株、氮源、微量元素、pH、溶氧及培养方式等因素对废弃食用油脂生产鼠李糖脂的影响,并展望了利用废弃食用油脂生产鼠李糖脂实现产业化的重点研究方向.     

ARTP诱变选育鼠李糖脂高产菌及鼠李糖脂促进枯草芽孢杆菌产纤维素酶的研究

旨在选育鼠李糖脂高产菌株,以实验室筛选的产鼠李糖脂的Pseudomonas aeruginosa C3为出发菌株进行常压室温等离子体诱变(ARTP),选育出一株高产突变株Pseudomonas aeruginosa SC-11,产量比出发菌株提高了74.1%。进一步对产鼠李糖脂的摇瓶发酵培养基和发酵条件进行了优化,优化后的鼠李糖脂产量达42 g/L,底物转化率达到0.7 g/g底物。添加0.01%鼠李糖脂到Bacillus subtilis CL产羧甲基纤维素酶与木聚糖酶的培养基中,羧甲基纤维素酶活与木聚糖酶活分别提高12.9%和18.3%。研究表明,鼠李糖脂通过增加细胞通透性来提高胞外酶产量。     

铜绿假单胞杆菌O-2-2产鼠李糖脂的发酵培养基优化及LC-MS/MS分析

鼠李糖脂是一种性能优良的生物表面活性剂,在生物医药、环境保护、二次采油等方面具有很高的应用潜力.采用响应面分析法,对铜绿假单胞杆菌O-2-2的培养基进行了优化.Plackett-Burman(PB)实验设计表明,磷酸盐、硝酸盐和微量元素对鼠李糖脂的产量具有显著影响.Box-Behnke (BB)优化确定最佳培养基组成为磷酸盐、硝酸盐和微量元素用量分别为3.2g/L、13.76g/L和5.17ml,理论的最大产量为8.48g/L,与实测糖脂产量8.85g/L接近.摇瓶优化后的鼠李糖脂产量较优化前的6.24g/L提高了30.8％.最优化条件下采用10％的接种量逐级放大,并通过补料发酵,最终200L罐的鼠李糖脂产量达到70g/L,发酵时间仅为110h.采用新发明的二次蒸馏工艺,鼠李糖脂纯度达86.6％.液质联用(LC-MS)分析表明所生产的鼠李糖脂成分及含量为:双糖单脂32.9％、双糖双脂17.02％、单糖单脂3.16％、单糖双脂33.54％.     

嗜热子囊菌利用短链有机酸生产角质酶

以嗜热子囊菌(Thermobifida fusca WSH03-11)发酵生产角质酶为模型,研究微生物利用市政污泥厌氧酸化所产短链有机酸为碳源发酵生产高附加值产品的可能。发现：(1)以丁酸、丙酸和乙酸为碳源时,有机酸和氮元素浓度分别为8.0 g/L和1.5 g/L有利于角质酶的生产;而以乳酸为碳源时,最适有机酸和氮源浓度分别为3.0 g/L和1.0 g/L;(2)改变诱导物角质的浓度,以丁酸、丙酸、乙酸和乳酸为碳源,分别比优化前提高了31.0%、13.3%、43.8%和73.2%;(3)在四种有机酸中,T. fusca WSH03-11利用乙酸的速率最快,平均比消耗速率是丙酸的1.3倍,丁酸的2.0倍及乳酸的2.2倍;以丁酸为碳源时的酶活(52.4 U/mL)是乳酸的1.7倍、乙酸的2.5倍和丙酸的3.2倍;角质酶对乳酸的得率(12.70 u/mg)分别是丁酸的1.4倍、丙酸的3.0倍和乙酸的3.8倍;(4)以混合酸为碳源生产角质酶,T. fusca WSH03-11优先利用乙酸,而对丁酸的利用受到抑制。进一步研究发现,混合酸中0.5 g/L的乙酸将导致丁酸的消耗量降低66.7%。这是首次利用混合酸作碳源发酵生产角质酶的研究报道。这一研究结果进一步确证了利用市政污泥厌氧酸化所产有机酸为碳源发酵生产高附加值产品的可行性,为以廉价碳源生产角质酶奠定了良好的基础。     

嗜热子囊菌利用短链有机酸生产角质酶

以嗜热子囊菌(Thermobifida fusca WSH03-11)发酵生产角质酶为模型,研究微生物利用市政污泥厌氧酸化所产短链有机酸为碳源发酵生产高附加值产品的可能。发现：(1)以丁酸、丙酸和乙酸为碳源时,有机酸和氮元素浓度分别为8.0 g/L和1.5 g/L有利于角质酶的生产;而以乳酸为碳源时,最适有机酸和氮源浓度分别为3.0 g/L和1.0 g/L;(2)改变诱导物角质的浓度,以丁酸、丙酸、乙酸和乳酸为碳源,分别比优化前提高了31.0%、13.3%、43.8%和73.2%;(3)在四种有机酸中,T. fusca WSH03-11利用乙酸的速率最快,平均比消耗速率是丙酸的1.3倍,丁酸的2.0倍及乳酸的2.2倍;以丁酸为碳源时的酶活(52.4 U/mL)是乳酸的1.7倍、乙酸的2.5倍和丙酸的3.2倍;角质酶对乳酸的得率(12.70 u/mg)分别是丁酸的1.4倍、丙酸的3.0倍和乙酸的3.8倍;(4)以混合酸为碳源生产角质酶,T. fusca WSH03-11优先利用乙酸,而对丁酸的利用受到抑制。进一步研究发现,混合酸中0.5 g/L的乙酸将导致丁酸的消耗量降低66.7%。这是首次利用混合酸作碳源发酵生产角质酶的研究报道。这一研究结果进一步确证了利用市政污泥厌氧酸化所产有机酸为碳源发酵生产高附加值产品的可行性,为以廉价碳源生产角质酶奠定了良好的基础。     

9株海洋来源铜绿假单胞菌合成鼠李糖脂的比较分析

目的:从海洋来源的铜绿假单胞菌中筛选多株具有鼠李糖脂合成能力的菌株。方法:以9株分离自不同海洋环境的铜绿假单胞菌为研究对象,考察并比较其发酵合成鼠李糖脂生物表面活性剂的表面活性、产量和产物成分的差异,扩增并比对合成途径中的关键基因。结果:9株菌的发酵产物均具有表面活性,其中菌株1A01151发酵液的表面活性最强,表面张力值可降低至28 m N/m;9株菌的基因组中均含有鼠李糖脂合成途径中关键基因rhl AB和rhl C,都具有合成单、双鼠李糖脂的能力;菌株1A01151和1A00364的发酵产量最高(2.69 g/L),产物经LC-MS/MS检测,所合成的鼠李糖脂同系物组分不同,双糖双脂的含量最高(1A01151:75.96%;1A00364:61.01%)。结论:海洋来源的铜绿假单胞菌是具有鼠李糖脂高产潜力的菌株,可用于合成性能不同、组成多样的鼠李糖脂生物表面活性剂。     

三种组成型启动子调控的鼠李糖脂基因在防御假单胞菌中的异源表达及活性研究

本研究利用Red/ETDNA重组技术对实验室已有的含鼠李糖基转移酶基因RhlAB的分泌表达载体pBBR1-genta-RhlAB进行修饰,将3种不同强度组成型启动子(Papra、Ptac和PrhaB)成功替换了RhlAB基因在铜绿假单胞菌中的原始启动子,成功获得了表达载体pBBR1-genta-Papra-RhlAB,pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB,并将这些表达载体分别在防御假单胞菌Pf-5中异源表达,通过LB培养基发酵42h后,Pf-5/pBBR1-genta-RhlAB的鼠李糖脂产量为17.56mg/L,而Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB分别是11.135mg/L,441.135mg/L,557.764mg/L,启动子优化后产量分别是原始启动子的0.63,25.12和31.76倍。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的4类质核比不同的鼠李糖脂同系物。并通过实时荧光定量PCR检测RhlAB基因的表达量,发现启动子替换为Ptac和PrhaB后RhlAB基因表达量分别是原始启动子的2.16和2.77倍。本研究初步实现了RhlAB基因在Pf-5中的表达,发现组成型启动子Ptac和PrhaB比RhlAB的原始启动子表达效率更高,可为异源合成鼠李糖脂提供重要参考。     

表面活性剂对绿色木霉产纤维素酶影响

利用绿色木霉,以稻草为唯一碳源,采用液态发酵的方法,分别加入生物表面活性剂鼠李糖脂和化学表面活性剂Tween 80,重点研究了生物表面活性剂对绿色木霉产纤维素酶的影响。实验分析了加入不同浓度的表面活性剂时滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、微晶纤维素酶活及酶液的表面张力随时间的变化情况。结果表明,添加鼠李糖脂能够促进绿色木霉产酶,分别使滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、微晶纤维素酶活最大提高了1.08倍,1.6倍和1.03倍。与Tween 80相比,鼠李糖脂促进产酶的效果明显优于Tween 80。     

鸟肠球菌(Enterococcus avium)中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】前期工作中筛选出一株产α-L-鼠李糖苷酶的细菌,经分子生物学方法鉴定为鸟肠球菌(Enterococcus avium)。α-L-鼠李糖苷酶能够从天然类黄酮化合物中特异性切割末端鼠李糖,在食品生产、医药加工和化工等方面具有极大的开发前景和应用价值。【目的】克隆、表达鸟肠球菌中α-L-鼠李糖苷酶基因,进一步对重组蛋白的酶学性质进行研究。【方法】以鸟肠球菌(Enterococcus avium)strain 352基因组中推定的α-L-鼠李糖苷酶基因序列为基础,设计特异性引物扩增其编码区序列。以p ET-28a(+)为载体构建重组表达质粒,将重组蛋白在Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达。使用镍亲和层析纯化重组蛋白,以p NPR为底物测定重组蛋白的酶学性质。【结果】重组蛋白Ea Rha1分子量大小约为130 k Da。以p NPR为底物,Ea Rha1最适p H是7.0,最适温度为50℃,在p H 5.0-8.0稳定性较好,在40℃以下能保持较高酶活。金属离子对Ea Rha1有不同程度的促进或抑制作用。甲醇对Ea Rha1有抑制作用,并且抑制作用随着甲醇浓度的增大而增强。酶动力学常数K_max和V_max分别为0.35 mmol/L和4.2μmol/(mg·min)(R²=0.999)。Ea Rha1能催化水解新橙皮苷、柚皮苷和芦丁。【结论】通过对重组蛋白Ea Rha1酶学性质的研究,确定了该蛋白对黄酮类化合物的水解特性,为黄酮类化合物的生物转化奠定了理论基础。     

生物表面活性剂鼠李糖脂对甘蔗黑穗病菌的体外抗菌活性

【背景】甘蔗黑穗病是一种主要的甘蔗病害,易造成甘蔗严重减产;鼠李糖脂是一种生物表面活性剂,可作为多种植物真菌病害的抑菌剂。【目的】研究生物表面活性剂鼠李糖脂对甘蔗黑穗病菌的体外抗菌活性及初步的抗菌机理。【方法】采用甘蔗黑穗病冬孢子萌发试验研究鼠李糖脂对甘蔗黑穗病冬孢子的抗菌作用。采用菌丝生长速率法和菌丝干重法对鼠李糖脂的体外抑菌试验进行检测;通过菌丝电导率的变化研究鼠李糖脂对甘蔗黑穗病菌细胞膜通透性的影响。【结果】鼠李糖脂能显著抑制甘蔗黑穗病菌孢子萌发,其中2.0 g/L鼠李糖脂对甘蔗黑穗病冬孢子萌发的抑制效果最好,抑制率达45.03%。鼠李糖脂能显著抑制甘蔗黑穗病菌双核菌丝体、单胞菌a和单胞菌b的生长。鼠李糖脂能使甘蔗黑穗病单胞菌细胞膜透性增加,与对照相比,2.0 g/L鼠李糖脂处理甘蔗黑穗病双核菌丝体0.5min后电导率升高了约9倍,处理单胞菌a30min后电导率提高了94.23%;0.1g/L鼠李糖脂处理甘蔗黑穗病单胞菌b30min后电导率升高了54.49%,随着浓度的增加,各处理电导率升高显著。【结论】鼠李糖脂对甘蔗黑穗病菌有良好的抗菌作用,有望为甘蔗黑穗病的防治提供新方法。     

重组Bacillus subtilis产B.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶的发酵优化

利用本研究室已构建的重组菌Bacillus subtilis/pBSMuL3-α/β-CGTase对产B.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶的发酵产酶进行了优化,考察了培养基中重要成分:碳源、有机氮源、无机氮源、有机与无机氮源质量比、碳源与氮质量比、金属离子种类等单因素对该重组菌产α/β-CGTase的影响,并采用正交实验对发酵培养基进行优化,对优化结果分析可知,重组菌B.subtilis/pBSMuL3-α/β-CGTase发酵产α/β-CGTase的最优培养基成本为:葡萄糖5 g/L,氮源(鱼骨蛋白胨∶NH4Cl=3∶1)25 g/L,1 mmol/L Mg^2+。在最优条件下发酵培养,α/β-CGTase的酶活由原来TB发酵培养基的9.20 U/mL提高至20.32 U/mL,是优化前酶活的2.2倍,为α/β-环糊精葡萄糖基转移酶的工业应用提供了理论支持。     

产氢菌的分离鉴定及其产氢特性研究

从河底污泥中分离到一株产氢菌,通过16S rDNA序列和系统发育分析,鉴定为克雷伯氏菌属,命名为Klebsiella sp. HQ-3.运用单因子试验考察了摇瓶发酵培养基中碳源、氮源、无机盐等因素对克雷伯氏菌HQ-3发酵产氢的影响,并对其产氢特性做了初步研究.结果表明,克雷伯氏HQ-3在葡萄糖浓度为24 g/L,蛋白胨为18 g/ L,KH2PO4为 8g/ L时具有较高产氢量,其最佳产氢初始pH为8.0左右.     

离子注入选育高产木聚糖酶黑曲霉及其发酵条件研究

以黑曲霉A3为出发菌,利用离子注入技术选育出一株遗传性状稳定的木聚糖酶高产突变株AN497,其产酶水平较出发菌从野生型A3菌株的405.6IU/ml提高到586.2IU/ml,即酶产量增加了44.5%;对高产菌进行发酵条件优化,发现以玉米芯粉为主要碳源、用蔗糖代替葡萄糖作为附加碳源,对木聚糖酶的发酵具有明显的促进作用;采用复合的无机氮源 (NH4)2SO4和NaNO3,(1: 2)浓度以10g/L为宜;菌株对发酵通氧量具有较高的要求,摇瓶转速在230r/min时的产酶水平较200r/min要高;通过发酵条件的优化,高产菌株的产酶活力最高可达671.1IU/mL,比出发菌株的产酶量提高了65.5%。     

铜绿假单胞菌XJ601产鼠李糖脂的优化培养及其稳定性

以1株从原油污染样品中分离获得的铜绿假单胞菌XJ601为研究对象,采用蒽酮比色法定量分析鼠李糖脂,优化其产鼠李糖脂的培养基组成。研究表明:疏水性底物优于亲水性底物,具有更高的鼠李糖脂产量,尤以菜籽油最佳;氮源中,硝酸盐、NH_4Cl能促进鼠李糖脂的合成,以菜籽油为碳源时,最佳氮源为NaNO_3;C/N比值在20时,鼠李糖脂产量最高;P元素的微量添加会影响鼠李糖脂的合成。摇瓶培养获得的鼠李糖脂对不同温度、pH及NaCl浓度都具有较好的稳定性,表明其在三次采油及原油污染生物治理等领域具有较好的应用前景。