人抗药基因在小鼠ES细胞中的表达及嵌合体小鼠的研究

本文用磷酸钙沉淀法将含人ｍｄｒ１基因表达质粒转染到小鼠胚胎干细胞,得到了四个能稳定地在含有２００ｎｇ／ｍｌ秋水仙素培液中生长传代的细胞克隆。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交及ＲＮＡ印迹杂交证明人ｍｏｄｒ１基因已整合到ＥＳ细胞基因组,并有表达。其中两个克隆杂交信号较强,抗药基因可随秋水仙素深度提高而扩增,表达量也随之增加。用抗该基因编码的ｐ１７０糖蛋白抗体对ＥＳ－ｍｄｒ １细胞作免疫荧光染色,证实ｐ１７０     

人抗药基因在小鼠ES细胞中的表达及嵌合体小鼠的研究

本文用磷酸钙沉淀法将含人mdrl 基因表达质粒(pHaMDR 1/A)转染到小鼠胚胎干细胞(ES-5),得到了四个能稳定地在含有200 ng/ml 秋水仙素培液中生长传代的细胞克隆。经Southern 印迹杂交及RNA 印迹杂交证明人mdrl 基因已整合到ES 细胞基因组,并有表达。其中两个克隆杂交信号较强,抗药基因可随秋水仙素浓度提高而扩增,表达量也随之增加。用抗该基因编码的p170糖蛋白抗体对ES-mdr 1细胞作免疫荧光染色,证实p170蛋白分布于细胞表面。未发现ES-mdr 1细胞的体内、外发育潜能与亲代细胞的有何差异。但是mdr1细胞不能被RA 和HMBA 化学药物诱导分化,表明这些细胞已与亲代ES-5细胞不同,具有拮抗化学药物诱导分化的作用,其机理尚待研究。因此,ES-mdr1细胞可作为在细胞水平研究p170糖蛋白作用机理的体系,也可用以建立体外筛选拮抗抗约基因作用新手段的模型。我们也得到了含人mdr1基因的嵌合小鼠,并对它们的嵌合情况作了分析。     

定向诱导小鼠ES细胞向心肌细胞的分化

为了提高体外诱导ES细胞向心肌细胞分化的效率 ,对以往的诱导方法加以改进 ,采用直接悬浮培养和 0 8%DMSO诱导 ,建立了简便、高效的定向诱导ES细胞向心肌细胞分化的体系 .诱导第 9d起可见自发性、有节律跳动的类胚体出现 ,第 14d达到高峰 ,约有 70 %的拟胚体产生跳动 .用RT PCR的方法在跳动的拟胚体中检测到心肌细胞特异性标志物的表达 ,采用免疫荧光染色的方法在蛋白水平检测到心肌特异的α辅肌动蛋白 (α actinin)的表达 ,并可见清晰肌小节 ,表明在改进的体外诱导条件下ES细胞可分化为成熟的心肌细胞 .     

小鼠锌指蛋白基因ZF-12基因剔除的ES细胞系的建立

利用小鼠锌指蛋白ZF－12基因组DNA片段,构建了针对小鼠ZF－12基因座的替换型打靶载体pSSC-TV-10.5。经限制性核酸内切酶酶切及部分测序鉴定其结构正确后,通过电穿孔将线性化打靶载体导入ES人,经G418／GANC双药筛选和分子鉴定,获得4个ZF－12^ /-基因的ES细胞杂合子克隆,其生长状态良好,为进一步建立ZF－12基因剔除的小鼠动物模型创造了条件。     

胚胎干细胞的体外诱导分化模型

胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体 ,它能通过祖细胞为中介 ,分化为各种类型的体细胞 ,可重演体内干细胞的分化过程。自 80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型 ,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演 ,再加上胚胎干细胞系具有体系简单 ,影响因子少 ,可控制 ,便于研究等特点 ,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控 ;可成为器官移植和修复…     

定向诱导小鼠ES细胞为肝脏细胞及其凝血因子Ⅷ, Ⅸ的表达

凝血因子Ⅷ, Ⅸ缺陷导致血友病A和B的发生, 肝细胞是产生凝血因子的器官, 利用肝细胞进行替代治疗是纠正凝血因子缺陷的根本办法, 但是其来源及利用存在难以克服的问题. ES细胞具有体外培养时保持未分化状态和无限的增殖能力, 具有在一定条件下可以分化发育成各个胚层细胞的潜能, 利用ES细胞源性肝细胞作为供体细胞, 解决了肝细胞来源困难、增殖能力差的难题. 体外分阶段定向诱导E14小鼠ES细胞分化为肝细胞, ICG摄取及PAS反应结果证实ES源性细胞具备肝细胞功能, 在此基础上, 利用RT-PCR法对诱导细胞初步进行了凝血因子Ⅷ, Ⅸ表达分析, 为进一步开展利用ES细胞纠正凝血因子缺乏奠定了研究基础.     

外源TGF-β1基因在小鼠ES细胞中的表达及其对细胞分化的影响

本文利用逆转录病毒载体Dol,在其BamHⅠ酶切位点插入猪TGF-β1的1.7kbcDNA,构建成表达质粒,并用磷酸钙沉淀法将该质粒DNA转染到小鼠ES-5细胞,经G_(418)筛选获得抗G_(418)的ES-5细胞克隆(ES-T),经RNA点杂交,Northern印迹杂交证明有6个细胞克隆能表达外源猪TGF-β1的mRNA,其中两个杂交信号较强的克隆进一步用Southern印迹杂交,也证明猪TGF-β1基因已整合到ES-5细胞基因组。经SELISA和生物活性测定,证明ES-T细胞存在着过度表达的TGF-β1基因产物。ES-T细胞生长特性与其亲代ES-5细胞相比,未发现明显差异。经低浓度RA处理悬滴培养的ES-T6细胞,将形成的拟胚体移至用白明胶铺底的培养板中,则最终有95%左右的拟胚体分化出血管样结构,而ES-5细胞在相同培养和处理条件下,只有17.8%形成无规则的管状结构,这结果提示ES-T6细胞基因组中外源TGF-β_1的额外表达,在调节该细胞株分化形成血管样结构中起着重要作用。同时,我们的实验体系也提供了一个适合于研究内皮细胞发生和血管形成的模型。     

可诱导表达Mesp1的慢病毒载体构建及P19细胞稳定表达系的建立

Mesp1属于b HLH转录因子家族,对早期心脏中胚层的形成十分重要。为研究Mesp1在心脏发育过程中的功能,本文构建了可诱导表达Mesp1的慢病毒载体,转染进P19细胞,经嘌呤霉素筛选并扩大培养后,成功建立起经强力霉素诱导后可稳定过表达Mesp1基因的细胞系P19-Mesp1,为研究Mesp1心脏发育相关功能提供有用的细胞研究模型。     

LIF基因转染的ES细胞生长与分化特性的研究

我们将人Ｄ型ＬＩＦｃＤＮＡ以正反两种方向分别克隆到载体ＰＫＣＲ３,并引入ｎｅｏ基因,构建成ｐＳＶＬＤ和ＰＳＶＬＤ质粒,按磷酸钙沉淀法分别转染ＥＳ－５胚胎干细胞,,经Ｇ４１８和没浓度ＬＩＥ条件培液共同筛选,,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析以及ＥＳ－５细胞集落分化抑制能力测定,建立了过度表达分泌ＬＩＦ的ＥＳＬ（＋）细胞株和表达外源反义ＬＩＦＲＮＡ的ＥＳＬ（－）细胞株。我们发现,我们发现,ＥＳＬ     

通过胚胎干细胞途径获得的嵌合体小鼠中neo基因在各组织中的分布

为探讨小鼠胚胎干细胞参与早期胚胎发育的潜能,以neo基因作为目的基因进行了胚胎干细胞的转染,经G418的筛选,获得表达neo基因的单克隆细胞,挑取部分克隆扩大,进行小鼠囊胚腔注射,再重新植入小鼠子宫,共注射了60个囊胚,分别回输到5只假孕小鼠,在子代中得到了携带有neo基因的嵌合体小鼠。通过对嵌合体小鼠各组织PCR分析发现,neo基因可以在皮肤、肝脏、血液等多种组织中存在。     

Pluripotential rabbit embryonic stem (ES) cells are capable of forming overt coat color chimeras following injection into blastocysts

The isolation of pluripotent embryonic stem (ES) cell lines from preimplantation rabbit embryos and their in vitro properties have been previously described. In the present investigation, these ES cell lines were further characterized and their capacity to contribute to formation of adult, fertile animals upon injection into recipient New Zealand White blastocysts demonstrated. The efficiency of chimera formation was low (5% of live born), but the degree of chimerism, as assessed by coat color contribution from the Dutch belted strain, was high (10–50%). Thus a significant step is taken toward the development of gene-targeting technology in the rabbit, an animal whose physiology and size lend itself to unique applications in biomedical research. © 1996 Wiley-Liss, Inc.     

Homologous Recombination in Zebrafish ES Cells

Targeted insertion of a plasmid by homologous recombination was demonstrated in zebrafish ES cell cultures. Two selection strategies were used to isolate ES cell colonies that contained targeted plasmid insertions in either the no tail or myostatin I gene. One selection strategy involved the manual isolation of targeted cell colonies that were identified by the loss of fluorescent protein gene expression. A second strategy used the diphtheria toxin A-chain gene in a positive-negative selection approach. Homologous recombination was confirmed by PCR, sequence and Southern blot analysis and colonies isolated using both selection methods were expanded and maintained for multiple passages. The results demonstrate that zebrafish ES cells have potential for use in a cell-mediated gene targeting approach.     

利用逆转录病毒载体建立SMAD2稳定干扰的人胚胎干细胞系

目的:建立SMAD2稳定干扰的人胚胎干细胞系。方法:利用包装细胞获得重组的逆转录病毒,感染人类胚胎干细胞,为干扰组ShSMAD2、载体组VECTOR和野生型组WT;经荧光筛选获得阳性克隆;Realtime-PCR检测SMAD2 mRNA的表达。结果:带GFP荧光标记的SMAD2特异性shRNA逆转录病毒感染人类胚胎干细胞后,获得稳定干扰SMAD2表达的人胚胎干细胞系。经检测shSMAD2组SMAD2 mRNA表达较VECTOR和WT组明显降低,VECTOR和WT组之间无明显差异。结论:通过SMAD2特异性shRNA逆转录病毒载体构建了稳定干扰SMAD2的人类胚胎干细胞。     

A Simple and Convenient Method for Preparing Chimeric Animals from Embryonic stem (ES) Cells

Gene targeting in embryonic stem (ES) cells followed by preparation of chimeric animals is the most effective method to study the function of a gene during development and differentiation. Here, we describe a cost effective and convenient method to produce chimeric animals. Cryopreserved 8–16 cell mouse embryos were aggregated with ES cells in microwell petridishes (Khillan & Bao, 1997) to obtain blastocysts. Also, freshly isolated morulas were aggregated with ES cells that were positive for the green florescent protein (GFP). After overnight culture, the blastocysts that exhibited GFP florescence were transferred to the pseudo-pregnant mothers to obtain chimeric animals. The animals displayed high degree of ES contribution and transmitted gene to their progeny after mating with the normal animals. The studies demonstrate that the aggregation with cryopreserved embryos followed by the pre-selection for a visual marker can be a high throughput and cost effective method to create chimeric animals from the gene targeted ES cells.     

胚胎干细胞体外分化为造血干细胞

造血干细胞移植已成为治疗白血病、再生障碍性贫血、重症免疫缺陷征、地中海贫血、急性放射病、某些恶性实体瘤和淋巴瘤等造血及免疫系统功能障碍性疾病的成熟技术和重要手段,另外这一技术还被尝试用于治疗艾滋病,已取得积极的效果。但是由于移植需要配型相同的供体,并且过程复杂,使得造血干细胞移植因缺少配型相同的供体来源以及费用昂贵而不能被广泛应用。胚胎干细胞是一种能够在体外保持未分化状态并且能进行无限增殖的细胞,在适合条件下能够分化为体内各种类型的细胞,研究胚胎干细胞分化为造血干细胞,不仅可作为研究动物的早期造血发生的模型,而且可以增加造血干细胞的来源,还可以通过基因剔除、治疗性克隆等方法来解决移植排斥的问题,从而为造血干细胞移植的发展扫除了障碍,因此有着重要的研究价值和应用前景。现对胚胎干细胞体外分化为造血干细胞的诱导方法,诱导过程中的调控机制,并对胚胎干细胞分化为造血干细胞的存在问题和发展前景进行讨论。     

胚胎干细胞起源的探讨

目前胚胎干细胞(ESCs)建系的取材来源包括桑椹胚的卵裂球、囊胚的内细胞团(ICM)、上胚层细胞和原始生殖细胞(PGCs),甚至从新生鼠睾丸细胞也分离得到类ES样细胞系。这就提出了一个问题,什么是ESCs最接近的体内细胞来源。传统观念常常把ESCs等同于ICM细胞,也有学者认为ESCs更象上胚层细胞,而在已知的分子标记基因方面,ESCs所具有的特征更接近体内早期生殖细胞。不清楚ESCs最接近的体内细胞来源,可能是制约许多品系小鼠和大多哺乳类动物建系成功率提高的原因之一。ESCs系与EG细胞系的分离条件不同表明,加强对ESCs多能性维持基因调控研究具有重要意义。本文从ESCs的经典概念及其发展,早期胚胎细胞和生殖细胞发育规律,早期胚胎细胞、早期生殖细胞和ESCs的关系等方面进行综合分析,认为ESCs可能有多种接近的体内细胞来源。进一步应通过对ESCs建系不同的取材细胞和不同品系的ESCs间进行比较研究,以便弄清ESCs的来源和转化机制,为提高不同物种ESCs建系效率提供理论支持。     

慢病毒介导Nanog基因在小鼠ES细胞的表达

试验尝试构建小鼠Nanog基因慢病毒表达载体,培养表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。结果显示通过RT-PCR扩增出918bp的小鼠Nanog基因,测序正确的小鼠Nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普通ES细胞无明显差异,在无LIF的ES细胞培养液培养条件下,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞保持正常的ES细胞集落,碱性磷酸酶、Oct4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,相同情况下未表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞集落退化消失。试验证实了通过慢病毒载体介导培养了表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。试验尝试构建小鼠Nanog基因慢病毒表达载体,培养表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。根据小鼠Nanog基因m RNA序列设计Nanog基因引物,引物两端带有Nhe I和Xho I酶切位点。Trizol试剂处理小鼠ES细胞,通过RT-PCR扩增出小鼠Nanog基因,小鼠Nanog基因用Nhe I和Xho I酶切后连入pcDNA3.1载体中,PCR检测阳性的细菌克隆进行测序,测序正确的Nanog基因片段连接入PLL-IRES-Neo慢病毒表达载体中,包装含有Nanog基因的慢病毒感染小鼠ES细胞,在SNL细胞饲养层上G418筛选2周后,添加普通ES细胞培养液在普通小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上培养。结果显示通过RT-PCR扩增出918 bp的小鼠Nanog基因,测序正确的小鼠Nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普通ES细胞无明显差异,在无LIF的ES细胞培养液培养条件下,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞保持正常的ES细胞集落,碱性磷酸酶、Oct4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,相同情况下未表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞集落退化消失。试验证实了通过慢病毒载体介导培养了表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。     

Isolation of ES-Like Lines of Common Voles of the Genus Microtus from Blastocysts and Germ Cells and as a Result of Fusion of Somatic Cells with Mouse Embryonic Stem Cells

Three and four independent cell lines with limited pluripotency were obtained from the inner cell mass cells of blastocysts and primordial germ cells of common voles, respectively. The results of cytogenetic analysis suggest that all these lines originated from the embryos of F₁ Microtus rossiaemeridionalis × M. arvalis males and had a great number of near-triploid cells already during the early passages. The cells of these lines, like those of the inner cell mass, were characterized by the alkaline phosphatase activity. Nine independent cell lines were obtained as a result of hybridization of the mouse embryonic stem cells and vole splenocytes: eight lines and one line from hybridization with the M. kirgisorum and M. rossiaemeridionalis splenocytes, respectively. The cells of these lines expressed some properties of embryonic stem lines had a chromosome complement similar to the sum of two initial diploid sets of the mouse and vole.     

胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的分子调控机制

胚胎干细胞在不同的诱导条件下具有多向分化的潜能,多种胞内外信号途径参与其分化过程的调控。现就胚胎干细胞向血管内皮细胞分化的诱导条件及分子机制做一综述,并阐明不同阶段的内皮前体细胞所表达的不同分子标志,同时提出胚胎干细胞在再生医学中的应用前景。     

从人胚胎干细胞畸胎瘤中有效获取间充质干细胞和神经前体细胞

通过人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESC)体外分化方法和畸胎瘤形成可以分化获得多种成体细胞．但目前尚不清楚是否可以从hESCs畸胎瘤中分离某些特异性细胞．通过体外筛选方法,有效地从hESCs畸胎瘤中分离出神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)．这种hESCs畸胎瘤来源的NPCs和MSCs与体内神经前体细胞和间充质干细胞有着相似的分子标记和特性,并具有进一步的分化潜能——分别可以诱导成为神经元、神经胶质细胞、脂肪细胞和骨骼细胞等．根据人胚胎干细胞畸胎瘤中含有不同分化阶段的外胚层、中胚层和内胚层的组织或细胞,认为人胚胎干细胞畸胎瘤可以作为另一个细胞来源以获取多种(包括人胚胎干细胞体外分化难以得到的)各种前体/干细胞和终末分化细胞．