非定向激活沉默基因簇挖掘链霉菌活性次级代谢产物研究进展

链霉菌(Streptomyces spp.)是活性次级代谢产物的主要生产菌,在发现结构新颖化合物上具有重大潜力。随着对链霉菌基因组数据的深入分析,发现大量产次级代谢产物合成基因簇处于沉默状态,因此利用非定向和定向策略激活链霉菌中沉默基因簇、挖掘结构新颖化合物成为当前的主要手段。本文主要综述了培养基组成改变或培养条件优化、共培养、添加化学激发子及全局性调控等非定向策略在挖掘链霉菌次级代谢产物中的应用以及取得的进展,以期为链霉菌次级代谢产物高效开发提供参考。     

链霉菌中高效生产聚酮化合物的研究方法及进展北大核心CSCD

聚酮化合物是通过聚酮合成途径产生的一大类结构和生物活性多样的次级代谢产物,是链霉菌产生的主要次级代谢产物,具有重要的经济价值。为了在链霉菌中提高聚酮化合物产量,以满足工业生产需求,近年来,代谢工程的方法被广泛应用,例如,过表达合成途径中限速酶或途径特异性激活蛋白、强化前体供应、去除产物反馈抑制、合成基因簇异源表达等。本文将从代谢工程改造实例入手,全面综述链霉菌中聚酮化合物高效生物合成的研究方法及进展,并对利用合成生物学策略智能动态适配各个相关途径,进而提高该类化合物产量的研究思路进行展望。     

基于基因组挖掘的农抗120活性成分制霉菌素和丰加霉素的发现和鉴定

【目的】分析刺孢吸水链霉菌北京变种(农抗120产生菌)基因组和次级代谢产物组分,研究并鉴定农抗120产生菌中未被发现的活性组分。【方法】利用antiSMASH在线分析农抗120产生菌Streptomyces hygrospinosusvar.beijingensis基因组信息,锁定可能的制霉菌素和丰加霉素生物合成基因簇。利用HPLC和LC-MS等分析方法对农抗120产生菌发酵产物进行分析,同时利用制霉菌素和丰加霉素标准品作为对照,以鉴定该菌株代谢组分中的次级代谢产物。此外,通过构建目标基因簇大片段缺失突变株,并对所得突变株发酵产物进行检测,以确定生物合成基因簇与目的代谢产物的对应关系。【结果】本研究综合利用基因组序列分析、基因缺失突变株构建以及代谢产物检测方法,鉴定了农抗120产生菌中制霉菌素和丰加霉素两种活性成分,并确定了负责这些化合物合成的基因簇。【结论】本研究所构建的多重基因簇失活突变株为挖掘刺孢吸水链霉菌北京变种更多的天然次级代谢产物奠定了基础。     

合成生物学在链霉菌次级代谢产物研发中的应用

链霉菌是革兰氏阳性丝状细菌,其次级代谢产物具有抗感染、抗虫、抗肿瘤、免疫调节等生理活性,在医药、食品和农业领域具有重要应用价值。链霉菌的遗传操作技术是发现和改良新次级代谢产物的基础,近年来合成生物学的兴起为链霉菌的研发提供了全新的视角。综述了合成生物学在链霉菌次级产物生物合成基因簇克隆与组装、底盘细胞设计与改造、调节两者适配性方面的应用进展。     

植物内生链霉菌Streptomyces sp. SAT1的基因组测序和比较基因组分析

【背景】一直以来,链霉菌都是活性物质的主要生产者,近年来随着抗生素滥用引起的环境和微生物抗药性问题越发严重,挖掘高效生物防治因子和新型抗生素成为了解决以上问题的重要手段。【目的】通过获得植物内生链霉菌SAT1全基因组序列和次级代谢基因簇信息,利用比较基因组学和泛基因组学分析SAT1菌株的特殊性以及与其他链霉菌的共性,为阐明SAT1抑菌和内生机制提供理论基础,为揭示链霉菌的生态功能提供可靠数据。【方法】通过三代测序平台PacBio Sequel完成SAT1基因组测序,利用生物信息学技术进行注释和功能基因分类;分别利用RAxML和PGAP软件进行系统发育树的构建和泛基因组分析;次级代谢基因簇的预测和分析通过antiSMASH网站完成。【结果】获得SAT1菌株的全基因组完成图,该菌线性染色体长度约7.47 Mb,包含有4个质粒,GC含量近73%,共预测到7 550个蛋白编码基因,含有37个次级代谢基因簇,分属29个类型,其中默诺霉素基因簇与加纳链霉菌具有较高相似性。42株代表链霉菌中,单个菌株次级代谢基因簇数量为20-55个,主要类型为PKS类、Terpene类和Nrps类,而且含有大量杂合基因簇,各个菌株中特有基因数目较为庞大。【结论】链霉菌SAT1菌株在基因组特点以及次级代谢基因簇的数量和类型上与其余41株链霉菌具有一定的共性,其中潮霉素B基因簇和默诺霉素基因簇合成的相关物质可能与SAT1抑菌活性密切相关。42株链霉菌中次级代谢基因簇数量的多少与基因组大小成正相关,同时大量杂合基因簇以及庞大的特有基因数目的存在说明链霉菌在长期进化过程中存在了很高程度的水平基因转移现象,可能具有重要的生态功能。     

链霉菌隐性次级代谢产物生物合成基因簇的激活

链霉菌基因组中存在许多隐性次级代谢产物生物合成基因簇(cryptic secondary metabolite biosynthetic gene cluster,CSMG),在实验室条件下,它们多数处于沉默状态或者很低的表达水平。但在一定条件下这些CSMG可以被激活合成次级代谢产物,这为寻找新的活性天然产物提供新来源。本文总结了目前激活链霉菌CSMG所使用的方法,包括改变发酵条件、核糖体工程、共培养、异源表达、CSR(cluster-situated regulator)基因的遗传改造等。     

信号分子在链霉菌天然产物发现和开发中的应用研究进展

链霉菌具有巨大的合成次级代谢产物的潜力,但在实验室常规培养条件下链霉菌中大部分生物合成基因簇是沉默的,或者表达量极低。链霉菌中信号分子可调节形态分化和代谢产物的生物合成。通过对编码这些信号分子合成酶或受体的基因进行操作,或在发酵液中添加信号分子,可以激活链霉菌中的沉默生物合成基因簇,发现新的天然产物,或者提升已发现的天然产物产量。本文以γ-丁内酯和γ-丁烯内酯两类信号分子为例总结了过去十余年中信号分子在链霉菌天然产物发现和产量提升中的应用,以期为微生物天然产物的开发提供借鉴。     

链霉菌底盘细胞的开发现状及其应用

天然产物及其衍生物在现代医疗中扮演着举足轻重的角色,其生物活性多样性以及化学结构的丰富性是新药研发的源泉和动力。利用纯化学方法合成天然产物在技术和成本上有很大的困难,加上许多天然产物的原始产生菌具有培养条件苛刻、产量低下等缺点,而且大量基因簇在原始菌株中是沉默的,这使得利用合成生物学思想来指导天然产物生物合成基因簇的异源表达具有重大意义。作为抗生素、抗肿瘤活性物质、免疫抑制剂等次级代谢产物主要来源的放线菌一直是研究者们关注的焦点,特别是随着基因测序技术的飞速发展,人们发现链霉菌基因组中包含着极为丰富的天然产物生物合成基因簇资源。这意味着开发链霉菌底盘细胞作为异源表达宿主有其得天独厚的优势。本综述从底盘细胞开发的意义入手,重点阐述链霉菌底盘细胞构建的策略及现状,随后通过实例阐述了各种底盘链霉菌的实际应用。     

珠江口沉积物来源链霉菌SCSIO 40020中bafilomycins的鉴定及其生物合成基因簇的异源表达

【目的】从珠江口沉积物来源的菌株SCSIO40020中分离bafilomycins,并对其生物合成基因簇进行克隆和异源表达研究。【方法】通过分析菌株SCSIO 40020的16S rRNA基因序列并构建系统发育树以鉴定菌种,以柱层析法和制备色谱法对次级代谢产物进行分离纯化,借助波谱学手段完成单体化合物的结构鉴定,采用生物信息学分析定位bafilomycins的生物合成基因簇,通过筛选菌株SCSIO 40020基因组的细菌人工染色体文库和接合转移将bafilomycins生物合成基因簇导入3种链霉菌进行异源表达,利用高效液相色谱检测异源表达菌株的发酵产物。【结果】菌株SCSIO 40020被鉴定为链霉菌属菌株,从其发酵产物中分离鉴定了2个单体化合物bafilomycinsA1和D。克隆了链霉菌SCSIO40020中bafilomycins的生物合成基因簇并推导了其生物合成途径,在3种链霉菌中表达产生了bafilomycins。【结论】从珠江口环境中获得了一株产生bafilomycins的链霉菌SCSIO 40020,成功建立了该菌株次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达体系,并首次在链霉菌...     

除虫链霉菌10个聚酮类抗生素生物合成基因簇的敲除对阿维菌素产量的影响

【目的】考察除虫链霉菌基因组中其它聚酮合成酶类(Polyketide synthase,PKS)抗生素生物合成基因簇的敲除突变对于阿维菌素产量的影响。【方法】构建了11个PKS基因簇的打靶Cosmid和质粒载体,导入除虫链霉菌中筛选突变株。【结果】在工业菌株MMR630中成功敲除了10个PKS基因簇。发酵结果显示7个PKS基因簇敲除突变株中阿维菌素的产量均有不同程度的提高,而2个突变株不能产生阿维菌素。然而,在3个连续敲除2个PKS基因簇的突变株中阿维菌素产量没有能够超过单个PKS敲除突变株的提升幅度。【结论】除虫链霉菌基因组的一些PKS基因簇的敲除可以提高阿维菌素的产量,同时暗示同一类次生代谢产物的代谢流之间存在复杂的相互作用关系。     

基因组挖掘默诺霉素生物合成基因簇的比较分析

通过对NCBI数据库的检索,使用次级代谢基因挖掘的方法对整个基因组数据进行扫描,发现含有潜在的默诺霉素家族磷酸糖脂类抗生素合成途径基因簇的6株链霉菌:Streptomyces ghanaensis、Streptomyces bambergiensis、 Streptomyces prasinus、 Streptomyces lincolnensis、 Streptomyces. sp. SAT1和Streptomyces clavuligerus。将搜寻获取的候选基因簇与S. ghanaensis中的默诺霉素合成相关基因簇进行比较基因组学分析,从共线性比对、合成基因的进化水平和同源性比对结果的分析,说明默诺霉素合成基因簇存在两种不同的进化来源与途径。其中5株链霉菌的合成基因簇位于染色体的两臂区,该区域常发生染色体插入或缺失的水平转移。通过对移动元件的基因岛序列的预测,发现默诺霉素合成基因簇是由20 kb大小的基因组岛实现了种间水平转移。基因组岛的插入是链霉菌获得新性状的重要途径,可以阐述基因簇在种间转移的途径和进化方向,以生物信息学基因组分析的角度为高产菌株的构建提供数据支持和改造。     

基于微生物共培养的隐性基因簇激活策略

微生物次级代谢产物是药物先导化合物的重要源泉之一。随着测序技术的迅猛发展,越来越多的微生物基因组得以测序完成。伴随着测序技术的进步,生物信息学也得到了快速发展。基因组序列分析发现,链霉菌和丝状真菌等微生物中存在大量的已知的或未知的次级代谢物生物合成基因簇(secondary metabolite-biosynthetic gene clusters,SM-BGCs)。然而,在实验室培养条件下大部分基因簇无法表达或表达量很低,导致难以发现这些基因簇所对应的代谢产物,人们将这类基因簇称为“隐性基因簇”或“沉默基因簇”。通过调节基因簇中特异调控基因或基因簇外全局性调控基因的表达,对代谢途径的定向改造,以及将基因簇导入异源宿主等策略,能够激活部分隐性基因簇的表达。通过激活隐性基因簇的表达,能够发现通过常规实验室培养无法获得的具有独特生物活性的新结构代谢产物,成为创新药物的重要来源之一。然而,这些基因簇激活策略都严重依赖于对特定菌株或宿主的遗传操作。近年来,通过模拟自然混合培养中微生物间相互作用,开发了通过混合特定微生物菌株在厌氧或好氧条件下激活隐性基因簇的方法,称之为共培养激活策略。这种策略不...     

无机磷酸盐对链霉菌合成次级代谢产物的影响

链霉菌一个突出的特征是具有合成丰富的次级代谢产物的能力,许多次级代谢产物,如抗生素、免疫抑制剂、抗癌物质等在临床医药、水产养殖业等领域具有重要的应用价值。链霉菌次级代谢产物的合成常与环境中的营养因子有着密切的关系,在代谢水平上综述了无机磷酸盐对链霉菌合成次级代谢产物的影响,并在转录水平上阐释了双组分信号转导系统PhoR-PhoP的分子调控机制。PhoR-PhoP能够感应环境中的无机磷酸盐信号,当无机磷酸盐的浓度低于一定"阈值"时,PhoP蛋白作为主导的调控因子将抑制参与中心代谢和次级代谢等一系列基因的转录表达,减慢磷酸盐的消耗,并激活磷酸盐的摄取和转运系统及时补充胞内的磷酸盐,最终影响链霉菌次级代谢产物的合成和形态发育分化。     

链霉菌Streptomyces antibioticus NRRL 8167中Naphthgeranine A生物合成基因簇的分析鉴定

【背景】微生物来源的天然产物是小分子药物或药物先导物的重要来源。对链霉菌Streptomyces antibioticus NRRL 8167的基因组分析显示,其包含多个次级代谢产物的生物合成基因簇,具有产生多种新化合物的潜力。【目的】对链霉菌S. antibioticus NRRL 8167中次级代谢产物进行研究,以期发现结构新颖或生物活性独特的化合物,并对相应产物的生物合成基因簇和生物合成途径进行解析。【方法】利用HPLC图谱结合特征性紫外吸收和LC-MS方法,排除S. antibioticus NRRL 8167产生的已知化合物,确定具有特殊紫外吸收的化合物作为挖掘对象,然后利用正、反相硅胶柱色谱、高效液相色谱等技术对次级代谢产物进行分离纯化,分离化合物。利用质谱及核磁共振光谱技术对化合物结构进行解析和鉴定;提取链霉菌S. antibioticus NRRL 8167基因组DNA,利用PacBio测序平台进行基因组测序;利用生物信息学对基因组进行注释,并对合成该化合物的基因簇进行定位分析,推导其生物合成途径。【结果】确定这个化合物是NaphthgeranineA,属于聚酮类化合物。全基因组序列分析发现S.antibioticusNRRL8167基因组含有28个次级代谢产物生物合成基因簇,其中基因簇20可能负责Naphthgeranine A的生物合成,并对其生物合成途径进行了推导。【结论】基于紫外吸收光谱和质谱特征,从S. antibioticus NRRL 8167菌株的发酵提取物中分离鉴定了一个聚酮类化合物Naphthgeranine A。该菌株的全基因组测序为其生物合成基因簇的鉴定提供了前提,对Naphthgeranine A生物合成基因簇和生物合成途径的推测为进一步研究这个化合物的生物合成机制奠定了基础。     

链霉菌形态分化与次级代谢产物合成的研究进展

链霉菌是一类具有复杂的形态分化周期和强大的次级代谢能力的高GC含量的放线菌,能够利用其初级代谢产生的前体化合物和能量,合成多种结构复杂、功能多样的具有生物活性的次级代谢产物,在农业、食品、畜牧业、工业以及医药研究等领域都具有重要的价值。在链霉菌的形态分化后期常常伴随着次级代谢产物的生物合成,并且两者都受到复杂的网络调控;同时链霉菌的形态对次级代谢产物的产量和种类造成很大影响。对链霉菌生长周期的全面理解将加深对链霉菌形态分化与次级代谢产物合成关系的认识。本文将对链霉菌的形态分化过程、形态分化和抗生素合成两者共同的调控因子以及链霉菌形态与抗生素产量之间的关系进行综述,这将有助于理解抗生素的合成过程,也将会在缩短发酵周期、构建高产工程菌株、新型杀菌剂的研发以及新型抗生素的合成等方面给予我们启发。     

卡伍尔氏链霉菌NA4的Ⅱ型聚酮基因簇的靶向激活及其产物鉴定

【目的】以基因组信息为导向,定向激活海洋来源卡伍尔氏链霉菌（Streptomyces cavourensis） NA4中沉默的Ⅱ型聚酮类次级代谢产物生物合成基因簇,鉴定新产生的次级代谢产物的结构和抑菌活性。【方法】通过添加启动子和敲除负调控基因的方法激活实验室培养条件下沉默或低表达的生物合成基因簇,并完成目标化合物的分离与纯化,通过电喷雾质谱（electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）数据分析鉴定目标化合物结构,对目标化合物进行抑菌活性鉴定,基于生物信息学信息推导化合物的生物合成途径。【结果】根据基因组生物信息学分析,从海洋来源链霉菌Streptomyces cavourensis NA4中选取一个编码PKSⅡ型次级代谢产物的生物合成基因簇开展研究,成功激活目标基因簇,从中分离到1个PKSⅡ型化合物,推导了其生物合成途径并进行了抑菌活性鉴定。【结论】基因组导向下的天然产物挖掘,可以目标明确地分离产物,充分挖掘链霉菌编码次级代谢产物的潜力。     

洛伐他汀工业菌株土曲霉HZ01的次级代谢产物合成分析

【目的】分析洛伐他汀工业生产菌株土曲霉HZ01的次级代谢产物合成能力,为后期的遗传改造、次级代谢产物及其基因簇挖掘提供指导。【方法】对洛伐他汀发酵条件下的样品进行了转录组分析,同时运用色谱分离技术及波谱学方法对主要次级代谢产物进行了分离和结构鉴定。【结果】洛伐他汀合成相关基因转录水平非常高,还有4个聚酮合酶(PKS)、6个非核糖体多肽合成酶(NRPS)和1个PKS-NRPS杂合酶基因进行了转录,其他PKS和NRPS基因都处于沉默状态。此外,从该菌的发酵产物中分离鉴定了10个主要副产物并确定了其结构。【结论】土曲霉HZ01是一株优良的洛伐他汀生产菌株,在构建次级代谢产物异源合成细胞工厂和鉴定次级代谢产物生物合成途径方面具有很好的应用潜力。     

羊毛硫肽SapB类多肽促进链霉菌形态分化作用的研究

【目的】链霉菌属于革兰氏阳性菌,以复杂的形态分化过程和强大的次级代谢产物合成能力为主要特征。链霉菌的形态分化与次级代谢产物的产生密切相关。Ⅲ型羊毛硫肽SapB能够促进天蓝色链霉菌气生菌丝体形成,暗示这类多肽可以作为靶标用于形态分化改造工程开发。本研究表征了SapB类多肽对多种链霉菌形态分化的影响,为该类多肽的工程化应用提供理论基础。【方法】生物信息学分析多个链霉菌基因组中SapB类多肽的生物合成基因簇,构建SapB类多肽的异源表达载体,利用接合转移方法导入不同链霉菌中进行异源表达,探究SapB类多肽对链霉菌形态分化的影响。【结果】SapB类多肽在不同程度上促进了多个链霉菌由营养菌丝向气生菌丝分化,表现为气生菌丝体数量的增多和分化速度的加快,缩短了链霉菌形态分化周期。【结论】SapB类多肽的过表达有助于缩短链霉菌形态分化周期,可用于针对链霉菌形态分化的工程改造。     

藤黄生孢链霉菌NRRL 2401遗传操作系统和基因文库的构建北大核心CSCD

【目的】建立藤黄生孢链霉菌NRRL 2401的遗传操作系统和基因文库,以便筛选次级代谢产物生物合成基因。【方法】利用大肠杆菌和链霉菌的属间接合转移的方法,以整合型载体pPM927、pSET152和复制型载体pJTU1278构建链霉菌遗传操作系统。以pCClFOS^(TM)载体,大肠杆菌EP1300^(TM)-T1~R为宿主菌构建Fosmid文库。随后,设计引物,利用"板池-行池-单克隆"的三级PCR方法对文库进行快速筛选。【结果】pPM927、pSET152和pJTU1278均成功转入藤黄生孢链霉菌NRRL 2401,其中pSET152载体的转化效率最高。构建了稳定高效的藤黄生孢链霉菌NRRL 2401的基因文库,含2880个克隆,平均插入片段大小约为35 kb,空载率小于1%,文库覆盖率为99.99%,覆盖基因组16.5倍。同时,初步筛选出可能含有吲哚霉素生物合成基因簇的9个阳性克隆。【结论】成功构建了稳定高效的藤黄生孢链霉菌NRRL 2401遗传操作系统和高质量的基因文库,为克隆该菌中次级代谢产物生物合成基因簇以及进一步遗传改造奠定了基础。     

海洋链霉菌次级代谢产物研究进展

链霉菌作为最高等的放线菌,广泛分布于多种生态环境中,具有复杂而独特的形态分化周期和强大的次级代谢能力。链霉菌的次级代谢产物具有抗感染、抗肿瘤、抗炎抗氧化、免疫调节等生物活性,是天然活性产物的主要来源之一。近年来随着对海洋资源的开发,许多新型的海洋链霉菌及其丰富的次级代谢产物被发现。从海洋链霉菌的生物活性物质、育种和发酵培养3个方面综述了海洋链霉菌次级代谢产物的研究进展,以期为缩短海洋链霉菌的发酵周期,提高次级代谢产物产量活性以及开发新型的海洋药物等提供参考和借鉴。