CCR5及其拮抗剂的研究进展

趋化因子CCR5,作为G蛋白偶联因子超家族(GPCR)成员的细胞膜蛋白,是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一。以CCR5为靶点的HIV-1受体拮抗剂越来越受关注,主要有趋化因子衍生物、非肽类小分子化合物、单克隆抗体、肽类化合物等四类。这些抗病毒活性强、高亲和力的CCR5拮抗剂,已有一部分进入了临床试验阶段。本文对近年来CCR5拮抗剂的相关研究进展进行综述。     

Nurr-1基因转染促进脂肪干细胞的神经分化

目的:研究孤儿核受体相关基因1(Nurr-1)对脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cells,ADSC)向神经元方向分化的潜在作用。方法:流式细胞术与成骨、成脂诱导技术鉴定脂肪干细胞;Nurrr-1基因转染脂肪干细胞后,应用神经特异性标志物MAP-2,β-tubulin的免疫荧光染色评估其向神经方向分化的能力。结果:流式细胞术结果表明培养的细胞CD29,CD44表达90%以上,CD45,CD90表达均低于1.5%,经过诱导后,油红O、茜素红S染色均呈阳性,表明所培养的细胞为脂肪干细胞;慢病毒转染Nurr-1基因后,免疫荧光染色检测MAP-2,β-tubulin的免疫荧光强度显著增加;RT-PCR结果显示Nurr-1转染的脂肪干细胞的MAP-2、β-tubulin、NF200的表达量显著提高。结论:Nurr-1基因转染能促进脂肪干细胞向神经方向分化,为神经损伤和神经退行性病变的治疗提供了新途径。     

Notch信号转导通路对神经干细胞的调控

神经干细胞增殖、分化机制研究为神经系统疾病治疗提供了新的途径,具有巨大的潜在应用价值和理论研究意义。已发现Notch信号对神经干细胞的维持和抑制分化发挥着决定性作用,Notch信号由Notch受体、DSL(Delta／Serrate／LAG-2)配体,CSL(CBFl／Suppressor of Haidess(Su(H))／LAG-1)DNA结合蛋白和一些蛋白水解酶组成。本文主要综述了Notch信号通路及其在调控神经干细胞的增殖、分化中的作用。     

人尿源性干细胞及人脐带间充质干细胞的生物学性状比较

该研究探讨人尿源性干细胞(human urine-derived stem cells,hUSCs)及人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的生物学性状差异。分离培养hUSCs及hUC-MSCs,显微镜下观察细胞形态,流式细胞术检测干细胞表面标记物,锥虫蓝拒染实验及克隆形成实验检测细胞增殖能力,划痕实验及Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、茜素红染色、油红O染色及阿利新蓝染色评估多向分化潜能。hUSCs为米粒状贴壁生长细胞,hUC-MSCs为长梭形贴壁细胞,呈旋涡状排列生长,两种细胞表型分析相似,均表达多种间充质干细胞标志物,但CD24在hUC-MSCs表达阳性,而CD105在hUSCs表达阳性。hUC-MSCs的增殖及迁移能力优于hUSCs,但后者的克隆形成能力更强。hUSCs及hUCMSCs都具有成骨、成脂、成软骨分化能力,hUC-MSCs的成骨能力强而hUSCs的成脂能力强。该研究成功分离培养出增殖能力强并具有多向分化潜能的hUSCs,该细胞与hUC-MSCs相比具有相似的生物学性状,可作为再生医学自体移植的理想种子细胞来源。     

DDR2基因缺失对小鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的:骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是骨再生工程中重要的种子细胞,它对骨组织缺损的修复有着良好的效果。但是BMSCs向成骨细胞分化并修复骨组织缺损是是由细胞外因子共同作用产生的结果。DDR2(Discoidin Domain Receptor 2)作为I型胶原的特异性受体在成骨细胞的分化中发挥重要的调节作用。而对于其在BMSCs向成骨细胞的分化过程中的所起到的作用还鲜有研究,对其作用机理尚不明确。因此我们希望通过分离、培养并鉴定比较DDR2基因缺失小鼠与野生型小鼠来源的骨髓间充质干细胞了解其生物学特性,为后续的实验奠定理论基础。方法:采用改良型的全骨髓贴壁细胞分离方法分离培养两种小鼠来源的骨髓间充质干细胞,采用流式细胞技术鉴定其表面标记物的表达,并利用诱导培养液诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成脂肪细胞分化。结果:分离培养的两种骨髓间充质干细胞形态一致,增殖能力和自我更新能力强,流式细胞术检测其表面标记物CD29,Sca-1均表达阳性,CD105,CD45表达为阴性,分离得到的两种细胞均有向成骨细胞和成脂肪细胞分化的能力,但可以明显观察到DDR2基因缺失小鼠的骨髓间充质干细胞的成骨分化能力减弱。结论:本实验通过对于DDR2基因缺失小鼠BMSCs分离、培养和鉴定,初步探索DDR2基因缺失在在成骨过程中的作用结果,为进一步研究提高BMSCs的成骨分化能力奠定理论基础。经实验证明,DDR2基因缺失小鼠来源的骨髓间充质干细胞虽然仍具备干细胞的生物学特性,但其向成骨细胞的分化能力明显减弱,说明DDR2基因缺失对其骨髓间充质干细胞的成骨分化等有着重要的影响。     

GDNF对神经干细胞增殖、分化的影响

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)具有如下特点:(1)可以向神经组织分化或源自神经系统的一部分。(2)具备维持和更新的自主能力。(3)可通过细胞分裂增殖。以上特点决定了它的应用价值,被公认为治疗阿尔茨海默氏病,帕金森氏症,脊髓损伤,中风等神经退行性疾病的最佳方案。用干细胞治疗癌症,免疫相关性疾病,和其他疾病被认为是很有创新的新疗法,可能有一天会扩展到修复和补充大脑损伤。胶质细胞源性神经营养因子(glial Cell line一derived neurotrophic factor,GDNF)为TGF一β超家族的一员,具有很强神经保护作用,大量实验研究证实GDNF可促进帕金森病大鼠模型的中脑神经干细胞定向分化为多巴胺能神经元,同时大量实验发现其可促进神经干细胞增殖及分化,为神经干细胞的应用奠定了基础。     

生长因子对骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stemcell,BMSC)是骨髓基质细胞的重要组成部分,由于其不但能与其他细胞一起支持造血干细胞造血,而且还具有较强的增殖功能及多向分化潜能,在一定诱导因素下可定向分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等,近年来已成为生物学和医学的研究热点。本文简要介绍了不同生长因子如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β等对BMSC增殖、分化的影响。     

骨髓源性肝干细胞的研究

近年来全球掀起了有关干细胞的研究热潮 ,除血液干细胞、胚胎干细胞和神经干细胞外 ,肝干细胞也是引人注目的内容之一。肝干细胞的存在与否曾是一个争议性问题 ,目前已趋于肯定。自从Ｐｅ ｔｅｒｓｅｎｅｔａｌ[1] 有关骨髓细胞能分化为肝上皮细胞系的论文发表后 ,关于血源性干细胞能转化为肝实质细胞的事实引起了广泛的关注[2～ 4 ] ,本文就有关研究进展综述如下。1.肝内干细胞成体动物肝脏内有干细胞吗 ?这个问题已经争论了半个多世纪 ,目前通过体内、外实验证实了肝干细胞的存在 ,肝的卵圆细胞和小肝细胞作为肝干细胞或肝前体细胞的观点…     

成体骨髓源多能间充质干细胞体内分化皮肤干细胞和皮肤组织

近年来,因在退行性或遗传性等疾病中潜在的治疗前景,成体干细胞可塑性引起众多学者的广泛兴趣。有许多报道显示骨髓源干细胞植入体内可生成多种组织细胞,但到目前为止,成体干细胞可塑性尚存争议,尤其是关于成体干细胞体内分化成皮肤组织的报道较少且意见不一。本工作,自成年BALB／C小鼠的骨髓中分离获得并体外培养扩增多能间充质干细胞,将适量的供体BALB／C小鼠骨髓源多能间充质干细胞和一定量的C57BL／6小鼠骨髓细胞经尾静脉共同植入经致死量照射的成年C57BL／6小鼠。40天后,观察到受体C57BL／6小鼠背部出现白色毛发,逐渐扩展至3—4cm^2,同时还出现在颈部和腹部,取该部位的皮肤组织进行免疫组化检测及RT—PC汉检测。蛋白水平和基因水平的结果均显示受体C57BL／6小鼠出现白色毛发处的皮肤组织为BALB/C来源。首次直接证明了成体骨能源多能间充质干细胞体内在一定条件下可以分化成皮肤干细胞及皮肤组织。不仅为研究体内诱导皮肤分化的机制也为鉴定成体多能干细胞提供了一个模型,也为成体干细胞可塑性理论提供了新的依据。     

趋化因子受体 CCR5 亲合短肽的筛选

趋化因子受体 5 (CCR5) 是 HIV-1 与宿主细胞结合的辅助因子之一,其功能缺失或被 CCR5 拮抗剂封闭则会阻止 HIV-1 感染细胞 . 为得到与 CCR5 特异结合的肽类拮抗剂,采用噬菌体展示技术,以稳定表达 CCR5 的 CHO 细胞 (CHO/CCR5) 作为靶标,通过噬菌体随机 12 肽库筛选与 CCR5 特异结合的多肽;经过四轮筛选后,挑选 20 个阳性噬菌体克隆进行测序,从中得到 11 个含有 AFDWTFVPSLIL 序列的小分子肽 . 含该序列的噬菌体能与抗人 CCR5 单抗 (2D7) 竞争性结合 CCR5 ,且合成肽 AFDWTFVPSLIL 对趋化因子 RANTES 与 CHO/CCR5 的结合具有明显的抑制作用,初步证明该小肽与 CCR5 具有特异性结合作用 .     

香菇多糖对小鼠骨髓树突状细胞表型和功能的影响

通过研究香菇多糖(Lentinan,LNT)对小鼠骨髓源树突状细胞(bone marrow dendritic cells,BMDCs)功能调节的机制,进一步阐明香菇多糖的免疫活性。本实验将BMDCs分成脂多糖(LPS)阳性对照组、LNT处理组和RPMI1640空白对照组,应用酸性磷酸酶活性检测、流式细胞仪检测技术、吞噬实验、酶联免疫吸附试验检测各组BMDCs表型和功能的各种指标。结果显示,LNT(50μg/mL)处理组BMDCs酸性磷酸酶活性降低;BMDCs吞噬能力比RPMI1640空白对照组明显下降;BMDCs表面MHCⅡ、CD40、CD83、CD80、CD86和DEC205的表达增加;BMDCs白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达增加。证明了适宜浓度的LNT可以促进BMDCs表型及功能的成熟。     

GDF5基因真核表达载体的构建及其在恒河猴骨髓间充质干细胞中的表达

目的克隆人软骨组织生长分化因子5（GDF5）基因及构建GDF5基因真核表达载体,观察其在恒河猴骨髓间充质干细胞（MSCs）中的表达情况。方法采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人胎儿软骨组织克隆hGDF5基因全长cDNA,插入pEGFP-C2载体,构建重组真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5。重组质粒脂质体介导法转染MSCs细胞,荧光显微镜观察报告基因的表达,RT-PCR法检测目的基因表达。结果成功克隆人软骨组织GDF5基因和构建GDF5真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5,克隆在载体上的基因长度为1505bp,包含全部cDNA编码序列1505bp,测序显示与Genbank上的序列一致。重组质粒转染恒河猴MSCs细胞得到表达,绿色荧光蛋白在转染24h后开始表达,72h达高峰,然后表达逐渐减弱。转染后72h可检测到GDF5mRNA表达。结论人GDF5基因在恒河猴MSCs细胞的成功表达为应用恒河猴模型开展基于细胞的基因疗法修复骨和软骨损伤研究奠定了必要基础。     

人骨髓间充质干细胞培养方法

骨髓间充质干细胞(BMMSCs)是一种多潜能的成体干细胞,在细胞治疗和组织工程上具有广阔的应用前景。对供体年龄、分离方法、培养密度、培养基和培养基质表面性质对细胞增殖的影响进行了比较,重点阐述了用人自体血清结合多种细胞因子,替代胎牛血清培养BMMSCs的效果,转染端粒酶基因的BMMSCs的增殖能力和分化潜能,以及灌注培养反应器用于大规模培养的技术进展。     

骨髓来源的间充质干细胞分化能力的鉴定

本文研究了人骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)的成骨及成脂分化的潜能.通过加入诱导成骨的诱导剂,人的MSCs出现成骨分化的机箱,通过碱性磷酸酶活性测定,茜素红染色及主要调控基因BMP2和Runx2的表达,确定了MSCs具有成骨分化的潜能.对于成脂分化,通过油红O染色,及主要标志基因PPARγ的表达确定其具有成脂分化的潜能.所以,从骨髓分离的到的MSCs纯度达到标准,并且具有成骨成脂分化的多向潜能,是一种理想的实验模型细胞.     

成纤维生长因子-2与肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的作用比较

比较成纤维生长因子-2(FGF-2)与肝细胞生长因子(HGF)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)向肝细胞分化的能力,并进一步的研究BM-MSCs诱导成肝细胞所需的最佳诱导因子以及其用量。体外获取、培养大鼠BM-MSCs,将第3代BM-MSCs采用不同剂量的FGF-2和HGF诱导。诱导后,在显微镜下观察细胞形态学的改变;Shiff染色法检测糖原的分泌;ELISA法检测AFP的分泌;免疫细胞化学法检测白蛋白和CK19的分泌。诱导后BM-MSCs由梭形向多角形、卵圆形方向变化,AFP第3天就有分泌,第12天达到高峰,以后逐渐减少;白蛋白、CK19和糖原第12天即有阳性表达,以后随着诱导时间的延长阳性率逐渐升高。第2组和第4组比其他组分泌的白蛋白、CK19和糖原均多。FGF-2比HGF具有更强的诱导BM-MSCs向肝细胞分化的能力。     

Interactions of Opioid and Chemokine Receptors: Oligomerization of mu, kappa, and delta with CCR5 on Immune Cells

Activation of opioid receptors by morphine was previously shown to specifically induce the expression of chemokine receptor CCR5, promoting simian AIDS virus entry and replication in immune cells. The present study was undertaken to determine whether these two structurally and functionally distinct G-protein-coupled receptors are in close proximity and form an oligomeric complex in the cell membrane so that the activation of one triggers the activity of the other. Both human CEM ×174 and monkey lymphocytes were used in this study and gave similar results. Immunoprecipitation experiments showed that CCR5, but not CD4 nor Na⁺/H⁺ exchanger, coprecipitates with all three subtypes (mu, delta, and kappa) of opioid receptors. A single protein band immunoreactive with antibodies against both the CCR5 and the opioid receptors was identified after electrophoresis on nondenaturing polyacrylamide gels. Chemical crosslinking experiments using glutaraldehyde or BS³ indicate that these receptors are closely situated on the cell membrane with an intermolecular distance less than 11.4Å. Functional studies revealed that a combination treatment of cells with morphine, an agonist for mu, and MIP-1β, a ligand for CCR5, suppresses the inhibitory effect of MIP-1β and increases the stimulatory effect of morphine on CCR5 expression. These results suggest that oligomerization of chemokine receptor CCR5 and opioid receptors on the cell membrane of human or monkey lymphocytes may modulate receptor functions.     

Notch信号通路对神经干细胞增殖分化的作用

神经干细胞作为一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,它的增殖和分化受到多种源于自身或外在、邻近或远程细胞信号通路的调控,各种细胞因子及胞间通讯在神经干细胞的增殖和分化中发挥着重要的作用。近年来的多种研究表明,Notch信号通路正是这样一种可以通过相邻细胞的配体与受体相互作用,从而传递信号,进一步发挥其生物学功能的重要信号通路。该通路参与了神经干细胞维持自我形态及向多种具有不同功能的神经细胞分化的过程．对于研究神经干细胞的增殖和分化具有巨大的意义。该文将就当前Notch信号通路对神经干细胞增殖分化影响的相关研究进行简要综述。     

去甲肾上腺素对骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:观察去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖的影响及其作用途径.方法:分离培养正常大鼠BMSCs,采用3H-TdR掺入实验检测不同浓度的NE(10-7-10-4 M)作用8h及10-5M的NE作用不同时间(0-24h)BMSCs细胞增殖情况,real time RT-PCR检测肾上腺素能受体α1A-AR,α1B-AR和α1D-AR mRNA表达变化情况.结果:10-7-10-4M的NE作用8h后均促进了BMSCs细胞的增殖.并且在10-5M时NE对BMSCs的促增殖效应最为显著;正常组BMSCs细胞的α1A-AR,α1B-AR,α1D-AR mRNA表达维持在较低水平,加入10-5M的NE作用后α1-AR三个亚型mRNA表达水平均有不同程度的升高(P<0.05).结论:NE能够促进BMSCs的增殖,并且这种促增殖作用是通过AR依赖的信号通路来调节的.     

模拟微重力对骨髓间充质干细胞增殖及其向脂肪方向分化能力的影响

目的：探讨模拟微重力（SMG）对骨髓间充质干细胞（MSCs）的增殖及向脂肪方向分化能力的影响。方法：第一部分将第三代的MSCs分为两组,分别在正常重力下（NG组）及微重力下（SMG组,采用回转模拟装置以30r/min回转模拟微重力）,培养72h后,采用BrdU标记法检测两组细胞的增殖情况,细胞计数法绘制细胞生长曲线。Western Blot检测干细胞标志物Oct4、SSEA4的表达情况,第二部分将第三代MSCs分为三组：第一组在NG条件下培养后,加入脂肪方向诱导剂在NG条件下诱导、第二组在SMG条件下培养,在NG条件下诱导,第三组在SMG条件下培养,在SMG条件下诱导。7天后,油红O染色观察脂肪方向的诱导率,Western Blot检测过氧化物酶增殖物激活受体γ2（PPARγ2）以及Oct4的表达。结果：第一部分：流式细胞仪检测SMG组BrdU标记阳性率明显高于NG组,表明细胞增殖较快,Western Blot结果显示SMG组细胞中Oct4、SSEA4的表达量明显高于NG组,有统计学意义。第二部分：脂肪方向诱导后第一组细胞油红O染色阳性,Western Blot显示PPARγ2呈阳性表达,Oct4仅有微量表达,第二组油红O染色阳性表达率明显高于第一组,且PPARγ2表达较第一组增多,几乎未见Oct4的表达,第三组细胞油红O染色阴性,且几乎不表达PPARγ2,而Oct4表达较前两组升高。结论：模拟微重力可促进骨髓间充质干细胞增殖,提高其向脂肪方向分化的能力可能与微重力保持其未分化状态相关。     

The Effects of Co-Culture of Embryonic Stem Cells with Neural Stem Cells on Differentiation

Researching the technology for in vitro differentiation of embryonic stem cells (ESCs) into neural lineages is very important in developmental biology, regenerative medicine, and cell therapy. Thus, studies on in vitro differentiation of ESCs into neural lineages by co-culture are expected to improve our understanding of this process. A co-culture system has long been used to study interactions between cell populations, improve culture efficiency, and establish synthetic interactions between populations. In this study, we investigated the effect of a co-culture of ESCs with neural stem cells (NSCs) in two-dimensional (2D) or three-dimensional (3D) culture conditions. Furthermore, we examined the effect of an NSC-derived conditioned medium (CM) on ESC differentiation. OG2-ESCs lost the specific morphology of colonies and Oct4-GFP when co-cultured with NSC. Additionally, real-time PCR analysis showed that ESCs co-cultured with NSCs expressed higher levels of ectoderm markers Pax6 and Sox1 under both co-culture conditions. However, the differentiation efficiency of CM was lower than that of the non-conditioned medium. Collectively, our results show that co-culture with NSCs promotes the differentiation of ESCs into the ectoderm.