人端粒酶催化亚基基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体

为获得端粒酶阳性肿瘤细胞特异表达载体用于癌症的基因治疗 ,克隆并构建了人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因启动子调控的萤光素酶报告载体 .用脂质体转染法将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞 ,检测其在肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性 .hTERT启动子在所检测的 4种端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性 ,平均为阳性对照的 4 4 3% ;而在端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞中则无明显的转录活性 .提示hTRET启动子的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显上调 ,由hTERT启动子构建的载体可能是一种新颖和有前景的肿瘤细胞特异性表达的基因治疗载体     

人端粒酶催化亚基(hTERT)基因及其表达调控

端粒酶是一种核糖核蛋白复合物 ,能引起染色体的末端结构端粒的完全复制。端粒作为一种保护性结构 ,是由短的重复ＤＮＡ序列组成。在人体中这种序列为ＴＴＡＧＧＧ ,其平均长度为 5～ 1 5ｋｂ[1] ,细胞每经过一次分裂端粒缩短 50～ 2 0 0ｂｐ ,这种分子侵蚀作用使得细胞的分裂次数有了生理限制 ,从而限制了体细胞的寿命。一种逃避这种限制的机制是端粒酶的激活 ,因为端粒酶能弥补端粒的缩短 ,因此端粒酶被认为与细胞的永生化、肿瘤发生和细胞衰老密切相关。近来 ,组成人端粒酶复合物的 3个主要成分已被鉴定。人端粒酶ＲＮＡ成分 (ｈＴＲ)提…     

A33启动子结肠癌特异性探究及SV40增强子对其转录活性影响

为了探究A33核心启动子结肠癌特异性及SV40增强子对其转录水平的影响,该研究通过构建A33核心启动子和带SV40增强子的A33核心启动子(eA33)的荧光素酶报告基因载体pGL3-A33和pGL3-eA33,与内参照pRL-SV40质粒共转染至不同的细胞系中,利用双荧光素酶检测系统检测分析了A33和eA33启动子在不同细胞系中的转录活性。结果显示,A33核心启动子在结肠癌细胞系中具有转录活性低,但结肠癌特异性好的特点,而在其他类型癌细胞中基本没有活性。同时发现,eA33在各类癌细胞中的转录水平与A33相比,均呈大幅度提高,有显著性差异(P<0.01),但SV40增强子能显著增强A33启动子转录活性的同时减低了其结肠癌特异性。这为靶向癌症基因—病毒治疗策略在结肠癌的生物治疗应用中寻找结肠癌特异性的启动子奠定了研究基础。     

人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因第3内含子的克隆和分析

从端粒酶活性呈阳性的永生细胞株人肺腺癌细胞SPC A 1中分离了总RNA ,以此为模板 ,结合RT PCR技术和长模板PCR技术 ,用hTERT基因特异性引物扩增到一长约 2 .2kb的cDNA片段。将该片段纯化后克隆到通用测序载体T easyvector上得到重组质粒。用测序引物SP6和T7对该片段进行部分双向测序。经序列分析和同源比较推测该片段包含了hTERT基因的第 3内含子。该结果提示了RT PCR技术和长模板PCR技术用于真核生物基因内含子克隆的可行性。进一步的分析表明 ,该片段在不同细胞的RT PCR产物中的产量不同 ,提示hTERT基因前体mRNA中的第 3内含子可能在不同细胞中有不同的剪接效率。     

加热调控的溶瘤腺病毒载体构建及其特征研究

溶瘤腺病毒作为近年来新兴的肿瘤基因治疗策略,因具有“细胞溶解”和“旁观者效应”而备受关注．构建了受热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)基因启动子调控的溶瘤腺病毒载体Ad-HSP70p-E1A,观察该病毒与热疗联合应用对肺癌细胞生长的抑制作用和带动治疗基因在肺癌细胞中表达的效果．体外实验结果表明,Ad-HSP70p-E1A在肺癌细胞株A549内能较好地实现自身复制,并产生一定的溶瘤作用,在联合热疗后,Ad-HSP70p-E1A的自身复制能力和溶瘤效果分别增强了2～10倍和5倍以上．此外,Ad-HSP70p-E1A还可通过反式提供E1A蛋白而使10 moi用量的复制缺陷型腺病毒AdGFP、Ad-CMV-hGMCSF和Ad-CMV-mIL12的表达提升76.64倍、5倍和7倍．     

TAT蛋白质转导结构域与SV40启动子特异的三锌指结构融合蛋白的表达与纯化

利用蛋白质转导结构域(PTDs)可以将与之融合表达的蛋白质直接送入细胞中。将通过筛选噬菌体展示锌指库得到的特异作用于SV40启动子上9bp序列的三锌指结构的序列插入含有TAT蛋白的蛋白质转导结构域的表达载体pET—TAT-NLS中,构建融合蛋白的表达载体pET-TAT-NLS—clone3。融合蛋白在E．coli BL21(DE3)中得到了可溶性表达,含量约占总蛋白的18％;并通过镍亲和凝胶层析柱得到了较好的纯化融合蛋白。     

survivin启动子驱动的shRNA在宫颈癌SiHa细胞中的特异性表达

研究survivin启动子驱动的小发夹RNA(shRNA)在宫颈癌SiHa细胞中的特异性表达.PCR扩增survivin启动子,构建以survivin启动子驱动增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达的真核表达载体pEGFP-C1/Surv,并检测survivin启动子的活性;构建针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6,并检测shRNA在U6启动子驱动下的干扰效果;用有活性的survivin启动子取代pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6载体中的U6启动子,从而获得新的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/Surv;将pGenesil-1-EGFP-shRNA/Surv转染到宫颈癌SiHa细胞及正常人脐静脉内皮HuVEC细胞,观察EGFP在两种细胞中的表达变化.结果表明,成功扩增survivin启动子并验证该启动子具有活性;成功构建EGFP shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6,并验证shRNA在U6启动子驱动下具有较好的干扰效果;成功构建pGenesil-1-EGFP-shRNA/Surv载体,分别转染SiHa及HuVEC细胞,在SiHa 细胞中观察到较少的绿色荧光蛋白表达,而在HuVEC细胞中观察到较多的绿色荧光蛋白表达.survivin启动子能驱动shRNA在宫颈癌SiHa细胞中特异性表达,而在正常HuVEC细胞中不表达.     

癌胚抗原(CEA)启动子在肿瘤细胞中的特异表达及介异bak基因诱发凋亡

构建由癌胚抗原 (CEA)启动子控制报道基因增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)表达的重组表达质粒pCEA EGFP .用转染细胞后检测荧光的方法对CEA阳性细胞进行简便、直观的检测 ,并结合流式细胞计数对CEA启动子在人结直肠腺癌细胞LS 1 74T、结肠癌细胞SW 4 80、肺腺癌细胞A5 49、人宫颈癌细胞HeLa和人喉癌细胞HEp 2中的活性进行了分析 ,发现其在SW4 80、LS 1 74T、A5 49中活性较强 ,而在HeLa和HEp 2中无活性 .构建由CEA启动子控制凋亡基因bak表达的重组表达质粒pCEA bak ,转染HeLa及SW 4 80细胞 ,用Hoechst332 5 8染色及PI染色 流式细胞计数分析的方法证明 ,pCEA bak转染能够特异性引起SW 4 80细胞的凋亡 .结果表明 ,CEA启动子具有很好的特异性 ,CEA介导bak基因的方法可望用于CEA阳性癌细胞的靶向性基因治疗 .     

含p27启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p27基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p27启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果显示扩增的p27启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p27报告基因的转录。结论:克隆了p27启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

含p21启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p21基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p21启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果表明扩增的p21启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p21报告基因的转录。结论:克隆了p21启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

Mammalian cell lines can be efficiently established in vitro upon expression of the SV40 large T antigen driven by a promoter sequence derived from the human vimentin gene.

The aim of this study was to investigate a new method to enhance the efficiency to create mammalian cell lines. Cell immortalization was achieved by intranuclear microinjection of a recombinant DNA construct composed of a constitutive promoter controlling the genes encoding immortalizing proteins; the sequences coding for the large T and small t antigens were fused downstream of regulatory elements from the vimentin gene, the activation of which characterizes the vast majority of cells growing in vitro. Data show that the efficiency of the immortalizing procedures using the SV40 early genes could be enhanced by the control elements derived from the human vimentin (HuVim) 5' sequences that contained nucleotides -878 to +93 from the CAP site. This HuVim 830-T/t recombinant was used to create cell lines from numerous primary cultures of different origins: rabbit, porcine and human endothelial cells, rabbit and bovine epithelial cells. A set of large T-expressing cells was derived, and these cells retained characteristics of differential cells: binding of Ulex europaeus lectin and synthesis of Factor VIII for human endothelial cells; network of cytokeratin for bovine oviductal cells and rabbit mammary cells.     

特异性人端粒酶催化亚单位基因小干扰RNA对HeLa细胞生长的抑制作用

通过设计并化学合成人端粒酶催化亚单位(hTERT)特异性siRNA,观察其对hTERT表达水平及肿瘤细胞生长的影响。将hTERT-siRNA以脂质体法转染入HeLa细胞,应用RT-PCR、实时定量TRAP、Western印迹、软琼脂克隆形成实验、荷瘤裸鼠肿瘤内注射等方法检测细胞内hTERTmRNA、蛋白质表达水平及对肿瘤细胞生长的影响。RT-PCR、实时定量TRAP和Western印迹的结果显示hTERT-siRNA明显降低了HeLa细胞内hTERT的mRNA及蛋白质表达水平并伴随有端粒酶活性的下降。克隆形成实验表明hTERT-siRNA组的体外肿瘤形成能力受到抑制。荷瘤裸鼠肿瘤内注射hTERT-siRNA使肿瘤平均体积显著小于对照组。TUNEL凋亡检测表明hTERT-siRNA转染组的凋亡率明显高于对照组。研究表明hTERT特异性siRNA可以明显抑制HeLa细胞内hTERT的表达水平,对其生长有明显抑制作用,是一种有前途的肿瘤治疗新方法。     

Two Inactive Fragments of the Integral RNA Cooperate To Assemble Active Telomerase with the Human Protein Catalytic Subunit (hTERT) In Vitro

We have mapped the 5' and 3' boundaries of the region of the human telomerase RNA (hTR) that is required to produce activity with the human protein catalytic subunit (hTERT) by using in vitro assembly systems derived from rabbit reticulocyte lysates and human cell extracts. The region spanning nucleotides +33 to +325 of the 451-base hTR is the minimal sequence required to produce levels of telomerase activity that are comparable with that made with full-length hTR. Our results suggest that the sequence approximately 270 bases downstream of the template is required for efficient assembly of active telomerase in vitro; this sequence encompasses a substantially larger portion of the 3' end of hTR than previously thought necessary. In addition, we identified two fragments of hTR (nucleotides +33 to +147 and +164 to +325) that cannot produce telomerase activity when combined separately with hTERT but can function together to assemble active telomerase. These results suggest that the minimal sequence of hTR can be divided into two sections, both of which are required for de novo assembly of active telomerase in vitro.     

Transformation of adult ventricular myocytes with the temperature sensitive A58 (tsA58) mutant of the SV40 large T antigen

Freshly isolated ventricular myocytes have been used extensively as an adult cardiac model system. Due to their inability to undergo cytokinesisin vitro and their dedifferentiated properties in long-term culture, they can not be used for extended studies. Recent reports tell of the establishment of fetal and neonatal cardiac cell lines and the development of adult cardiomyocytes from transgenic animals. A recent report by Kirshenbaum [1], is the first to demonstrate insertion of genes in to adult ventricular myocytes using viral infection. This paper discusses the infection of primary adult differentiated cardiomyocytes with the SV40 large T antigen and subsequent proliferation under temperature sensitive control. Upon further characterization, the cells could be used as a model to study muscle differentiation and repair as well as adult cardiac cell physiology.     

诱导方式对P_L启动子控制下人工合成心钠素28肽基因转录动态变化的影响

本文用含有人工合成28肽心钠素基因质粒的大肠杆菌(TAP106-pYX40),分别进行温度诱导和丝裂霉素C诱导,提取菌体中的总RNA,与γ-~(32)P标记的心钠素基因片段进行RNA打点杂交,并通过测定杂交阳性信号的总灰度值(Totalgray value),建立了人心钠素基因特异mRNA相对定量方法,从而观察到温度诱导对P_L启动子控制下的心钠素基团转录发生得慢,特异的mRAN产量较低,但转录所持续的时间长,而丝裂霉素C诱导对P_L启动子控制下的心钠素基因转录发生得快,特异mRNA产量高,但持续的时间短。