代谢工程改造运动发酵单胞菌用于提高乙醇产量

目的:采用可以在运动发酵单胞菌中表达的操纵子构建重组运动发酵单胞菌,用于提高该细菌对高温高糖的耐受性和提高乙醇产量.方法:用外来的YfdZ、MetB和Hsp构建的多顺反子质粒,转化运动发酵单胞菌而使其获得新的代谢途径.在玉米水解液中,验证了该多顺反子质粒对运动发酵单胞菌产生乙醇的影响.结果:与对照菌相比,在37℃和糖浓度为28%的培养条件下,该基因工程菌的乙醇产量提高到183.2%.在37℃,糖浓度为28%并添加氮源的条件下,该基因工程菌的乙醇产量提高到148.0%.结论:YfdZ、MetB及Hsp三种基因的共同作用能显著提高运动发酵单胞菌的乙醇产量和发酵温度.     

重组运动发酵单胞菌的构建及木糖利用特性研究

将大肠杆菌(Escherichia coli)木糖代谢的关键酶基因.引入到运动发酵单胞菌中,获得能利用木糖发酵生产乙醇的重组工程菌株PZM.混合糖发酵过程中,重组菌利用葡萄糖和木糖生成乙醇的效率分别达到理论值的81.2%和63.1%.     

运动发酵单孢菌ZM4 adh Ⅱ基因的克隆及在大肠杆菌TOP10中的表达

利用高保真聚合酶从运动发酵单胞菌中克隆出乙醇脱氢酶基因,加A后克隆到pGM-T载体,测序验证无误。经酶切、酶连到表达载体pUC-18。形成重组质粒pUC-18-adhⅡ,转化到大肠杆菌TOP10中,经定性定量分析乙醇脱氢酶酶基因在大肠杆菌中高效表达,成功构建出乙醇脱氢酶基因的表达载体。     

构建伴有β-葡萄糖苷酶表达的乙醇发酵大肠杆菌

研究构建能够分泌表达纤维素酶的产乙醇菌株,实现降解木质纤维素生产乙醇的整合生物加工过程。文中通过克隆来自运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4的丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱氢酶基因adhB,并通过Red重组将二者整合到大肠杆菌Escherichia coli JM109基因组中,首先构建了一株可以利用葡萄糖进行乙醇发酵的重组菌E. coli P81。随后将来源于多粘芽胞杆菌Bacillus polymyxa1.794的β-葡萄糖苷酶基因bglB在E. coli P81中进行了分泌表达,得到了一株可以进行纤维二糖降解和乙醇发酵双重功能的重组菌E. coli P81(pUC19-bglB)。该菌胞外分泌β-糖苷酶活达到84.78 mU/mL菌液,纤维二糖酶活达到了32.32 mU/mL菌液。该重组菌E. coli P81(pUC19-bglB) 以纤维二糖为碳源进行乙醇发酵,乙醇得率达到了理论产率55.8％,而在葡萄糖和纤维二糖的共发酵中,其乙醇产量达到了理论产率46.5％。构建得到的此株整合生物加工大肠杆菌能够利用β-葡萄糖苷酶生产乙醇,为构建能利用木质纤维素分解产物生产燃料乙醇的高效、稳定生产用工程菌奠定了良好的基础。     

丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因表达载体的构建

以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的总DNA为模板,PCR扩增运动发酵单胞菌中的丙酮酸脱羧酶( Pyruvate decarboxylase,PDC)基因和乙醇脱氢酶Ⅱ(Alcohol dehydrogenaseⅡ,ADHⅡ)基因.将丙酮酸脱羧酶基因和含核糖体结合位点(RBS)的乙醇脱氢酶基因串联起来置于T7启动子控制下,构成多顺反子表达质粒pQR-PRA.经酶切和PCR验证,表达载体构建成功.将pQR-PRA转入大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21中,转化子的定性检测表明有酶表达,并且初步测定了2种酶的表达量.     

以农业废物为原料生产乙醇

用遗传工程方法使运动发酵单胞菌(乙醇生产量为酵母的5～6倍的革兰氏阴性厌氧菌)能够发酵的底物范围扩大了。Commission of the European Communities(CEC)的BAP项目为这项研究提供资金,旨在获得对谷类,水稻和水果进行发酵的改进方法。 在一般情况下,运动发酵单胞菌只能利用葡糖、果糖和蔗糖作为碳源,因此拓宽其可代谢的碳水化合物的范围使工业化利用成为可能。构建了含木糖分解代谢基因xy1A和xy1B的重组质粒。通过辅助接合,     

运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,以基因组DNA为模板克隆得到运动发酵单胞菌(Zyrnomonas mobilis)乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenaseⅡ)基因adhB,连接到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSE-adhB。将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株DH5α中,重组菌株经IPTG诱导后,在乙醛指示平板检测到乙醇脱氢酶活性。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的40KD特异性蛋白质条带。重组菌株经诱导培养,每毫升发酵液酶活力为5u。     

微生物木糖发酵产乙醇的代谢工程

利用木质纤维素发酵生产乙醇具有广泛的应用前景。而自然界中缺少有效转化木糖为乙醇的微生物是充分利用纤维素水解产物、提高乙醇产率、降低生产成本的关键因素。多年来研究者利用分子生物学技术对微生物菌株进行了代谢工程改造,使其能更有效地利用木糖生产乙醇。以下主要对运动发酵单胞菌、大肠杆菌和酵母等候选产乙醇微生物的木糖代谢工程研究进展进行了概述。     

麒麟公司克隆了类胡萝卜素的合成酶

麒麟啤酒公司与八千代国际大学教授原岛圭二在世界上首次成功地克隆了?? (ohrtrans)型的β-胡萝卜素和菌脂色素等黄色和橙黄色类胡萝卜素合成酶基因组.该公司用大肠杆菌和乙醇产生菌运动发酵单胞菌等微生物生产出类胡萝卜素.该公司计划导入基因组,培育出黄色花.因为β胡萝卜素是维生素A的前体,希望将来能发展成开发维生素A的发酵生产法,克隆的详细内容在11月京都召开的日本分子生物学会上发表.论文刊载在Journal of Bacteriology杂志1990年12月号上.     

2004年《工业微生物》第34卷总目次

第　 1　期研究报告　 发酵法生产谷氨酰胺转胺酶 (MTG)的中试研究柏映国 ,燕国梁 ,堵国成等 (1)……………………………………………　工业酵母菌株转化体系的建立王　颖 ,鲍晓明 ,杨国梁等 (6 )…………………………………………………………………　产L 乳酸米根霉PW 35 2特性及低能离子注入诱变高产菌株研究古绍彬 ,葛春梅 ,汪青宏等 (12 )…………………………　运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达陆　坚 ,韦宇拓 ,黄　鲲等 (17)……………………………　丁酸梭杆菌发酵甘油制备 1,3 丙二醇的研究吴　斌 ,　何…     

能源上的应用

<正> 8 53389运动发酵单胞菌遗传技术的发展和菌株改良[会,英]/Skotnicki,M.L.…//Aust.Biotechnol.Conf.-1982,5Meet.-13～16[译自DBA, 1984, 3(18),84-08775]用亚硝基胍诱变运动发酵单胞菌(Zy-     

产乙醇运动发酵单胞菌的研究进展

运动发酵单胞菌作为天然生产乙醇的主要微生物之一,具有特殊的Entner Doudoroff途径和其他一些特殊的糖代谢和能量代谢方式,因此具有乙醇产率高和乙醇耐受力强的显著特点。通过简述运动发酵单胞菌的糖代谢和能量代谢、乙醇和高渗透压等耐性及其遗传改造三方面的研究进展,阐明其应用于燃料乙醇生产的巨大潜力     

发酵五碳糖和六碳糖产乙醇的细菌研究进展*

农作物废弃物中含有大量木质纤维素,经预处理或水解后能得到各种糖类的混合物,这些糖包括五碳糖和六碳糖(混合糖)。中报道了国内外近20年来在利用细菌发酵混合糖产乙醇方面的研究进展。重点介绍了几种重组大肠杆菌Escherichia coli和运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis利用混合糖产乙醇的特性。     

基因标记、转化、表达与检测

920889在发醉杂件下乳抽对tac启动子的诱导〔英刀Neu-bauer,P.…j Aeta Bioteehnol一1091,11(一)一23~2。〔译自DBA,i,。i,10(15),91-08级38〕 发展了一种用乳糖代替昂贵的TPTG诱导tac启动子的表达系统。采用大肠杆菌JC53的R100质粒协助质粒诱动,用平板结合法将大肠杆菌JM109的F,质粒(Lelq、pro AB)转入受体菌NK5525(lae‘、pro)。得到的原养型CW3oll超量表达lae阻遏物基因,并以乳糖为能源和碳源生长。质粒pOFI.o转化的菌株CW3oll含控制lae操纵子(I-acZ和lacy)片段的 tac启动子和氨节青霉素抗性基因。摇瓶和发酵罐实验结果表明…     

运动发酵单胞菌积累聚羟基丁酸提高乙醇产量

运动发酵单胞菌是一种很有潜力的酒精生产菌。PHB是生物合成的一种聚酯,有研究表明,该类物质在微生物体内的积累能够提高宿主菌的抗逆能力。本文对运动发酵单胞菌进行了如下改造：将PHB合成操纵子phbCAB与来源于运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶的启动子准确融合,插入广泛宿主载体pBBR1MCS-1中,并利用电转化的方法转入运动发酵单胞菌中。在重组菌中检测到了PhaA和PhaB的酶活;并首次在运动发酵单胞菌中实现了PHB的积累。摇瓶实验表明,前48小时重组菌的乙醇积累量提高了约10%,后续发酵中可能由于葡萄糖耗尽,重组菌与野生菌乙醇积累量差别不大。     

热休克蛋白增加大肠杆菌抗逆性和乙醇产量的研究

目的：研究热休克蛋白对增加大肠杆菌抗逆性和乙醇产量的影响。方法：运用基因工程技术,用大肠杆菌的Lac启动子、运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因（pdc）和乙醇脱氢酶基因（adhB）,构建可以在大肠杆菌中表达的Lac-AP操纵子。Lac-AP操纵子导入大肠杆菌,可使大肠杆菌发酵糖生产乙醇。再用来自超嗜热菌强烈火球菌（Pyrococcus furiosus）的小分子热休克蛋基因（sHsp）,构建在大肠杆菌中表达的Lac-APH操纵子。结果：成功地构建了耐高温产生乙醇的大肠杆菌LAPH和LAP,它们发酵后乙醇的产量分别为11.5g/L、7.9g/L,而对照菌LH的产量只有为0.5g/L。与对照菌LH相比,LAPH和LAP的产量分别提高了23倍和15.8倍。结果证明：与对照LAP相比,热休克蛋白使菌种LAPH的45℃温度耐受性提高15.75倍、50℃温度耐受性提高40.7倍,乙醇的产量增高高达4.74倍。结论：研究表明,小分子热休克蛋白的表达,可使细菌在致死温度下的存活率显著提高,耐受温度明显增强,乙醇产量显著提高。     

农业其他

兜1357热纤梭菌内葡聚箱醉基因在植物乳杆菌中的表达嵘】/B:tes, E.E.M.…11APPI.Environ.Microbiol一1989,55(8)一2095一2097阵自DBA,1989,8(19),89-- 1 143 IJ 为了改进青饲料发酵期间植物多糖的降解,以质粒pSA3为载体,克隆了热纤梭菌(C如tr诚听ther从oe。如用)纤维家醉基因并使其在植物乳杆菌(加c,砧ac边如殉。t~)NC0o一193中表达.通过电徽,将含热纤梭菌celE基因的重组质较pM25用于植物乳杆菌的转化.含质粒pMZS的菌株表达热稳定性纤维素醉活性,该活性主要存在于培养基中.还将质独,OK12和ps^3用于植物乳杆菌的转化,以评估质粒…     

响应面法优化重组工程菌的发酵工艺条件

目的：对基因改造运动发酵单胞菌的发酵工艺条件进行优化,提高重组菌发酵乙醇产量。方法：使用分子克隆实验操作技术构建重组运动发酵单胞菌,以单因素实验为基础,利用Box-Behnken中心组合实验和响应面分析法,确定了影响重组菌高产乙醇的三个重要因素。结果：成功构建含有YfdZ、MetB基因和Hsp基因的重组菌Zymomonas mobilis HYM,发酵主要影响因素的最佳条件分别为温度28℃,葡萄糖浓度24%（W/V）,pH7.4。在此优化条件下,Zymomonas mobilis HYM的乙醇产量可高达105.0735g/l,比原始菌株乙醇产量提高16.4%。结论：用中心组合设计和响应面分析法优化重组运动发酵单胞菌的发酵工艺条件,显著提高乙醇产量。     

医药其它

940266用重组酿酒酵母细胞使乳糖/乳清生物转化成二磷酸果糖〔英〕/Compagn。,C.…了Biotechnol.Bioeng一1993,42(3)一39息~,l 00仁译自DBA,199,12(16),93一09221己 表达大肠杆菌户半乳糖普酶基因的重组酿酒酵母GRF18细胞能将乳糖或乳清转变成果糖一1,6一二磷酸(FDP)。用适当浓度细胞和无机磷的比例,由乳清获得了高产的FDP。根据表达载体携带lacZ基因,由不同的碳一源得到转化细胞的生物量。生物转化的时间过程示明,萄萄糖和半乳糖以不同的速度同时进行新陈代谢。乳清中的乳精以此方式全部变成FDP,产量为64%。乳清可作酿酒酵母生长的…     

产乙醇工程菌研究进展

伴随着21世纪的到来,低油价的时代也悄然落幕。简要概述了燃料乙醇产生菌代谢工程的研究进展,包括了利用淀粉、戊糖及纤维素的工程酵母构建,运动发酵单胞菌利用戊糖工程菌的构建,引入外源乙醇合成途径的大肠埃希氏菌和产酸克雷伯氏菌等。对燃料乙醇的重视将促进开发能利用廉价原料和要求粗放的工程菌株用于高产乙醇的生产过程,以降低成本和能耗,其中能利用生淀粉的工程酵母及利用木质纤维素水解物的运动发酵单胞菌工程菌有较大的工业化潜力。