去卵巢骨质疏松山羊骨髓基质细胞成骨分化能力的研究

目的：研究在构建的去卵巢骨质疏松山羊动物模型中,骨髓基质细胞（MSCs）的生物学特性以及其成骨能力。方法：建立去卵巢骨质疏松山羊动物模型,使用全骨髓法获取去卵巢骨质疏松山羊（实验组）和正常山羊（对照组）MSCs,流式细胞仪检测实验组和对照组细胞周期及增殖指数（PI）;地塞米松诱导21d时油红O染色,观察成脂分化比例;成骨诱导液诱导14d,碱性磷酸酶（ALP）染色、检测ALP表达量。结果：对照组PI高于实验组;地塞米松诱导后实验组脂肪细胞比例明显高于对照组;成骨诱导第7d,对照组ALP的表达量明显高于实验组。结论：去卵巢骨质疏松山羊的MSCs增殖和成骨分化能力都降低,可能与骨质疏松症的发病机理有关。     

低氧对 MSCs 增殖和分化的影响

摘要： 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是具有自我更新、 多向分化和强可塑性的细胞, 具有分化为血液、 骨、 软骨、 脂 肪、 肌肉、 表皮、 上皮、 神经等组织的潜能, 受到再生医学研究的关注。目前已有研究表明将 MSCs 移植到多种损伤组织中都能改 善损伤组织的功能。文章在简要回顾了低氧环境对 MSCs 增殖和分化的研究内容和有关理论争论基础上重点介绍了缺氧诱导因 子 （ HIF ）通路对 MSCs 增殖和分化的影响。文章阐述了低氧环境对 MSCs 向成骨,成软骨,成脂及成神经元方向分化的影响。 由于 人体组织内生理条件下的氧张力远远小于大气中的氧张力 （21% ）, 采用低氧培养 MSCs 的研究方法得出的结论将更加贴近实际 MSCs 在人体内的增殖、分化情况。因此研究 MSCs 在低氧张力环境中增殖、分化的能力将为 MSCs 能成功移植到体内并发挥作 用提供保障。     

骨髓来源的间充质干细胞分化能力的鉴定

本文研究了人骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)的成骨及成脂分化的潜能.通过加入诱导成骨的诱导剂,人的MSCs出现成骨分化的机箱,通过碱性磷酸酶活性测定,茜素红染色及主要调控基因BMP2和Runx2的表达,确定了MSCs具有成骨分化的潜能.对于成脂分化,通过油红O染色,及主要标志基因PPARγ的表达确定其具有成脂分化的潜能.所以,从骨髓分离的到的MSCs纯度达到标准,并且具有成骨成脂分化的多向潜能,是一种理想的实验模型细胞.     

隔离器内残留过氧化氢去污剂对MSCs和NK两种细胞增殖及生物学特性的影响研究

该文研究了特定过氧化氢去污剂残留量对间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)的增殖及生物学特性的影响。采用低浓度过氧化氢去污剂建立特定残留量进行MSCs和NK细胞培养,应用细胞计数法分析细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞表面标记,并采用诱导分化培养基定向诱导MSCs成骨、成脂、成软骨分化。结果显示,MSCs和NK细胞在3～5 mg/m³浓度的过氧化氢环境下形态正常且增殖活跃。流式细胞仪检测结果显示,MSCs的CD73、CD105、CD90均呈高表达,CD45、CD34、CD14、CD79a、HLA-DR为阴性表达;NK细胞表达CD56⁺和CD3~–的百分比超过70%。诱导后,MSCs具有成骨、成脂、成软骨分化的潜能。总之,MSCs和NK细胞在含有低浓度的残留过氧化氢去污剂的培养环境中生长良好,与未含有过氧化氢去污剂的培养环境比较,增殖能力和分化潜能均无显著差异。     

低氧对MSCs增殖和分化的影响

间充质干细胞（mesenchymal stemcells, MSCs）是具有自我更新、多向分化和强可塑性的细胞,具有分化为血液、骨、软骨、脂肪、肌肉、表皮、上皮、神经等组织的潜能,受到再生医学研究的关注。目前已有研究表明将MSCs 移植到多种损伤组织中都能改善损伤组织的功能。文章在简要回顾了低氧环境对MSCs增殖和分化的研究内容和有关理论争论基础上重点介绍了缺氧诱导因子（HIF）通路对MSCs 增殖和分化的影响。文章阐述了低氧环境对MSCs向成骨,成软骨,成脂及成神经元方向分化的影响。由于人体组织内生理条件下的氧张力远远小于大气中的氧张力（21%）,采用低氧培养MSCs 的研究方法得出的结论将更加贴近实际MSCs在人体内的增殖、分化情况。因此研究MSCs 在低氧张力环境中增殖、分化的能力将为MSCs 能成功移植到体内并发挥作用提供保障。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离与培养条件的优化研究

目的:建立和优化大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的分离培养条件,以获得群体均一、未分化状态保持良好的MSCs.方法:收集不同周龄大鼠骨髓细胞;以不同浓度Percoll密度梯度离心分离骨髓单个核细胞;以60%低糖DMEM40%MCDB201为基础培养基,培养24h去悬浮细胞;以不同接种密度传代培养;碱性磷酸酶染色和油红O染色考察MSCs向骨和脂肪组织分化的潜能.结果:采用57%Percoll液的分离效果优于70%Percoll液.6周龄(体重约180g)大鼠能在细胞分离的质和量上达到最佳效果.24h进行悬浮细胞去除、5×103/cm2接种密度传代培养,光镜和电镜显示MSCs增殖能力强,功能状态活跃,成脂成骨实验显示多向分化潜能保持良好.结论:优化大鼠周龄、分离液的密度、细胞培养条件及改进培养方法有助于获得多向分化潜能保持良好的均一的MSCs.     

贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法。研究MSCs的生物学特性,为血管组织工程提供理想的种子细胞。方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSCs体外培养和连续传代,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化;利用MTT法测定MSCs的生长曲线;行免疫组化方法鉴定MSCs膜抗原;分别加成骨、成脂肪诱导剂后MSCs体外培养1到3周,分别做碱性磷酸酶(ALP)、VonKossa染色及油红O染色,观察细胞形态变化、成骨及成脂肪分化结果。结果MSCs体外培养生长状况良好,呈均一的成纤维细胞样,表达波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),不表达层粘连蛋白(Laminin)、CD34、VIII因子相关抗原(VIII)。经体外诱导后具有多向分化潜能。结论贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSCs,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性,为其成为血管组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。     

再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞生物学特性的初步研究

目的:研究再生障碍性贫血(aplasticanemia,从)患者骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的生物学特性和初步探讨其异常和AA发生的可能关系。方法:取AA患者骨髓间充质干细胞,测定其生长曲线和倍增时间;流式细胞仪检测其细胞周期和免疫表型;体外定向诱导其向脂肪、成骨、内皮和神经细胞分化;用real-timePCR及油红O染色法比较AA和正常对照组MSCs的成脂分化的不同。结果:AA患者和正常成人的MSCs均呈梭形贴壁生长;AA组细胞倍增时间长于对照组;CD105、CD44、CD29、CD106、FlK-1均阳性;96．51％的细胞处在G0／G1期;AA患者的MSCs保持了多向分化潜能,体外诱导形成脂滴较对照组早,诱导早期的脂蛋白脂酶表达增高。结论:再生障碍性贫血患者的骨髓间充质干细胞增殖能力较正常成人弱,骨髓间充质干细胞的易成脂性可能参与了再障的发病环节。     

小鼠间充质干细胞诱导分化成脂肪细胞miRNA表达的变化

目的：探讨小鼠间充质干细胞（MSCs）定向诱导分化成脂肪细胞微小RNA（miRNA）表达的变化,为进一步研究miRNA调控MSCs向脂肪细胞分化的分子机制奠定基础。方法：采用全骨髓体外分离结合差速贴壁法纯化扩增C57BL／6小鼠MSCs,形态学观察细胞生长情况,并用免疫组化方法鉴定细胞表面抗原CD29、CIM4和CD34的表达。脂肪细胞分化诱导剂诱导MSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色,判断MSCs成脂分化情况。运用rrfiRNA芯片技术检测MSC8和脂肪细胞中差异表达的miRNA。结果：①倒置显微镜下观察,传5代后可获得均一性较高的MSCs;免疫组化显示90％以上的骨髓间质干细胞CD29、CD44阳性,CD34阴性。MSCs经脂肪诱导剂诱导后,胞内大量脂滴形成,油红O染色阳性;②基因微阵列分析表明,小鼠MSCs分化成脂肪细胞差异表达的miRNA共75个,其中20个表达上调、55个表达下调。结论：MSCs分化成脂肪细胞存在miRNA表达的变化,某些miRNA很可能具有重要的调控MSCs成脂分化的作用。     

PD-1/PD-L1参与骨髓间充质干细胞归巢修复慢阻肺大鼠的肺损伤

目的 研究程序性死亡蛋白1(programmed death-1, PD-1)/程序性死亡蛋白配体1(programmed death ligand-1,PD-L1)在间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）归巢修复慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）中的影响。方法 分离纯化骨髓来源MSCs,流式细胞术检测细胞表面分子表达,油红O染色、碱性磷酸酶染色分别观察MSCs成脂及成骨分化情况。采用烟气暴露法构建COPD大鼠模型,造模完成后将绿色荧光蛋白（GFP）标记的MSCs经尾静脉分别注射入正常及COPD大鼠模型中,通过观察肺部荧光评价MSCs的归巢效果;经尾静脉向COPD模型大鼠注射MSCs作为MSCs治疗组,模型组和正常对照组注射等体积生理盐水,HE染色观察各组大鼠肺脏组织病理改变,qRT-PCR比较各组大鼠肺脏组织PD-1的表达情况;体外qRT-PCR检测PD-L1在MSCs的表达,Transwell实验法观察PD-1及PD-L1抗体对MSCs定向迁移（归巢）的影响。结果 大鼠骨髓来源M...     

TGF-β1诱导马鹿茸MSCs软骨分化及c-myc基因的表达

鹿茸间充质干细胞(MSCs)是维持茸再生与骨化的重要组织,旨在研究鹿茸MSCs的软骨分化及原癌基因c-myc对该过程的调控作用。利用成年塔里木马鹿生长60 d的鹿茸第2代间充质干细胞(MSCs,P2),通过TGF-β1(10 ng/m L浓度)刺激,诱导塔里木马鹿茸间充质干细胞向软骨分化,采用免疫组化和阿利新蓝染色鉴定诱导结果,并通过q PCR方法检测软骨分化过程中c-myc基因的表达变化。结果显示,MSCs在诱导后的第9天开始出现细胞形态变化,由梭形向多角形转变,原来菊花状的分布逐渐向铺路石状变化,至14 d可观察到软骨陷窝,21 d软骨细胞基质明显,并开始出现细胞凋亡。非诱导组28 d细胞出现凋亡,细胞内发现空泡。35 d两组细胞凋亡明显,细胞折光性变差,间隙变大。阿利新蓝染色鉴定,诱导至第14天细胞基质中开始出现大量阳性染色。免疫组化实验检测,诱导至21 d的细胞基质中出现棕色Col II阳性反应物,随培养时间增加颜色加深,并集中分布在细胞及其周围基质中。在软骨分化进程中,第7、14、21和28天,诱导组c-myc基因表达与非诱导组相比显著下调(P0.05),但诱导至35 d,诱导组c-myc表达与非诱导组相比无显著差异(P0.05)。在TGF-β1刺激下,塔里木马鹿茸MSCs可以分化成软骨,原癌基因c-myc下调表达诱导鹿茸MSCs进入凋亡状态并分化为软骨细胞。     

骨质疏松大鼠脂肪基质细胞成骨能力的研究

目的:探讨骨质疏松大鼠的脂肪基质细胞有无成骨能力。方法:采用去势法构建SD大鼠骨质疏松模型,设置2组样本,分别为19月龄骨质疏松SD雌性大鼠,正常19月龄SD雌性大鼠。每组大鼠分别取腹股沟脂肪垫中脂肪,用胶原酶消化法培养获得脂肪间充质干细胞,绘制并分析细胞生长曲线;再用经典的骨向诱导液诱导2组ASCs,比较2组细胞骨向分化能力有无差别。结果:骨质疏松大鼠与正常老龄大鼠的ASCs骨向分化能力无明显差别。结论:可用去势法构建SD大鼠骨质疏松模型,并可取其细胞行进一步研究。老龄骨质疏松大鼠的ASCs也可以考虑作为种子细胞促进其自体骨愈合,从而为利用自体ASCs促进骨质疏松骨愈合打下一定的理论基础。     

诱导人脐带间充质干细胞分化为视网膜色素上皮样细胞的研究

目的：探讨用猪视网膜色素上皮细胞（RPE）条件培养基诱导hUCMSCs分化为RPE样细胞的方法。方法通过流式细胞技术鉴定hUCMSCs的表面标记分子;通过诱导hUCMSCs分化成为脂肪、骨和软骨细胞确定其多系分化能力;将hUCMSCs培养在猪RPE的条件培养液中并添加诱导因子来诱导hUCMSCs向RPE细胞分化。对照组与处理组Q-PCR结果采用t检验比较。结果 hUCMSCs表达CD105、CD90、CD73、CD44和CD29,但不表达CD34,CD45和MHCII等分子标记,在成脂、成骨、成软骨分化培养基中可分化为脂肪、骨和软骨细胞。单独使用猪RPE条件培养液不能有效诱导hUCMSCs向RPE细胞分化,但联合应用猪RPE条件培养液和诱导因子（视黄酸,activin-A和人重组骨形成蛋白-7）可有效诱导hUCMSCs分化为RPE样细胞,RPE细胞标记分子RPE65、Mitf和Ck8/18的基因表达量分别提高了2.1±0.4、6.8±1.3和2.5±0.3倍（P〈0.05）。诱导产生的RPE样细胞呈多边形,但不含色素颗粒。结论猪RPE条件培养液联合诱导因子可有效诱导hUCMSCs分化为RPE样细胞,可能会为治疗视网膜变性疾病提供合适的种子细胞。     

模拟微重力对骨髓间充质干细胞增殖及其向脂肪方向分化能力的影响

目的：探讨模拟微重力（SMG）对骨髓间充质干细胞（MSCs）的增殖及向脂肪方向分化能力的影响。方法：第一部分将第三代的MSCs分为两组,分别在正常重力下（NG组）及微重力下（SMG组,采用回转模拟装置以30r/min回转模拟微重力）,培养72h后,采用BrdU标记法检测两组细胞的增殖情况,细胞计数法绘制细胞生长曲线。Western Blot检测干细胞标志物Oct4、SSEA4的表达情况,第二部分将第三代MSCs分为三组：第一组在NG条件下培养后,加入脂肪方向诱导剂在NG条件下诱导、第二组在SMG条件下培养,在NG条件下诱导,第三组在SMG条件下培养,在SMG条件下诱导。7天后,油红O染色观察脂肪方向的诱导率,Western Blot检测过氧化物酶增殖物激活受体γ2（PPARγ2）以及Oct4的表达。结果：第一部分：流式细胞仪检测SMG组BrdU标记阳性率明显高于NG组,表明细胞增殖较快,Western Blot结果显示SMG组细胞中Oct4、SSEA4的表达量明显高于NG组,有统计学意义。第二部分：脂肪方向诱导后第一组细胞油红O染色阳性,Western Blot显示PPARγ2呈阳性表达,Oct4仅有微量表达,第二组油红O染色阳性表达率明显高于第一组,且PPARγ2表达较第一组增多,几乎未见Oct4的表达,第三组细胞油红O染色阴性,且几乎不表达PPARγ2,而Oct4表达较前两组升高。结论：模拟微重力可促进骨髓间充质干细胞增殖,提高其向脂肪方向分化的能力可能与微重力保持其未分化状态相关。     

不同分化状态下间充质干细胞向血管内皮生长因子的迁移

目的:探讨间充质干细胞(MSCs)对趋化因子VEGF的定向迁移能力与其分化状态之间的关系。方法:本实验运用采用Percoll分离法在体外培养并扩增大鼠骨髓来源MSCs,应用抗氧化剂诱导方案诱导MSCs向神经样细胞分化,运用Boyden chamber及Dunn chamber趋化性迁移装置研究了在趋化因子VEGF诱导下不同分化状态的间充质干细胞定向迁移,比较了各分化状态下细胞的迁移速度和迁移效率。结果:Boyden chamber实验结果显示下室加入不同浓度VEGF后,不同状态细胞向同一浓度VEGF迁移的数量不同,不同浓度VEGF诱导同一状态细胞的迁移数量也不同;Dunn chamber的实验结果显示在某一分化阶段(预诱导24小时)的MSCs具有更高的迁移效率。结论:MSCs的分化影响了其向VEGF的定向迁移,也就是说,不同分化状态的MSCs显示出不同的迁移行为。     

体外定向诱导大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的研究大鼠骨髓基质干细胞的生长特点和诱导条件下的成骨能力。方法通过密度梯度离心和贴壁培养法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、p甘油磷酸纳和维生素c的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化并检测碱性磷酸酶活性和细胞矿化作用。结果原代培养基质干细胞首先形成细胞集落,14d时集落间接近融合;传代细胞体积变大,约5～7d传代一次。诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,并出现了矿化结节。结论骨髓基质干细胞易于分离培养及体外扩增,成骨能力肯定,可作为骨组织工程的种子细胞。     

人体皮肤成纤维细胞的快速分离及多向分化能力鉴定

目的建立快速分离人皮肤成纤维细胞的方法,并探讨成纤维细胞在成脂、成骨、成软骨和成神经的多向分化潜能。 方法利用组织块培养法分离人体皮肤成纤维细胞,通过形态学观察、流式分析、Vimentin蛋白染色鉴定成纤维细胞;再利用生长曲线、核型分析、线粒体染色分析不同传代细胞的增殖速度,线粒体及染色体形态的改变;最后进行成纤维细胞成脂、成骨、成软骨和成神经的诱导分化实验,鉴定其多向分化潜能。两代细胞增殖速度及线料体相对量的比较采用t检验统计分析。 结果分离的皮肤成纤维细胞呈典型梭状及多角形;高表达细胞表面标记物CD90 （NCF1,NCF2占比分别为99.9%,98.7%）和CD73 （NCF1,NCF2占比分别为98.2%,85.6%）,但极少表达造血干细胞标记物CD34 （NCF1,NCF2占比分别为1.8%,2.6%）;细胞Vimentin蛋白表达呈阳性,阳性率为100%;对细胞生长曲线进行分析,表明分离后不同代次细胞增殖差异无统计学意义（t?= 1.586,P?= 0.1567）;线粒体相对含量统计分析,同一株细胞系第5代（相对荧光强度值：6876±577.8）与第10代（相对荧光强度值：7371±471.9）之间的差异无统计学意义（t?= 0.664,P?= 0.543）;核型分析分别显示传代后保持染色体数目为正常46条且形态无明显异常;经诱导后成纤维细胞可向成脂、成骨、成软骨和类神经分化。 结论利用组织块培养法分离出的人体皮肤成纤维细胞状态稳定,增殖能力强,具有成脂、成骨、成软骨和成神经多向分化诱导潜能,为细胞移植修复骨损伤、软骨损伤和神经损伤性疾病的临床研究提供细胞来源及实验依据。     

FGF-2对人骨髓间充质干细胞增殖和向成骨细胞分化的影响

探讨体外培养条件下,成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）和地塞米松（Dex）对第7代人骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖和向成骨细胞分化的作用以及两者联合使用的效应。MSCs经含FGF-2或／和Dex的培养液作用后,于不同时间采用MTT法测定细胞增殖情况;对硝基苯磷酸（pNPP）法测定碱性磷酸酶（ALP）活性;ELISA法测定骨钙蛋白（OC）含量;茜素红S染色法对沉积的钙盐进行染色。发现：（1）FGF-2组细胞的生长速度为对照组的1．31倍,Dex／FGF-2组细胞的生长速度为FGF-2组的1．12倍。（2）Dex组的ALP活性、OC含量和细胞外基质钙盐沉积分别为对照组的17．0倍、2．12倍和10．56倍,并能形成成熟的羟基磷灰石（HA）结晶和骨结节;FGF-2组的ALP活性比对照组降低了76．7％,虽然OC含量、钙盐沉积增加,但不能形成成熟的HA结晶和骨结节;FGF-2对Dex诱导的ALP活性增加和HA结晶形成有拮抗作用。由此证明：（1）FGF-2可促进MSCs的增殖,Dex对MSCs的增殖无明显作用;Dex能增强FGF-2对MSCs的促增殖效应。（2）Dex可使MSCs分化为成熟的成骨细胞,是一个有效的成骨细胞分化诱导剂;FGF-2可使MSCs分化为未成熟的成骨细胞;FGF-2拮抗Dex诱导MSCs分化为成熟的成骨细胞。     

真皮成纤维细胞成骨分化的实验研究

目的比较不同诱导剂对真皮成纤维细胞成骨分化的不同影响,探讨成纤维细胞成骨分化机制。方法取新生大鼠皮肤进行组织块培养,真皮成纤维细胞分离培养及鉴定,并分别由地塞米松、1,25(OH)2D3以及地塞米松和1,25(OH)2D3进行成骨分化诱导。分别于诱导后14d行ALP含量测定,21d行茜素红染色,并进行TAZ表达检测。结果真皮成纤维细胞表达波形蛋白,不表达角蛋白;成纤维细胞诱导14d后,1,25(OH)2D3诱导组及地塞米松+1,25(OH)2D3诱导组ALP含量与对照组有显著差异;成骨诱导21d,地塞米松诱导组仅见少量散在红色钙结节形成,1,25(OH)2D3诱导组钙结节数量增高,地塞米松+1,25(OH)2D3诱导组钙结节数量明显增高,直径变大;1,25(OH)2D3诱导组及地塞米松+1,25(OH)2D3诱导组,经TAZ免疫荧光染色,可见部分细胞核表达TAZ。结论地塞米松可促进1,25(OH)2D3诱导真皮成纤维细胞成骨分化。