转录因子DREB1A和DREB2A调控机制的比较分析

DREB转录因子即干旱应答元件结合蛋白质,它能特异结合启动子中含有DRE／C1KT顺式元件,激活许多逆境诱导基因的表达,增强植物对逆境的忍耐力。从DREB1A和DREB2A转录因子结构、功能、调控表达的基因以及蛋白稳定性等方面进行比较分析,为植物抗逆转录因子研究及应用提供依据。     

程序化设计简并引物与克隆小菜蛾酯酶基因

利用遗传密码简并性 ,针对特定的氨基酸序列设计简并引物 ,是克隆蛋白质家族cDNA的常规方法。文章介绍了利用blastp ,blockmaker,CodeHop ,SwissProt,SpTrEMBL等网络工具及数据库设计昆虫抗性酯酶的简并引物。用这对引物从抗有机磷杀虫剂的小菜蛾Plutellaxylostella中克隆了 1段cDNA。经blastx检索genebank,发现此cDNA产物与其它昆虫抗性酯酶基因有高度的相似性。研究表明 ,程序化设计的简并引物可信性强 ,阳性率高 ,能迅速得到满意结果     

‘神马’菊花DREB1A基因的分离及同源遗传转化

逆境诱导转录因子DREB1A基因在植物中的超量表达能够提高植株对低温、干旱、盐渍、高温等非生物胁迫的耐性。从菊花中克隆得到DgDREB1A基因,构建了转基因表达载体pBIG-DREB1A,并转入农杆菌LBA4404中;在建立了菊花高效再生体系的基础上,优化受体再生体系,通过根癌农杆菌介导将DgDREB1A基因转入切花菊‘神马’品种。PCR结果显示,在获得的38株卡那霉素抗性植株中有8株为阳性,表明外源基因已整合到转化植株基因组中,转化效率为3‰。本研究为培育综合抗逆性良好的菊花新品种奠定工作基础。     

利用简并引物克隆黑莓、树莓肌动蛋白基因片段及表达分析

采用同源克隆法,利用设计的一对肌动蛋白(actin)基因简并引物,从黑莓、树莓和悬钩子杂种3个悬钩子植物品种均得到一条743 bp的actin cDNA片段,推测编码247个氨基酸.序列比对发现,克隆的actin基因推导的氨基酸序列和其他植物的肌动蛋白氨基酸序列具有高度保守性,经数据库搜索后将来自黑莓和树莓品种的actin cDNA片段在GenBank中登录,登录号分别为HQ439558和HQ439559.不同来源的植物actin蛋白系统进化树的聚类结果表明,树莓和悬钩子杂种亲缘关系较为密切.actin基因在3个悬钩子植物品种不同组织中的RT-PCR分析结果表明,其在检测的不同组织中均有一定程度的表达量,可能都属于组成型表达的肌动蛋白基因.研究结果为利用actin基因作为内参进一步研究黑莓和树莓其他基因的丰度奠定基础.     

火炬松DREB1基因的电子克隆与生物信息学分析

利用来自Forest TreeDB数据库中热胁迫cDNA文库ESTs聚类、拼接组装的Unigene以及基因GO注释,得到了假定的火炬松DREB1基因,全长1 293bp,具有完整的蛋白编码框的cDNA序列。采用DNAMAN软件分析碱基组成、限制酶切位点和重复序列等,结果发现,该序列与其他物种中克隆得到的DREB1具有较高的同源性,初步断定所电子克隆得到的cDNA序列为火炬松DREB1基因(PteaDREB1)。在此基础上,利用网上的公共数据库和相关软件(Antheprot等)对PteaDREB1编码的理化性质和一级结构进行分析,并模拟了其二级结构和三级结构。结果表明,该蛋白为疏水性非球形可溶蛋白,含有295个氨基酸,分子量为32.4kD,等电点为8.22;其二级结构以螺旋和卷曲为主,三级结构具有DREB蛋白家族中典型的结合DNA的AP2结构域。这进一步说明所克隆到的cDNA片断为火炬松DREB1基因。上述研究结果可为PteaDREB1基因下一步的分子克隆、功能鉴定和应用奠定基础,具有一定的现实意义和应用前景。     

Prd29A及DREB1A的克隆和干旱诱导型植物表达载体的构建与鉴定

从拟南芥中克隆了RD29A基因的启动子(Prd29A)及DREB1M基因的DNA片段,构建Prd29A:DREB1A融合基因,采用合成的接头将该融合基因插入到植物表达载体pBI121中,经鉴定,确认正确.     

基因枪法获得逆境诱导转录因子DREB1A转基因小麦的研究

以小麦品种H6756和藁城8901作为基因枪转化的靶材料,取其护颖至雌雄蕊原基形成期的幼穗,用含逆境诱导转录因子DREB1A和bar基因的质粒pAHC25轰击胚性愈伤组织,在分别含有5mgL和10mgLBasta溶液的培养基上进行筛选。得到的抗性愈伤组织在不含Basta溶液的培养基上再生培养,获得218棵再生植株。田间涂抹浓度为100mgL的Basta溶液检测后,对抗性植株作PCR检测,获得54棵再生植株。通过对其中20株T1代的PCR和Southern杂交分析,已获得14株含DREB1A和bar基因的转基因小麦植株,其中H675613株,藁城89011株。     

拟南芥、荠菜DREB1A基因的克隆与植物表达载体的构建

用PCR方法从拟南芥和荠菜中分别克隆了DREB1A基因.序列分析发现从拟南芥中克隆的AtDREB1A基因与已发表的AtDREB1A基因序列(DQ372533)的同源性为99.69%.首次从荠茱中克隆的CbDREB1A基因序列(EF156749)与DQ372533的同源性为99.54%.利用这两个基因分别构建了两个诱导表达载体(prd29A/AtDREB1A,prd29A/CbDREB1A)和两个组成型表达载体(pCaMV35S/AtDILEBlA,pCaMV35S/CbDREB1A),以便进一步开展植物抗旱基因工程研究.     

拟南芥DREB 1A转录因子的原核表达和多克隆抗体制备

采用PCR技术,从质粒pCAMBIA 1301/DREB 1A中扩增拟南芥DREB 1A转录因子的编码序列,并将其插入原核表达载体pGEX-4T-1中诱导表达,获得分子量约50.4 kDa的融合蛋白,经融合蛋白纯化酶切后免疫家兔获得DREB 1A转录因子特异性的多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定表明,所制备的多克隆抗体的稀释倍数为25 600时,显色仍清晰可见。     

简并PCR技术及其在基因克隆中的应用

本文简要介绍简并PCR技术,包括什么是简并引物,如何设计简并引物,进行简并PCR的反应条件,应用简并PCR获得全长基因的方法和简并PCR技术的应用范围,并对简并PCR技术的局限性及其新进展进行讨论。在此基础上,简述基因的克隆策略以及简并PCR技术在基因克隆中的应用。简并PCR技术是寻找和发现“新”基因或蛋白质家族新成员的一种非常有用的工具。 Abstract:Degenerate PCR is introduced in this paper,including what is degenerate PCR,how to design degenerate primers,how to optimize degenerate PCR parameters,how to applying degenerate PCR to obtain full-length gene and which fields can apply degenerate PCR.The limits and recent advances of degenerate PCR are also discussed.Based on this introduction,strategies of gene cloning and applications of degenerate PCR in gene cloning are summarized in brief.Degenerate PCR is a very useful tool for searching and discovering new genes and new members of a protein family.     

植物DREB转录因子的研究进展及应用

转录因子是一种DNA结合蛋白,通过与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性相互作用来调控基因的转录。DREB(与干旱应答元件结合的)转录因子是一类新发现的植物特有的转录因子,能够特异地识别DRE(干旱应答元件)顺式作用元件并与之发生作用,从而激活植物体内一系列逆境应答基因的表达。本文综述了近几年在DREB转录因子的结构、功能、表达调控以及应用方面的研究进展。     

水曲柳FmWRKY44基因克隆及表达分析

克隆水曲柳FmWRKY44基因,探究其在非生物胁迫和激素胁迫中的作用。利用水曲柳干旱转录组序列设计特异引物,克隆FmWRKY44基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用qRT-PCR技术分析FmWRKY44表达模式。克隆了一个水曲柳WKRY基因,编码区长1383bp,编码460氨基酸。对其编码蛋白分析发现其为稳定亲水蛋白,亚细胞定位预测主要在细胞核,进行保守域及同源性分析分析,属于WRKYⅠ类家族,命名为FmWRKY44。qRT-PCR分析发现,FmWRKY44在种子中高度表达,并不同程度响应低温、高温、盐和干旱4种非生物胁迫。同时发现FmWRKY44与NAA、ABA、GA3、JA植物激素响应,水曲柳FmWRKY44基因积极响应低温、高温胁迫。     

PCR引物特异性核查系统(PSC)的构建与应用

聚合酶链式反应(PCR)虽已广泛用于分子生物学研究中,然而PCR实验中的非特异性产物问题将直接影响PCR的效率,在多重PCR实验中更是如此。为了最大限度地降低非特异性产物的出现率,同时避免用户频繁使用Blast比对检查非特异性,我们开发了基于NCBI-Blast的引物评估和模板DNA特异性结合能力评估的核查系统PSC(Primer Specificity Checking,http://biocompute.bmi.ac.cn/PSC),并基于虚拟PCR实验确定了用于引物质量核查计算的多种参数,能够在线提供多个物种的引物特异性核查结果。该系统可以有效地对引物序列可能产生的所有非特异性扩增进行预测,有助于实验前引物优化或者对非特异扩增结果进行解释,最终达到提高PCR效率的目的。     

Methodology for using a universal primer to label amplified DNA segments for molecular analysis

Detection of human DNA polymorphisms using high throughput methods often relies on generating a labeled DNA fraament which is generated by PCR using sequence-specific primers with an end labeled tag to detect a variant. The disadvantage of the synthesis of an end-labeled, sequence-specific primer to assay each DNA variant lies in the costs and time consume. In this report, we have demonstrated a methodology that can generate labeled DNA fragments using a labeled universal primer instead of requiring sequence-specific primers for each DNA variant.     

水曲柳花发育过程中AG、SOC1基因表达的qRT-PCR分析

以水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)不同时期的雌雄花为材料,应用实时荧光定量PCR技术,分析了18S rRNA、GAPDH、β-actin和TU 4个常用内参基因在水曲柳花中的表达情况。经NormFinder软件分析选择出TU作为内参基因,并对水曲柳中的开花相关基因AG和SOC1在开花不同时期的表达情况进行了分析,结果表明：在水曲柳花发育期间AG、SOC1表达量在雌雄花间存在差异,AG基因在雌花初期表达量最高,之后逐渐降低,到了成熟胚囊时AG表达量又有所增加;而在雄花中AG在减数分裂时最高为1.53。SOC1基因在雌花中的表达量低于雄花。这一研究结果为深入了解水曲柳花发育过程中相关基因的表达提供理论依据。