人HIF—1α miRNA干扰质粒的构建及其在Lovo细胞中有效性的检测

目的：构建人HIF—1α的miRNA特异性干扰表达载体并转染人结肠癌Lovo细胞检测其有效性。方法：设计合成针对人HIF—1α基因的特异性miRNA前体寡核苷酸,依次通过退火、连接,构建含HIF—1α前体miRNA的重组干扰质粒pcDNA？6．2-GW／EmGFP—HIF—1α—miR,并转染人结肠癌Lovo细胞,经半定量RT-PCR技术鉴定其干扰有效性。结果：经双酶切及测序鉴定,针对人HIF—1α基因的两组miRNA干扰质粒构建成功,并能够有效抑制人结肠癌Lovo细胞中HIF-1αmRNA表达。结论：成功构建针对人HIF—1α基因的miRNA特异性有效干扰质粒,为后续HIF—1α基因慢病毒miRNA表达载体的构建及其在结肠癌多药耐药中的相关功能研究奠定基础。     

Bcl-2/C-Raf双基因“敲低”抑制人结肠癌细胞增殖

 RNA干扰是一种具有序列特异性的基因沉默,能够触发具有相应序列的mRNA的降解.构建具有双靶点的RNAi质粒表达载体,与单靶点表达载体比较,探讨其对结肠癌细胞增殖的抑 制作用.本研究分别构建了针对Bcl-2、C-Raf 和Bcl-2/C-Raf靶基因的质粒表达载体,通过Lipofectamine TM2000介导转染人结肠癌细胞系HCT-8后,检测相应转染组靶基因的mRNA和蛋白质表达量,测定各组细胞活性,研究RNAi对各组癌细胞增殖的抑制率.结果表明,分别转染3种质粒表达载体后,3组结肠癌细胞中相应靶基因的mRNA和蛋白质表达量均降低;转染双靶点干扰质粒的试验组;其细胞活性低于单靶点组;对于针对Bcl-2, C-Raf和Bcl-2/C-Raf基因的3组干扰实验,RNAi对结肠癌细胞增殖的抑制率分别为43.87%,40.64% 和63.85%.RNAi是结肠癌细胞中的一种功能途径,以质粒作为表达载体,同时具备Bcl-2/C-Raf双靶点的表达载体,对结肠癌细胞增殖的抑制作用要明显优于单靶点表达载体,双靶点质粒表达载体在结肠癌的基因治疗中是有潜力的.     

RNA干扰沉默低氧诱导因子-1α对低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

本研究应用基因克隆技术,将合成的发卡样特异性低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1alpha,HIF-1α）干扰寡核苷酸（siRNA）序列插入真核表达载体中,构建出特异性HIF-1α基因RNA干扰（RNAi）真核表达载体。采用组织块种植法,原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs）,将构建出的特异性HIF-1αRNAi真核表达载体转染到PASMCs;分别在常氧和低氧下进行细胞培养,采用RT-PCR检测PASMCsHIF-1αmRNA表达水平,用MTT和流式细胞仪检测细胞增殖水平,探讨低氧条件下HIF-1αRNAi真核表达载体对PASMCs增殖的影响。结果表明,低氧培养48h后,正常PASMCs和转染了HIF-1αsiRNA阴性表达载体的细胞增殖显著,HIF-1αmRNA表达水平也显著升高;而转染了HIF-1αsiRNA阳性表达质粒的细胞增殖不显著,HIF-1αmRNA表达水平较低。结果提示：HIF-1αRNAi真核表达载体能显著干扰培养的PASMCsHIF-1αmRNA表达,同时抑制低氧环境下PASMCs的增殖。     

小鼠CYP2E1基因靶向miRNA表达载体的构建及鉴定

目的设计并构建靶向小鼠CYP2E1基因的miRNA干扰质粒,为探索CYP2E1基因功能奠定基础。方法应用invitrogen设计软件设计两条干扰小鼠CYP2E1基因的靶向miRNA序列,合成相应的回文DNA序列,退火后分别连接到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体上,构建两套miRNA真核表达载体CYP2E1-miR1和CYP2E1-miR2,并使用该载体特有的串联方法将两载体上的miRNA前体寡核苷酸序列进行串联成为CYP2E1-miR1-miR2;将上述重组载体分别与构建的pcDNA3.1（＋）-CYP2E1表达质粒共转染入293T细胞,RT-PCR法鉴定其干扰效果。结果经酶切及测序鉴定,针对鼠CYP2E1基因的miRNA干扰质粒构建成功,并能够有效抑制共转染入293T细胞的pcDNA3.1（＋）-CYP2E1质粒的表达,且串联质粒CYP2E1-miR1-miR2优于单独的干扰质粒CYP2E1-miR1及CYP2E1-miR2。结论小鼠CYP2E1基因的靶向miRNA表达载体构建成功。     

在结肠癌细胞中RNA干扰TGFBR2慢病毒载体的构建及其功能的初步研究

目的:构建TGFBR2基因的RNA干扰慢病毒载体,为研究该基因在结肠癌细胞中的作用奠定基础.方法:合成TGFBR2基因特异性RNAi靶序列,与pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体连接,构建干扰载体并鉴定.与TGFBR2质粒共转染HEK293细胞,qRT-PCR和Western blot方法筛选最佳干扰序列,感染SW480细胞.10ng/ml TGF-β1和20ng/ml TNF-a共作用TGFBR2干扰后的SW480细胞和未干扰组细胞72h后,通过细胞侵袭试验计算细胞侵袭数目.结果:成功构建TGFBR2的RNA干扰载体,第4组序列效果最佳,感染SW480后,TGFBR2基因的mRNA表达抑制率为78.45％.TNF-a和TGF-β1处理干扰前后的SW480细胞,通过细胞侵袭试验显示各组细胞迁移的数目:干扰组为89.3±7.9,未干扰组为15.1±8.2,干扰组细胞明显多于对照组(P＜0.01).结论:成功构建人TGFBR2基因特异性的慢病毒干扰载体,并建立稳定的细胞株,为预防和干预结肠癌的早期转移奠定基础.初步提示在TGF-β1和TNF-a因子存在的炎症微环境中,TGFBR2基因突变的结肠癌细胞更具有侵袭性.     

靶向Smad4基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的:构建编码Smad4mRNA的shRNA真核表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法:根据GenBank提供的人Smad4基因的mRNA序列构建2个shRNA质粒表达栽体和1个阴性对照质粒表达载体,并通过基因测序进行鉴定.经鉴定后转染体外培养人成纤维细胞,western-blot检测Smad4蛋白水平抑制表达效果.结果:构建质粒表达载体测序结果显示,插入片段测序结果与合成的shRNA序列一致;靶向Smad4基因shRNA质粒表达栽体对所转染的人成纤维细胞中Smad4蛋白水平表达均有抑制作用,其中shRNA1最为明显.结论:成功构建了靶向Smad4基因shRNA质粒表达栽体,其中抑制Smad4基因表达效果最为明显的是shRNA1,为进一步研究Srnad4基因的RNA干扰奠定了基础.     

RNA干扰抑制结肠癌细胞血管内皮生长因子表达

目的 应用RNA干扰技术抑制结肠癌血管内皮生长因子（VEGF）表达。方法 将VEGF基因作为RNA干扰的靶区,通过E-RNAi网上提供的服务,设计两个特异的RNA干扰序列,将其装入含U6启动子的载体上,构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA（shRNA）表达载体,再转染人结肠癌细胞HT29,通过RT-PCR、Northern杂交、免疫荧光和Western杂交,观察VEGF表达受抑的程度。结果 成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,RT-PCR、Northern杂交、免疫荧光和Western杂交,均发现其能明显抑制HT29细胞VEGF基因的表达,抑制率分别达42%、88%、73%和82%。结论 针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制结肠癌细胞VEGF基因的表达。     

RNA干扰技术抑制BAG-1在大鼠肺泡巨噬细胞表达及恢复GR抗炎效应的研究

目的利用RNA干扰技术,建立脂多糖(LPS)和地塞米松(Dex)作用大鼠肺泡巨噬细胞BAG-1基因阻断模型,并阐明BAG-1表达对糖皮质激素受体(GR)抗炎活性的影响。方法构建两个针对BAG-1的RNAi质粒表达载体,分别命名为SiBAG-1α和SiBAG-1β,经测序确认后,转染大鼠肺泡巨噬细胞。细胞免疫组织化学法检测细胞核中BAG-1表达变化;电泳迁移率改变分析法(EMSA)检测GR活性变化。结果经测序证实:成功构建两个针对BAG-1基因的RNAi(RNA干扰)质粒表达载体SiBAG-1α和SiBAG-1β;转染质粒SiBAG-1α可明显降低胞核内BAG-1蛋白表达(P<0.05),而转染质粒SiBAG-1β对胞核内BAG-1蛋白表达无明显影响;质粒SiBAG-1α转染组细胞GR活性明显明显增强(P<0.05)。结论成功地构建并筛选出一个特异而高效地阻断BAG-1表达的质粒表达载体SiBAG-1α,抑制BAG-1表达可恢复GR抗炎活性,逆转GR活性下降所致的糖皮质激素抵抗。     

人MACC1-SH3基因片段的克隆、表达载体的构建与转染

目的:本研究构建MACC1-SH3基因的真核表达栽体,为进一步研究MACC1-SH3在结肠癌细胞转移中的作用机理奠定基础.方法:本研究通过RT-PCR方法从人转移性结肠癌细胞SNU-C1中获得MACC1-SH3基因片段,并插入pRc/CMV真核表达栽体.将该质粒转染SW480结肠癌细胞株.结果:将工程菌扩增后的质粒经双酶切鉴定和基因测序证实插入片段为MACC1-SH3基因,并得到含有pRc/CMV-MACC1-SH3质粒的结肠癌细胞株.结论:通过基因工程技术构建pRc/CMV-MACC1-SH3质粒载体,并成功转染结肠癌细胞株.     

RNA干扰抑制结肠癌血管内皮生长因子的体内实验研究

目的:应用RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达,并通过体内实验,观察在体内复杂环境下能否有效抑制VEGF表达,以及结肠癌细胞凋亡的情况,为RNA干扰技术的临床应用奠定基础。方法:体内实验中,将RNA干扰质粒以水动力法导入结肠癌裸鼠模型,通过RT-PCR观察VEGF mRNA表达受抑的程度;Western杂交检测VEGF蛋白的表达情况;通过测量比较瘤体大小和Tunel法,观察VEGF受抑制后,肿瘤形态和细胞凋亡的变化。结果:体内实验中,通过RT-PCR和Western杂交检测,发现这两种抗VEGF表达载体能够有效抑抑制裸鼠结肠癌模型瘤体VEGF的表达;VEGF受抑制后,瘤体增长受到抑制,Tunel法显示,RNA干扰可致肿瘤细胞凋亡增加。结论:Tunel法分析显示,当VEGF受抑制后,肿瘤细胞凋亡发生率明显增加,针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制裸鼠VEGF基因的表达。     

SW620细胞RACK1稳定RNA干扰细胞系的构建与鉴定

目的:为研究RACK1在结肠癌发生发展中的作用,构建结肠癌RACK1基因稳定RNA干扰(RNAi)细胞系。方法:根据人Gnb211 c DNA序列,运用干扰原则选择5个干扰位点并合成相应干扰片段,定向克隆入p Lentilox3.7干扰载体鼠U6启动子后并测序验证。用干扰及对照质粒分别转染HEK293T细胞48小时后,RT-PCR鉴定干扰效率,选出干扰效率较高的质粒包装慢病毒感染人结肠癌细胞SW620,流式无菌分选出荧光阳性的细胞扩增培养,RT-PCR及Western blotting鉴定慢病毒干扰效率。使用慢病毒构建的SW620 RACK1稳定RNAi细胞系及对照组进行MTT实验初步研究RACK1对SW620增殖的影响。结果:酶切和测序证实RACK1sh RNA质粒构建正确,产生能同时表达绿色荧光蛋白(EGFP)和RACK1 sh RNA的慢病毒载体质粒。慢病毒转导SW620并流式无菌分选扩增培养后,与空载体组相比,2个RNAi组均不同程度抑制RACK1表达,RACK1sh RNA5抑制作用最明显,RACK1干扰组细胞增殖得到了抑制。结论:SW620细胞RACK1稳定RNAi细胞系构建成功,为深入研究RACK1在结直肠癌发生发展中的作用奠定了基础。     

表达血管内皮生长因子-siRNA及双自杀基因yCDglyTK的联合基因载体构建及其应用研究

构建了新型联合基因载体pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK,研究其在人胃癌细胞系SGC7901细胞中的表达和杀伤作用.构建靶向血管内皮生长因子(VEGF)的干扰质粒pGenesil-VEGF-siRNA,采用PCR法从中扩增siRNA表达框(含U6启动子),亚克隆至双自杀基因载体pcDNA3.1(-)CV-yCDglyTK,构建联合基因质粒pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK;通过酶切、测序等鉴定重组质粒;以磷酸钙纳米颗粒为载体,将干扰质粒、双自杀基因质粒及联合基因质粒转染SGC7901细胞,RT-PCR、Western-blot验证目的基因表达;MTT法检测转染细胞对5-氟胞嘧啶(5-FC)的敏感性.结果表明:酶切及测序证实联合基因载体pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK构建成功;SGC7901细胞转染联合基因质粒后,RT-PCR、Western-blot证实融合自杀基因表达,而VEGF基因表达下调;在前体药物5-FC作用下,转染联合基因组细胞存活率最低,与其他组比较有统计学差异.成功构建联合基因载体pcDNA3.1(-)VEGF-si...     

维甲酸受体β基因RNAi表达质粒的构建及其对A549细胞增殖和分化的影响

目的：利用RNA干扰（RNAi）技术,构建针对维甲酸受体（RAR）β基因的小干扰RNA（siRNA）表达质粒,诱导RARβ基因沉默,并观察其对肺癌细胞A549株的细胞周期和增殖的影响。方法：依据设计siRNA的原则。针对人RARβ的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆到pSUPER-NEO-GFP真核表达载体中构建重组体pSUPER-RAR[β转染至A549细胞中,以空质粒和RARβ高表达质粒转染为对照,用Western印迹检测RARβ基因的表达,并采用M1Tr试验检测转染后细胞株的增殖和细胞分化情况。结果：表达人类RARβ基因的siRNA重组表达质粒构建成功;MTT试验结果表明,转染的A549-RARβ-si细胞增殖能力降低。结论：采用RNAi技术特异阻断RARB基因表达,通过转染A549细胞,可使其细胞形态发生变化,并抑制其细胞生长。     

Stathmin SiRNA表达载体抑制stathmin的表达

目的:构建stathmin特异性SiRNA质粒表达载体,探讨其对鼻咽癌5-8F细胞stathmin的沉默作用.方法:合成用于stathmin基因特异性干扰表达的DNA片段,经退火形成双链DNA片段,片段克隆到质粒表达载体pGenesil 1.1上.载体导入JM109菌株进行筛选与扩增,采用酶切和测序对克隆表达载体进行鉴定.应用脂质体将鉴定后的重组表达质粒载体转入鼻咽癌5 -8F细胞,RT-PCR与Western Blot分析stathmin基因表达.结果:经酶切和测序鉴定,插入SiRNA质粒表达载体的stathmin特异性碱基序列和方向正确.重组质粒表达载体转染鼻咽癌细胞后,细胞转染效率达78.8 ±6.8％,stathmin基因在鼻咽癌中的表达明显下降.结论:构建的stathmin基因SiRNA质粒表达载体能抑制stathmin的表达.     

角鲨烯合成酶特异性mU6-siRNA真核表达载体的构建及鉴定

利用RNA干扰技术靶向构建角鲨烯合成酶基因ERG9特异性真核表达载体。将针对粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe Linder)ERG9不同部位所设计的3对siRNA序列通过重组技术克隆到质粒mU6 pro中构建真核表达重组体mU6 ERG9 siRNA1、2、3,转化DH5α菌株扩增,提取质粒通过限制性酶切和测序分析对重组表达载体进行鉴定,分析结果表明3个表达载体的设计基因插入正确,成功构建了ERG9特异性真核表达载体mU6 ERG9 siRNA,重组体的成功构建为在裂殖酵母细胞中靶向RNA干扰角鲨烯的合成从而提高辅酶Q10合成途径的代谢通量打下基础。     

沉默FNBP1基因对人HL-7702细胞体外增殖及迁移能力的影响

为了研究沉默FNBP1(formin-binding protem1)基因对细胞体外增殖以及对细胞迁移能力的影响,设计并构建了3个靶向FNBP1 siRNA干扰载体(Si-1,Si-2,Si-3),经酶切和DNA测序鉴定后转染人正常的肝细胞HL-7702。RT-PCR和Western blot检测瞬时转染细胞中FNBP1基因的干扰效率,筛选出特异高效的RNAi靶点。并用G418筛选稳定表达了RNAi的细胞株,用XTT法检测细胞体外增殖率,划痕法检测细胞的迁移能力。结果显示:酶切和测序结果证明干扰质粒构建正确;转染特异性的干扰质粒(Si-1、Si-2、Si-3)细胞的FNBP1基因表达量与对照组相比均有所降低,在蛋白质水平表达也明显受到抑制,且重组干扰质粒Si-2的干扰效应较强。XTT检测结果表明,构建的沉默FNBP1重组质粒Si-2能显著抑制HL-7702细胞的体外增殖能力,但并不直接影响HL-7702细胞的迁移能力。     

DLC-1基因表达对结肠癌细胞侵袭转移能力的影响

目的:研究DLC-1基因对结肠癌细胞侵袭迁移能力的影响.方法:将DLC-1 shRNA(短发夹状RNA,short hairpin RNA)序列克隆到质粒pGCsi-U6/Neo载体,采用脂质体介导的转染方法将构建的DLC-1 shRNA表达质粒转入结肠癌细胞系LoVo细胞.采用RT-PCR技术和Western Blot技术分别检测LoVo细胞中DLC-1mRNA和蛋白表达水平的变化.Transwell小室人工重组基底膜侵袭转移实验观察LoVo细胞侵袭迁移能力的改变.结果:结肠癌细胞系LoVo细胞表达DLC-1分子.所构建质粒表达载体能有效地干扰LoVo细胞DLC-1 mRNA和蛋白质表达水平;Transwell小室人工重组基底膜侵袭转移实验结果显示,转染后LoVo细胞侵袭转移能力明显增强(p＜0.05).结论:结肠癌细胞系LoVo细胞表达DLC-1基因,应用RNAi技术可特异性降低其表达.DLC-1的表达水平与结肠癌细胞侵袭转移相关.     

RNA干扰敲减PIWIL1表达对人结肠癌细胞SW620增殖，粘附及侵袭能力影响

PIWIL1为AGO蛋白(Argonaute proteins )PIWI亚家族的成员之一,在睾丸中特异表达. 其在干细胞自我更新、RNA干扰和翻译调节中起着重要的作用.本文采用实时PCR方法检测PIWI基因家族中PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4在人结肠癌SW620细胞中mRNA表达水平,首次证实了在SW620细胞中,PIWIL1相对PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4,其表达水平最高（P﹤0.05）.构建表达针对PIWIL1的小发卡结构干扰RNA的重组质粒,并用Western 印迹验证其达到较高的干扰效率.用脂质体将重组质粒转染入SW620细胞中,通过MTT实验、集落形成实验、细胞聚集实验及细胞侵袭转移实验,分别观察到其可抑制SW620细胞的生长、增殖、侵袭转移能力,增强了SW620细胞的粘附能力.提示PIWIL1可能在结肠癌发生、发展过程中发挥作用.     

Spl基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的:构建干扰载体pSilencer 3.1-spl,并初步研究其对Spl基因的干扰作用.方法:根据Spl cDNA编码序列,设计并合成针对Spl基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer 3.1-Hl neo干扰载体中,构建Spl基因小干扰RNA(siRNA)真核表达载体pSilencer 3.1-Spl;分别将阴性对照载体pSilencer 3.1与重组载体pSilencer 3.1-Spl经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Spl基因的转录与表达水平.结果:构建了Spl基因siRNA真核表达载体pSilencer 3.1-Spl,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果.结论:特异性siRNA能明显抑制Spl基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Spl的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.     

人Notch1受体shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人特异性受体Notch1短发夹RNA重组腺病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞中Notch1表达的影响,以便进一步研究Notch1的生物学功能.方法:设计合成Notch1序列干扰序列,插入到pGenesil-1.1上构建重组质粒,取阳性克隆进行酶切及DNA测序鉴定.通过同源重组,构建含目的基因的重组腺病毒质粒栽体pGsadeno-Notch1-shRNA.经PacI线性化后脂质体介导转染到HEK 293细胞,包装后得到腺病毒颗粒.产生的重组腺病毒体外转染人脐带间充质千细胞,RT-PCR和Western blot 检测特异性shRNA对人脐带间充质干细胞中Notch1蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果.结果:经酶切及DNA测序重组腺病毒质粒构建正确.重组腺病毒转染人脐带间充质干细胞3d后,RT-PCR及Western blot检测,可显著下调细胞内Notch1的转录及蛋白表达水平.对Notch1 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为70.31％和86.97％,具有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建了表达人Notch1受体shRNA的重组腺病毒载体,为研究Notch1在肿瘤学中的生物学作用及机制奠定基础.