一种小鼠可溶性Fas cDNA的克隆与表达

为获得调节鼠Fas Fas配体系统诱导凋亡的作用 ,根据GenBank中小鼠Fas基因碱基序列 ,设计扩增可溶性Fas(solubleFas ,sFas)引物 ,用RT PCR方法从幼鼠胸腺组织中克隆出与人可溶性Fas类似的新的鼠sFas (FasC)cDNA序列 .该序列缺乏Fas基因的跨膜区片段 ,但不改变其阅读框 .采用定向克隆的方法将之插入pUC19中间载体 ,DNA序列测定证实该片段序列与预期序列完全一致 .利用亚克隆的方法将鼠FasC的cDNA片段克隆到真核表达载体pCA13上 ,构建出重组载体pCA13 FasC ,通过脂质体LF2 0 0 0转染至 2 93细胞 .RT PCR和Western印迹证实 ,鼠FasC在 2 93细胞获得高效表达 .凋亡诱导实验表明 ,鼠FasC的表达可阻断Fas诱导凋亡的作用 ,证实了所转染鼠FasC的生物活性 .     

Expression of Inducible Nitric Oxide Synthase and Fas/Fas Ligand Correlates with the Incidence of Apoptotic Cell Death in Atheromatous Plaques of Human Coronary Arteries

It was recently reported that inducible nitric oxide synthase was expressed in advanced atheromatous plaques. So we investigated the effect of NO or peroxynitrite reactive product of NO or O(2)(-) released by iNOS induced in macrophages or T lymphocytes on inflammatory cells in atheromatous plaques of human coronary arteries by immunohistochemistry. We found that iNOS was expressed in T lymphocytes and macrophages in T lymphocytes and macrophages coexisted advanced atheromatous areas. Most of the smooth muscle cells are not coexisted with T lymphocytes. We could not find iNOS in those smooth muscle cells. Only a small number of iNOS-positive smooth muscle cells were found close to T lymphocytes and macrophages. Markers for apoptotic cells induced in situ terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) showed that many apoptotic T lymphocytes and macrophages existed near iNOS induced cells. Fas and Fas ligand were expressed in almost same areas that iNOS was expressed. By double-label immunostaining, Fas was expressed in T lymphocytes but Fas ligand was expressed in macrophages and in some T lymphocytes. These results suggest that NO from iNOS induces Fas and Fas ligand-mediated apoptosis and associates with regression of atherosclerosis. On the other hand, nitrotyrosine was detected wider areas than iNOS. So peroxynitrite from iNOS damages cells and tissues widely and may associate with progression of atherosclerosis. These results suggest an important role of iNOS in mediating both regressive changes and progressive change in atheromatous plaques.     

人类新基因Bzw2的克隆、抗体制备及表达分析

Bzw2( basic leucine zipper and W2 domains 2)基因是人类心脏发育候选基因,它由bzip结构域和W2结构域构成.为了研究该基因在心脏发育过程中的作用,利用生物信息学信息克隆了人类Bzw2基因全长,将所得的片段插入到原核表达载体pGEXT-4T-1载体中,利用BL21菌株表达该重组...     

小鼠Peroxiredoxin 6基因克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

过氧化物氧还酶6(peroxiredoxin6,Prdx6)是一种双功能蛋白质,具有GSH过氧化物酶和磷脂酶A2活性。前期研究构建布鲁氏菌强弱毒株感染绵羊白细胞层SSH c DNA文库,发现Prdx6在不同毒力布鲁氏菌感染时存在一定的差异性表达,推测Prdx6可能在布鲁氏菌感染中发挥一定的作用。为了更好地研究其在生物体中的作用,以RT-PCR技术,提取小鼠巨噬细胞系RAW264.7总RNA,反转录制备c DNA,设计特异引物克隆Prdx6开放阅读框核酸序列,并构建原核表达载体,进行原核表达,以镍柱纯化获得纯度较高的Prdx6蛋白,免疫家兔制备高特异性、高灵敏度的鼠Prdx6兔源多克隆抗体,为后续进一步研究Prdx6蛋白功能提供科学依据和应用工具。     

人类新基因ANKZF1的克隆与表达研究

心脏发育是一个非常复杂的过程,受一系列基因的精确调控.研究表明,许多锌指蛋白参与心脏的形成和疾病的发生.为了鉴定新的与心脏发育有关的人类锌指基因,运用同源基因克隆法,通过PCR技术扩增获得一个新的人类基因,其cDNA全长2459bp,其编码的蛋白由342个氨基酸残基组成(相对分子质量约为7.45kD).经国际人类基因命名委员会批准被命名为ANKZF1.该基因是哺乳动物物种特有基因.利用RTP-CR技术分析表明,该基因在胚胎的心脏、胃、肾和脑组织中有特异性的表达,提示该基因可能与心脏等组织的发育有关.     

COX-2的基因克隆和多克隆抗体制备

环氧合酶-2（COX-2）是一种具有多种功能的神经调节物质,它的许多功能细节仍不十分清楚,还需要进一步深入研究.用PCR技术从大鼠脑cDNA文库中,扩增到正常成年大鼠COX-2的cDNA序列,测序结果与已发表的序列一致.通过PCR扩增和基因重组,分别构建COX-2编码基因全长和羧基端部分编码序列的表达载体,并导入大肠杆菌DH5α中,通过IPTG诱导表达重组融合蛋白,结果导入全长编码基因表达载体的DH5α无COX-2融合蛋白表达,而羧基端部分基因编码的COX-2融合蛋白在DH5α中以包涵体的形式进行表达.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,在相对分子质量（M_r）为44 000处有1条特异的蛋白质条带.对以包涵体形式表达的蛋白质进行变性、重折叠及纯化后,得到了高纯度融合蛋白.以重组融合蛋白免疫新西兰种大白兔,制作了抗COX-2多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹和免疫细胞化学方法检测,此抗体具有较高效价和特异性.COX-2基因和多克隆抗体的获得,为进一步研究COX-2的功能创造了条件.     

抗SARS 人源单链抗体H12的表达及复性

从SARS免疫抗体库获得的一株抗SARS-CoV人源单链抗体H12,亟待鉴定.为了快速制备大量具有生物活性的单链抗体H12,构建了pET28a-H12原核高表达载体,表达量占菌体总蛋白质30%以上.采用稀释复性和分子筛柱复性两种方法对包涵体蛋白进行复性与纯化,结果显示两种方法都能使得单链抗体复性.与稀释复性法相比,柱复性效果更好,其抗原结合活性是稀释复性法的1.51倍.柱复性后的单链抗体亲和力测定的解离常数Kd为73.5nmol/mL.为进一步研究单链抗体H12的功能奠定了基础.     

一个新的人类睾丸特异基因的cDNA克隆和表达分析

运用“数据库消减杂交”(DigitalDifferentialDisplay)方法筛选人类睾丸特异表达新基因 ,获得了有差异显示的代表新基因的克隆重叠群 ,挑选其中一个克隆重叠群HS .12 9794进行多组织RT PCR ,初步证实该重叠群在人睾丸中有高表达。然后从包含该重叠群的IMAGE克隆出发 ,采用生物信息学的方法快速克隆了一个人类新基因的全长cDNA序列 ,其全长 2 4 30bp ,开放阅读框为 6 76～ 12 4 8bp ,定位于 3p2 1 1,编码由 190个氨基酸组成 ,分子量为 2 0 4 17 8Da ,等电点为 5 2 3的一个偏酸性蛋白质 ,该蛋白与已知蛋白质无明显同源性。克隆实验验证该基因阅读框完全正确 ,半定量RT PCR进一步显示该基因在人不同发育时期的睾丸及精子细胞中有表达 ,推测其可能与精子生成相关 ,暂命名为SRG5 (TestisSpermatogenesisRelatedGene 5 ,SRG5 ) (GenBank登录号 :AY2 2 1117)。SRG5基因的成功克隆表明 ,“数据库消减杂交”与实验验证相结合的技术路线是一种快捷高效的发现更多人类功能新基因的新策略。     

人CD24分子成熟多肽的原核表达及抗体制备

目的: 为获得抗人CD24分子成熟多肽核心蛋白(hCD24N)的多克隆抗体。方法: 制备CD24表达阳性的人肿瘤细胞cDNA,采用PCR法扩增hCD24N的编码基因,构建pGEX-KGV-hCD24N原核表达质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3),乳糖诱导表达;经GST亲和柱层析、SDS-PAGE和Western blotting制备并鉴定纯化的GST-StraptagII-hCD24N融合蛋白;免疫新西兰大白兔制备抗血清并用rProtein A亲和柱层析纯化多克隆IgG抗体;用间接ELISA法测定抗体效价,Western blotting鉴定抗体特异性,同时采用细胞免疫荧光检测技术对抗体的特异性和应用可行性作进一步评价。结果: 实现了hCD24N基因的克隆以及在原核细胞中的可溶性重组融合表达,得到了纯化后的目的融合蛋白,并以其为免疫原获得了效价高于1:100 000的抗hCD24N多克隆抗体,Western blotting及细胞免疫荧光检测证明该抗体与当前市售的抗人CD24抗体具有相似的免疫反应特异性,并且能够与CD24阳性人肿瘤细胞表达并加工的高度糖基化CD24天然分子发生特异性抗原-抗体反应。结论: 抗hCD24N多克隆抗体的成功制备为进一步以CD24分子为靶点的肿瘤生物学基础研究以及相关癌症的诊断试剂开发奠定基础。     

DC-SIGN胞外区基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

旨在构建DC-SIGN胞外区基因原核表达质粒,诱导蛋白表达并制备多克隆抗体。用PCR的方法扩增编码DC-SIGN胞外区的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,利用大肠杆菌表达系统表达DC-SIGN胞外区蛋白,用H is抗体做W estern Blotting鉴定目的蛋白的免疫原性。用纯化的DC-SIGN胞外区蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,免疫荧光法检测其特异性。结果显示,原核表达载体pET-28 a(+)-DC-SIGN胞外区基因成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,获得相对分子质量约20 kD的DC-SIGN胞外区蛋白,经Westernb lotting鉴定为正确。纯化后的蛋白免疫大耳白兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫原性和特异性。本研究得到了纯化的DC-SIGN胞外区蛋白,并制备了具有特异性和高效价的抗体,为研究DC-SIGN生物学功能提供试验基础。     

Expression level of c-FLIP versus Fas determines susceptibility to Fas ligand-induced cell death in murine thymoma EL-4 cells

The caspase-8 inhibitor c-FLIP blocks death receptor-mediated cell death and plays an essential role in the regulation of lymphocyte homeostasis and the immune escape of tumors. The murine thymoma cell line EL-4 was resistant to Fas ligand (FasL)-induced apoptosis by constitutive expression of FLIP (L). Cycloheximide downregulated the expression of FLIP (L) and markedly sensitized EL-4 cells to FasL-induced apoptosis. In contrast, DNA-damaging agents sensitized EL-4 cells to FasL-induced cell death via an increase of cell-surface Fas without any influence on FLIP (L) expression. Enforced expression of transfected Fas rendered EL-4 cells highly susceptible to FasL-induced cell death. These findings demonstrate that susceptibility to FasL-induced cell death mainly depends on the expression level of c-FLIP versus cell-surface Fas.     

一株针对人EGFR的单链抗体克隆与哺乳细胞表达

目的:制备特异性抗人表皮生长因子受体(EGFR)的单链抗体(sc Fv),鉴定其生物学活性,为进一步研究基于单链抗体的免疫治疗奠定基础。方法:从分泌抗人EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞系提取总RNA,利用5'RACE技术扩增轻链和重链可变区(VL、VH)基因,构建具有VL、VH基因的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到真核细胞表达载体pc DNA3.1中进行表达和鉴定。ELISA鉴定单链抗体对抗原的特异性;Fortebio检测抗原抗体间的亲和力,流式细胞术检测单链抗体结合肺癌细胞系天然EGFR的功能活性。结果:获得唯一的轻重链可变区序列VL、VH,成功构建EGFR-sc Fv,特异性与天然EGFR蛋白结合,亲和力达3.22×10-9mol/L。结论:成功构建了抗人EGFR单链抗体,为肺癌免疫导向治疗研究奠定了基础。     

宫颈癌SiHa细胞中丛生蛋白、存活素和Fas的表达的研究

目的:Clusterin、Survivin和Fas与肿瘤细胞凋亡密切相关.本研究拟通过检测宫颈癌SiHa细胞中上述这些蛋白的表达水平,以及羟基喜树碱对这些蛋白表达的影响.方法:SiHa细胞分别在普通培养基和舍有羟基喜树碱的培养基中培养,检测细胞死亡,annexin V和PI染色检测细胞凋亡,Western-blotting方法检测Cluste血、Survivin和Fas表迭水平.结果:我们的结果表明,在羟基喜树碱培养的细胞中,在浓度为0.5和3umol/L的培养基培养24小时后凋亡和死亡的肿瘤细胞数量增多,明显高于无化疗药的培养基中的细胞.Western结果显示经过羟基喜树碱处理的细胞Clusterin水平和fas蛋白水平明显高于未经过处理的细胞.在经过0.5和3umol/L的化疗药处理的SiHa细胞Survivin表达下降.结论:与survivin相比,clusterin在对化疗药物抵抗的过程中发挥的作用更大.     

小鼠着床丝氨酸蛋白酶2cDNA的克隆、表达及抗体制备

以孕 4 .5天小鼠子宫着床位点总cDNA为模板 ,用PCR方法扩增获得着床丝氨酸蛋白酶 2 (ISP2 )的cDNA。序列分析表明 ,该cDNA序列中的开放阅读框编码 2 79个氨基酸 ,并与文献报道完全相同 ,但在 3′非翻译区多 2 0 4bp ,已登录于GenBank(登录号 :AF4 4 2 819)。为了获得重组ISP2 (rISP2 ) ,构建了pGEX 4T 2 ISP2表达质粒 ,进而在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达融合蛋白质GST ISP2 ,经SDS PAGE回收的融合蛋白质用牛凝血酶酶切 ,再经SDS PAGE回收获得rISP2。用rISP2作为免疫原免疫家兔获得ISP2多克隆抗血清。用该抗血清进行免疫组化研究表明 ,ISP2在妊娠早期的小鼠子宫内膜腺上皮有特异性的高表达。     

Fas介导细胞凋亡及相关免疫调节作用

Fas/CD95作为肿瘤坏死因子(TNF)/神经生长因子(NGF)分子受体超家族成员,在细胞凋亡及体内免疫调节方面发挥重要的作用。细胞在接收到经Fas传递的凋亡信号后,主要经胞浆caspase和线粒体两种途径引发细胞程序性死亡。Fas介导T/B淋巴细胞的凋亡,在这些细胞的早期分化发育和维持机体免疫平衡中起主要作用。CTL和NK等杀伤细胞也通过Fas-FasL介导的细胞凋亡而发挥对靶细胞的杀伤效应。因此,Fas-FasL系统在肿瘤、自身免疫性疾病、艾滋病等疾病过程中发挥重要的作用。     

恒河猴Fas基因的克隆

目的研究猴艾滋病发病机制中细胞凋亡的作用,克隆凋亡相关基因Ｆａｓ的ｃＤＮＡ序列。方法从恒河猴腹股沟淋巴结中提取总ＲＮＡ,根据人的Ｆａｓ ｃＤＮＡ序列设计上、下游引物,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出目的ｃＤＮＡ片段,将这一片段克隆到ｐＧＦＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体中,筛选阳性克隆并进行序列测定。结果首次克隆了恒河猴Ｆａｓ基因,编码序列为１００５ ｂｐ,将其序列提交ＧｅｎＢａｎｋ,收录号为ＡＹ００７５７２。结论克隆的新序列与ＧｅｎＢａｎｋ已收录的人和食蟹猴的Ｆａｓ基因在编码序列的长度上稍有区别,人的编码序列为１００８ｂｐ,食蟹猴的为９９６ ｂｐ。     

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)cDNA的克隆、表达和活性测定

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (TRAIL)能选择性诱导肿瘤细胞凋亡 .为利用基因工程技术获得重组TRAIL蛋白可溶性片段 (sTRAIL) ,设计 1对引物 .利用PCR技术特异性扩增出sTRAIL的cDNA ,克隆于质粒pGEM 3Zf( )的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .经测序证明序列正确后克隆于表达质粒pBV2 2 0的EcoRⅠ和PstⅠ位点 ,转化大肠杆菌DH5α .转化菌株经温度诱导 ,SDS PAGE检测和Western印迹鉴定 ,获得重组sTRAIL的高水平非融合表达菌株 .表达量占菌体总蛋白的 2 0 % .对其表达产物进行了初步纯化 ,SDS PAGE结果显示纯度可达 90 %以上 .用L92 9细胞测定其生物学活性表明 ,重组蛋白在体外能明显诱导肿瘤细胞凋亡     

小鼠新基因Ayu17-449的克隆及表达分析

在利用PU8捕获载体从小鼠ES细胞中寻找有关对发育起重要作用基因时,一阳性ES克隆编号为Ayu17-449被捕获,经过Southern blotting法证实捕获载体单一整合在Ayu17-449号ES细胞的基因组中。通过用5＇RACE法得到所捕获基因的一小段cDNA,在EST数据库中比对,得到一5523bp cDNA序列,在Celera数据库中它包含于两个相邻基因,根据这两个基因的mRNA设立了一系列的引物进行RT-PCR和测序,用这两个基因的不同片段分别作探针进行Northern blotting分析,确定这是一个RNA约9kb并编码1920个氨基酸的新基因（定名为Ayu17-449基因,其cDNA序列和编码蛋白序列发表在NCBI数据库,编号为DQ079067）。Northern blotting揭示Ayu17-449基因高度表达在小鼠的脑、肾脏、心脏、肺、肌肉和胃等组织。PU8捕获载体具有X-gal报告基因,能从蛋白表达水平揭示它所捕获的基因的表达模式。X-gal染色结果显示,Ayu17-449蛋白高度表达在小鼠的脑、肾脏、心脏等组织,与Northern blotting法的结果高度一致。X-gal染色切片结果进一步证明Ayu17-449蛋白主要表达在脑的神经细胞和肾脏近曲小管细胞中。Ayu17-449基因的编码蛋白在数据库（Scansite,http：//scansite．mit．edu/）做功能基团分析后,揭示其编码蛋白的N末端含有Granin基团,大量文献证实Granin基团具有参与激素的分泌的功能,显示Ayu17-449基因可能与激素的分泌有关。     

抗肿瘤单抗3H11对应抗原cDNA片段的克隆

单克隆抗体３Ｈ１１能与多种肿瘤细胞特异结合,克隆其对应抗原无疑具重要意义．用胃癌细胞ＭＧＣ８０３构建ｃＤＮＡ表达文库,通过抗体３Ｈ１１对其进行原核表达筛选,获得一株能与３Ｈ１１特异反应的阳性克隆．其ｃＤＮＡ插入片段为５５４ｂｐ．ＧｅｎＢａｎｋ不含其同源序列．将此ｃＤＮＡ片段与谷胱甘肽转移酶表达质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ重组,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和竞争抑制实验表明,表达产物依然保持同３Ｈ１１反应的特异性．可见它是３Ｈ１１对应抗原的ｃＤＮＡ．