醇醛脱氢酶的分离纯化及其基因文库的构建和筛选

在维生素C的发酵生产过程中,普通生酮基古龙酸菌S2(Ketogulonigenium vulgare)能产生醇醛脱氢酶,将L-山梨糖转化为VC的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)。通过超声波破碎菌体、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,QSepharose High Performance柱层析等过程,从普通生酮基古龙酸菌S2发酵液中分离纯化了醇醛脱氢酶,并用该纯化酶免疫新西兰兔制备出了合格抗血清。同时,普通生酮基古龙酸菌S2基因组DNA经Sau3AⅠ部分酶切后,与黏粒载体pKC505连接,用包装蛋白进行包装,转染大肠杆菌DH5浕,构建了基因组文库。最后应用免疫酶斑点技术(Dot-ELISA)从12000个克隆子中筛选得到一个阳性克隆K719#。通过检测该基因工程菌的活性,表明K719#具有使L-山梨糖转化为2-KLG的功能,从而使醇醛脱氢酶在大肠杆菌中获得了高效表达,这为简化VC的生产工艺奠定了基础。     

酮古龙酸菌醇醛脱氢酶基因的克隆及表达

目的：从酮古龙酸菌SCB329株中分离山梨糖生物氧化相关酶的基因并进行表达验证。方法：根据酮古龙酸菌SCB329株基因组序列设计引物,通过PCR从SCB329株基因组中扩增醇醛脱氢酶基因aadh;构建载体pBMP3-aadh并在大肠杆菌中表达,经活性染色、体外转化反应等方法考察表达产物的活性。结果：目的产物能够催化山梨糖、葡萄糖、果糖、木糖等多种含羟基及羰基化合物脱氢,并能将L-山梨糖直接转化为2-酮基-L-古龙酸。结论：从酮古龙酸菌SCB329株中分离到一种醇醛脱氢酶基因,可为该菌株糖酸转化机制的研究提供帮助。     

2-酮-L-古龙酸还原酶分离纯化及其理化、酶学性质的研究

从发酵Ｌ山梨糖的Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ和Ｂａｃｉｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ２９８０混和菌株的无细胞抽提液中分离到了２酮Ｌ古龙酸还原酶（ＫＧＲ）,测得其分子量为９０ｋＤａ。动力学性质研究表明它为一个典型的ＭｉｃｈａｅｌｉｓＭｅｎｔｅｎ氏酶,对２-酮-Ｌ-古龙酸作用的Ｋ_ｍ值为３.４２×１０^－３ｍｏｌ,最适作用ｐＨ为６.５,最适作用温度为３０℃。２-酮-Ｌ-古龙酸还原酶的合成不受Ｌ-山梨糖和２-酮-Ｌ-古龙酸的诱导,故推测２-酮-Ｌ-古龙酸还原酶是Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ的一个组成酶。     

可产酸快生小菌的分离鉴定

目的：鉴定在实验过程中分离到的一株生长快速,并且可以将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸的菌株。方法：将快生小菌传代,并进行产酸、抗菌谱、山梨糖脱氢酶活性等分析,通过PCR方法扩增并分析16S rDNA。结果：在传代过程中还分离得到了不产酸菌株;从快生小菌中扩增得到了普通酮古龙酸菌16S rDNA;从产酸菌中能够扩增得到包含酮古龙酸菌和乙酸钙不动杆菌的16S rDNA序列;在不产酸菌中只检测到乙酸钙不动杆菌的16S rDNA序列。结论：产酸的快生小菌可能是普通酮古龙酸菌和乙酸钙不动杆菌形成的融合细胞,这种融合细胞基因组表现为很不稳定,普通酮古龙酸菌基因组容易丢失,且丢失后也失去了产酸能力。     

高渗条件下利用蔗糖提升2-酮基-L-古龙酸生产效率

旨在进一步提升维生素C前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的生产效率。在详细考察了2-KLG工业化生产过程中渗透压变化规律的基础上,研究了高渗对混合菌系细胞生长和2-KLG合成的影响,提出蔗糖促进伴生菌巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium生长,进而促进普通生酮古龙酸菌Ketogulonigenium vulgare生长和产酸的策略。结果表明,2-KLG的积累和碱性物质的流加使渗透压上升了832mOsmol/kg;高渗抑制了巨大芽胞杆菌的生长(15.4%),从而抑制普通生酮古龙酸菌(31.7%)的生长,导致2-KLG产量和生产强度分别下降67.5%和69.3%(以1250mOsmol/kg为例);蔗糖的添加则显著促进巨大芽胞杆菌的生长,使高渗条件下(摇瓶,1250 mOsmol/kg)2-KLG产量(40.6g/L)提高87%;在3L发酵罐中,补加10mmol/L蔗糖使2-KLG发酵周期缩短10.8%,2-KLG生产强度提高10.4%。研究成果为在环境胁迫下提高混菌生产目标代谢产物的产量提供了潜在的策略。     

酮古龙酸菌与呼吸链偶联的2-KGA代谢途径研究进展

酮古龙酸菌可将底物L-山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。该菌共存在5种反应参与2-KGA代谢,包括:1D-山梨醇氧化为L-山梨糖;2L-山梨糖氧化为L-山梨酮;3L-山梨酮(吡喃型)氧化为2-KGA;4L-山梨酮(呋喃型)氧化为维生素C。52-KGA还原为L-艾杜糖酸。其中L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶(SSDH)参与反应123,L-山梨糖脱氢酶(SDH)参与反应23,L-山梨酮脱氢酶(SNDH)参与反应34,醛脱氢酶(ALDH)参与反应3,2-KGA还原酶(2-KGR)参与反应5。SDH/SSDH/ALDH属于Ⅰ型醌酶,其辅酶为1分子PQQ;SNDH属Ⅱ型醌酶,与PQQ、heme C共同构成quinohemoproteins,2种醌酶均分布于周质空间中与呼吸链相偶联,意味着这种膜上直接氧化过程伴随ATP产生,使得菌体可以利用环境中的底物实现快速供能。     

基于组学技术的维生素C二步混菌发酵研究进展

二步发酵法是工业化生产维生素C (vitamin C, Vc)的主要方法,其中第二步由伴生菌与产酸菌(普通生酮基古龙酸菌)组合进行混菌发酵产生Vc前体2-酮基-l-古龙酸(2-keto-l-gluonic acid, 2-KLG)的机制,一直是科研人员研究的重要科学问题。通过高通量基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学等组学技术揭示生物系统中各个组分相互作用关系已经成为主要的研究手段。本文对近年来利用组学技术解析Vc混菌发酵中两菌互作关系、解除发酵系统的氧化胁迫、伴生活性物质、产酸菌群体感应、外源添加物、基因工程改造产酸菌促进产2-KLG等方面的研究进行综述,并为进一步的探索和深入研究提供思路。     

微生物混合培养从D山梨醇产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸

氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacteroxydans)SCB3 2 9以D 山梨醇为底物培养时可产生微量 2 酮基 L 古龙酸 ;而葡萄糖酸杆菌 (Gluconobactersp .)SCB1 1 0能将D 山梨醇以较高效率转化为L 山梨糖 ,但不产 2 酮基 L 古龙酸。将两种微生物在以山梨醇为底物的培养基中混合培养 ,其代谢产物经分离提纯后进行熔点测定、元素分析、红外吸收光谱测定等 ,确定其主要的代谢产物是 2 酮基 L 古龙酸。     

酮古龙酸菌WB0104中L-山梨糖脱氢酶的分离和性质研究

从两步法生产维生素C重要前体2-酮基-L-古龙酸(2-Keto-L-gulonic acid, 简称2-KLGA)的第二步转化菌酮古龙酸菌Ketogulonigenium sp.WB0104的细胞质中,经SP- Sepharose Fast Flow、DEAE-CL6B和凝胶过滤的方法,分离到了L-山梨糖脱氢酶(L-Sorbose Dehydrogenase , 简称SDH),质谱测定该酶分子量为60.499kd,而用凝胶过滤法测定其分子量为139.053±4.96kd,由此推测该酶为具有两个相同亚基的二聚体;辅基分析表明SDH含有辅基pyrroloquinoline quinone(PQQ).以L-山梨糖(L-Sorbose)为底物,2, 6-Dichlorophenolindophenol(DCIP)为电子受体,SDH具有明显的脱氢酶活性;以L-Sorbose为底物的Km值为23.94mmol/L.在无细胞体系中,在phenazine methosulfate (PMS)存在的情况下,SDH能将底物L-Sorbose直接转化为2-KLGA.     

L-山梨糖流加发酵高效生产2-酮基-L-古龙酸

实验充分利用混合菌系氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)混合发酵的优良特性,通过在发酵过程中间歇流加L-山梨糖的方法,实现了在自动控制温度、pH和溶氧的条件下,高效发酵L-山梨糖生成2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的目的。结果表明：当将L-山梨糖的终浓度调高到14％(w／v)时,2-KLG产量为130mg／mL左右,转化率达90％,发酵周期40—60h之间。结论：发酵过程中间歇流加L-山梨糖可以解除高浓度糖对产酸的抑制作用,提高了糖的转化率,但是发酵周期略有延长。     

scabrous Modifies Epithelial Cell Adhesion and Extends the Range of Lateral Signalling during Development of the Spaced Bristle Pattern in Drosophila

The role of scabrous (sca) in the evenly spaced bristle pattern of Drosophila is explored. Loss-of-function of sca results in development of an excess of bristles. Segregation of alternately spaced bristle precursors and epidermal cells from a group of equipotential cells relies on lateral inhibition mediated by Notch and Delta (Dl). In this process, presumptive bristle precursors inhibit the neural fate of neighbouring cells, causing them to adopt the epidermal fate. We show that Dl, a membrane-bound ligand for Notch, can inhibit adjacent cells, in direct contact with the precursor, in the absence of Sca. In contrast, inhibition of cells not adjacent to the precursor requires, in addition, Sca, a secreted molecule with a fibrinogen-related domain. Over-expression of Sca in a wild-type background, leads to increased spacing between bristles, suggesting that the range of signalling has been increased. scabrous acts nonautonomously, and we present evidence that, during bristle precursor segregation, Sca is required to maintain the normal adhesive properties of epithelial cells. The possible effects of such changes on the range of signalling are discussed. We also show that the sensory organ precursors extend numerous fine cytoplasmic extensions bearing Dl molecules, and speculate on a possible role for these structures during signalling.     

32种杜鹃花属植物在迁地保育条件下的自交研究

迁地保育条件下的杜鹃花属植物自交可育性一直缺乏系统的比较研究,该文对5亚属13亚组32种杜鹃花属植物的自交进行了数据采集与分析,初步揭示了迁地保育条件下杜鹃花属植物自交育性特征。结果表明:(1)自交可育与不育是杜鹃花属植物有性生殖中的两个并存现象,自交能育型种类或多于不育型。在受试的32种杜鹃花中,自交不育型10种、弱可育型5种、可育型7种、高可育型10种,其中27种的自交育性为首次报道,涵盖包括杜鹃亚属杜鹃组(sect.Rhododendron)和马银花亚属(subgen.Azaleastrum)及常绿杜鹃亚属(subgen.Hymenanthes)中银叶杜鹃亚组(subsect.Argyrophylla)等5个亚组在内的未被研究的类群。(2)通过与自然授粉有关育性指标的比较,发现不同种类的自交可育性指标有大幅度降低及增高这两类截然不同的现象,从而提出了自交可能是部分杜鹃花属植物的适应策略,或者对不利环境及其媒介条件的主动响应。(3)在云锦杜鹃亚组(subsect.Fortunea)这个被认为最原始的杜鹃花类群中,具备从自交不育到高可育的所有类型,并可能由此奠定整个杜鹃花属的遗传基础,而类群与种类分布的不同区域气候环境长期直接的或通过影响传粉媒介间接的作用,则可能是最终塑造该属植物自交育性多样化的外部动力。(4)该文还依据有关自交的研究结果,对杜鹃花属植物的迁地保育、育种、相关学科发展进行了讨论,并认为后合子期败育的理论不能完美地解释自交不能坐果的现象,而多倍体似不会导致自交不育。     

表皮葡萄球菌SarA对atlE、lipA和zinC基因表达调控的研究

表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermids) 是一种条件致病菌，SarA(Staphylococcal accessory regulator A)是该菌中一个全局性调控因子，它控制着细胞中许多与毒性相关的基因表达. 报道了SarA在转录水平直接调控atlE、lipA和zinC基因的表达. RT-PCR和lacZ报告基因的分析结果显示，在表皮葡萄球菌ATCC35984中，SarA对atlE (自溶酶基因) 表达起负调控作用，而对lipA (脂肪酶基因) 和zinC (膜相关锌金属蛋白酶基因) 的表达则有正调控作用. 生物信息学分析表明，SarA控制atlE，lipA和zinC 3种基因表达可能是通过与被调控基因上游的特定DNA序列的结合来实现的，该DNA结合区保守并富含AT碱基. 根据已报道的金黄色葡萄球菌中SarA的结合位点序列，利用Omiga软件分析并推测了SarA结合atlE，lipA和zinC的可能区域. 基于SarA是一种多功能的毒素相关调控因子，结果提示，SarA能调控众多因子，可以作为防治表皮葡萄球菌感染的一个药物筛选靶点.     

滇龙胆GrHDR基因的克隆与表达分析

龙胆苦苷(gentiopicroside)是中药龙胆中的主要药效成分,属于萜类化合物的衍生物。1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶[1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase,HDR]是萜类物质合成途径中的关键酶。为探讨不同光照条件下滇龙胆HDR(GrHDR)基因的表达与龙胆苦苷含量之间的关系,该文以滇龙胆叶片cDNA为模板,采用PCR和TA克隆技术获得GrHDR基因序列,对该序列进行生物信息学分析和表达分析,并采用高效液相色谱法测定龙胆苦苷含量,对该基因表达与龙胆苦苷含量进行比较。结果表明:(1)GrHDR基因(GenBank登录号: KJ917165.1)全长1 398 bp,编码465个氨基酸,推定GrHDR蛋白是亲水且稳定的,相对分子质量是52 281.25 Da,理论等电点是5.32;(2)该蛋白属于LYTB蛋白家族,可能定位于叶绿体上,无信号肽,二级结构主要由α-螺旋(45.16%)、β-转角(6.24%)、无规卷曲(33.98%)、延伸链(14.62%)构成;(3)GrHDR蛋白序列与同属植物秦艽的HDR蛋白相似性最高(95.71%);(4)实时荧光定量PCR结果显示GrHDR基因在滇龙胆中的表达量为根 > 叶 > 茎,而在10%、30%、100%全光光照条件下各组织的表达量有很大差异;(5)高效液相色谱法结果显示,不同光照条件下龙胆苦苷含量一致,均为根 > 叶 > 茎,其中100%全光光照下,药用部位根中龙胆苦苷含量达到7.141%,约是30%、10%全光光照条件的两倍,但该结果与同一光照条件下GrHDR基因表达规律不完全一致。该研究为阐述HDR基因功能及其与龙胆苦苷含量的关系提供参考。     

送春与多花兰种间杂交后代的ISSR分析

该文使用简单重复序列间( ISSR)分子标记,对送春与多花兰种间杂交后代进行了研究。结果表明：从80个ISSR引物中筛选出14个扩增效果稳定的ISSR引物,对两亲本和59个F1代个体进行了ISSR扩增,得到107个扩增位点,扩增的片段大小位于90~2100 bp之间,平均每个引物扩增7.64条条带,得到11种类型的带。 ISSR标记在送春×多花兰的F1代中表现出一定的多态性,分离频率为44.86％,分离位点有83.33％符合孟德尔1︰1或3︰1的分离规律,产生偏孟德尔分离的位点占12.50％,余下的4.17％属于特殊分离带型。可能导致后代变异的位点为偏孟德尔分离的6条带、缺失的8条带或新生成的2条带。聚类图中父本和母本与F1代个体间的遗传距离较远,59个杂交后代先聚集成一组,再同母本相聚为一组,最后才同父本聚在一起,59个杂种均偏母本型。送春与多花兰的杂交后代在植株形态、染色体、遗传物质方面都具备双亲特点,61个个体间的ISSR分子量标记结果和植株形态学特征都说明,59个F1代杂种包含送春和多花兰的遗传特性是真杂种;F1代杂种既有双亲的互补特征带,又有双亲的重组片断即产生新的特异带,这说明送春与多花兰的杂交后代具有遗传变异的特点。该研究结果可以有效地对杂交后代进行定向选择,为兰花的杂交育种提供了分子依据。     

地黄C3H基因的克隆及生物信息学分析

香豆酸-3-羟化酶属于植物中最大的蛋白酶细胞色素P450家族之一,在植物生命活动中发挥着重要作用。为了解地黄香豆酸-3-羟化酶基因RgC3H合成毛蕊花糖苷的功能,该研究基于地黄代谢组学分析获得KEGG途径中的C3H,采用多重比对在NCBI中获得同源基因的一个保守序列,并基于该保守序列和地黄SRA数据库,采用电子克隆和RT-PCR克隆技术获得地黄C3H基因全长CDS(RgC3H),对其进行生物信息学分析。结果表明:RgC3H基因全长为1 530 bp,且编码一个含509个氨基酸、分子量为57.91 kD、无信号肽的蛋白质; 基于氨基酸序列的结构分析显示,RgC3H有一个保守区域-P450结构域; 系统进化分析结果显示,RgC3H与芝麻和猴面花的C3H基因具有很高的同源性。上述结果为进一步研究RgC3H基因在地黄毛蕊花糖苷生物合成途径中的作用奠定了基础。     

水稻OsMBF1c基因的克隆及表达分析

多蛋白桥联因子1(multi protein bridging factor 1, MBF1)在植物应对逆境胁迫中起着重要的作用,而对于水稻中MBF1是否参与重金属胁迫响应机制目前尚未见相关报道。为了揭示水稻MBF1家族与重金属胁迫的相关性及其潜在作用机制,该研究利用PCR技术克隆水稻OsMBF1c基因的全长编码序列,通过生物信息学对基因功能进行分析和预测,并通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析其在镉(Cd)胁迫下的表达特征。结果表明:(1)OsMBF1c的全长编码序列为468 bp,共编码155个氨基酸,相对分子量为16.154 kDa。(2)OsMBF1c与大麦TdMBF1a.1亲缘关系最近,具有光、厌氧等环境因子诱导相关的顺式调节元件。(3)重金属Cd可诱导OsMBF1c表达且在时间上和组织中的表达水平具有特异性,100 μmol·L^-1 Cd 处理1 h 后,地上部分OsMBF1c表达量明显上调,为对照组的7倍; 100 μmol·L^-1 Cd 胁迫处理6 h后,根部OsMBF1c表达量上调为对照组的3倍。该研究结果进一步完善了非生物胁迫下MBF1家族的生物学功能研究。     

龙眼DlPSY基因在根和叶中的表达及其生物信息学分析

为研究八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase)基因在龙眼类胡萝卜素合成途径中的作用机制,该文从龙眼转录组数据中筛选获得一个PSY基因,命名为DlPSY,采用生物信息学方法对龙眼PSY蛋白的一级结构、理化性质、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、亲疏水性、蛋白质二级结构、蛋白质三级结构、卷曲螺旋、蛋白质结合位点、系统进化树、蛋白质互作等进行分析和预测,并同时运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对DlPSY基因在龙眼根和叶中的差异表达进行分析。结果表明:龙眼DlPSY基因长度为1 260 bp,编码420个氨基酸;生物信息学预测DlPSY蛋白具有Isoprenoid Biosyn C1超家族结构,含有信号肽,为分泌性蛋白,无跨膜结构,是一种可溶性亲水蛋白,定位于膜外; DlPSY蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,具有卷曲螺旋。Ramachandran评估结果表明应用SWISS-MODEL构建的蛋白质三级结构模型可靠,其配体结合位点为344Phe和347Lys。RT-qPCR分析结果表明DlPSY基因在龙眼根和叶中均有表达,叶中表达量高于其在根中的表达量。该研究结果为下一步采用遗传学方法提高龙眼中类胡萝卜素的含量奠定理论基础。     

瑞香属和荛花属的数量分类研究

瑞香属和荛花属为瑞香科瑞香亚科的落叶或常绿灌木,中国西南部是瑞香属和荛花属的重要分化中心。全世界共有瑞香属95种、荛花属70种,中国分布有瑞香属52种、荛花属49种。瑞香属和荛花属的分类学研究一直存在不同程度的分歧。花盘形状和果实类型在传统分类中一直是区分瑞香属和荛花属的典型特征,而花盘形态和果实类型在2个属中存在交叉和过渡,部分植物分类学家根据这些特征将两个属进行过不同程度的归并。该研究采用数量分类法对瑞香属77种(变种)和荛花属62种(变种)植物,选取32个形态学性状进行聚类分析和主成分分析。结果表明:聚类分析和主成分分析均显示两属均未形成单系类群。在主成分分析中,前3个主成分分析的贡献值为35.56%,传统分类中用来区分两属的花盘形状、叶序及果实类型等特征对前3个主成分贡献相对较小,因此,传统分类学中对这两个属进行区分的性状并没有典型的分类学意义。同时,聚类图和主成分分析得到的散点图均不能将这两个属区分开来。数量分类研究结果显示两属植物存在明显的交叉,支持瑞香属和荛花属不是两个独立自然类群的观点。