INS-1E细胞葡萄糖毒性模型的建立

目的:建立胰岛细胞系INS-1E细胞的葡萄糖毒性模型。方法:将INS-1E细胞分别在不同葡萄糖浓度(5.5 mmol/L、16.7mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L)的1640完全培养基中培养不同时间(48 h、72 h、96 h、120 h),分别在不同时间点取细胞进行细胞功能检测,实时荧光定量PCR法检测胰岛素m RNA的表达,ELISA检测葡萄糖刺激的胰岛素的分泌。结果:与对照组相比,高糖浓度(5.5 mmol/L、16.7 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L)培养基中培养48 h后,INS-1E细胞的胰岛素合成和分泌的功能均增加(P均0.05),随着培养基中葡萄糖浓度的升高以及培养时间的延长,INS-1E细胞胰岛素合成及分泌的功能逐渐下降,当在葡萄糖浓度为30 mmol/L的培养基中培养120 h后,胰岛素m RNA合成及葡萄糖刺激的胰岛素分泌均显著降低(P均0.01)。结论:INS-1E细胞在30 m M的葡萄糖中培养120 h形成稳定的葡萄糖毒性模型。     

高浓度葡萄糖对体外培养大鼠胰岛细胞凋亡的影响

目的:探讨高浓度葡萄糖对体外培养大鼠胰岛细胞凋亡的影响及作用机制。方法:SD大鼠胰岛细胞原代培养,不同浓度的葡萄糖处理后,采用MTT比色法检测细胞存活率,Hoechst-PI染色观察细胞凋亡,电镜观察细胞超微结构改变,RT-PCR方法检测Bax及Bcl-2相关基因mRNA表达水平。结果:5.5 mmol·L~(-1),11.1 mmol·L~(-1)和22.2 mmol·L~(-1)葡萄糖处理后,胰岛细胞活性分别下降到78.08%±2.29%、58.39%±3.13%和36.05%±2.63%,与阴性对照组比较差异具有统计学意义(P0.05);Hoechst-PI染色结果显示随着葡萄糖作用浓度的增加,凋亡细胞数量也增加;RT-PCR显示胰岛细胞经不同浓度葡萄糖处理后,Bax mRNA的表达明显上调,Bcl-2 mRNA表达下调(P0.05);电镜观察结果显示随着葡萄糖作用浓度的增加,胰岛细胞超微结构损害程度依次加重。结论:高浓度葡萄糖能明显引起胰岛细胞活性的下降,诱导凋亡反应的发生,凋亡机制与Bcl-2家族蛋白相关。     

全反式维甲酸对SD大鼠系膜细胞株增殖和Ⅳ型胶原的影响

目的:观察全反式维甲酸(ATRA)对高糖环境大鼠肾小球系膜细胞(MCs)增殖及Ⅳ型胶原的影响.方法:以高糖(葡萄糖浓度为25mmol.1-1)刺激体外培养的大鼠MCs增殖,然后根据实验分组加入不同浓度的ATRA:对照组:5.6mmol.1-1葡萄糖+2%FBS DMEM培养基;实验组:25 mmol.1-1葡萄糖+2%FBS DMEM培养基+不同浓度的ATRA(分别为0 mol.1-1、10-8 mol.1-1、10-7mol.1-1、10-6mol.1-1,采用MTT比色法观察12、24、48h系膜细胞的增殖情况;Elisa法测定12、24、48h细胞上清液中Ⅳ型胶原的含量.结果:ATRA有抑制高糖所致的MCs增殖、减少细胞外基质(ECM)的作用,并呈剂量时间依赖性.结论:ATRA对高糖所致MCs增殖具有抑制作用,且呈剂量依赖性.     

阻断RAS对HSkMCs细胞株细胞凋亡及Mfn2 表达的影响

目的:观察氯沙坦对高糖培养人骨骼肌细胞(Human skeletal muscle cells,HSk MCs)中线粒体融合蛋白2(mitofusin2,Mfn2)的表达及其对细胞凋亡的影响。方法:1.使用不同浓度的葡萄糖养基(葡萄糖浓度分别为5.55 mmol/L,11.1 mmol/L,22.2 mmol/L)分别培养HSk MCs细胞株48小时,检测各组细胞中血管紧张素Ⅰ型受体(Angiotensin II type I receptor,AT1R)基因、基因Mfn2的表达,并用流式细胞术检测细胞凋亡。2.根据1中实验结果,选择对Mfn2影响最大的葡萄糖浓度(此组葡萄糖浓度为22.2mmol/L)作为后续实验的条件。加入血管紧张素受体Ⅱ拮抗剂(Angiotensin Receptor Blockers,ARB)氯沙坦(Losartan),处理人骨骼肌细胞(HSk MCs)48 h,以未加氯沙坦为对照组,观察其对线粒体融合蛋白2(Mfn2表达的影响,并行流式细胞术检测细胞凋亡。结果:氯沙坦干预组HSk MCs细胞中Mfn2表达上调,细胞凋亡减少。结论:阻断肾素血管紧张素系统(Renin-angiotensin System,RAS)能上调HSk MCs细胞株中的Mfn2表达,并减少细胞凋亡。     

低糖低氧对神经干细胞增殖和代谢的影响

目的:本研究旨在探讨低糖低氧对大鼠神经干细胞增殖和代谢的影响。方法:实验采用不同葡萄糖浓度的培养基以及不同的氧浓度进行处理:高糖(4.5g/L)、低糖(1.4g/L);常氧(20%O2)、低氧(3%O2);神经干细胞(NSCs)来自孕13.5d的大鼠中脑,在不同糖浓度下培养至第三代进行低氧处理,分为低糖常氧(L+N)、低糖低氧(L+H)、高糖常氧(H+N)、高糖低氧(H+H)组。神经干细胞在上述四种条件下分别培养1、3、5d后,利用CCK-8检测神经干细胞的增殖情况;生化分析仪测定细胞培养上清液中葡萄糖、乳酸、丙酮酸浓度;RT-PCR方法检测葡萄糖转运蛋白4(GluT4)、葡萄糖激酶(GK)、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)的表达变化。结果:在低糖低氧条件下培养3d时NSCs的数量增加最为明显;低糖低氧条件下,葡萄糖浓度降低最为显著;而丙酮酸浓度在低糖处理组均高于高糖处理组;同样地,在低糖低氧处理组培养上清中乳酸含量增加的幅度最大;此外,在低糖或低氧时Glut4和PK的表达也明显高于对照组。结论:低氧能促进NSCs的增殖,而以低氧和低糖共同作用时更为明显;在低氧低糖条件下,神经干细胞的代谢发生变化,葡萄糖的利用明显增加,主要通过糖酵解途径代谢产能。     

不同浓度葡萄糖对β-TC3 细胞Gα表达的影响

目的:研究不同浓度葡萄糖对β-TC3(小鼠胰岛β细胞瘤细胞)细胞Gα(G蛋白α亚基)表达的影响。方法:β-TC3细胞在正常葡萄糖浓度下(11.1 mM)适应性生长两天后,将细胞暴露于不同葡萄糖浓度(25、50 mM),分别于24、48、96h收集细胞,并行蛋白质印迹检测Gα的表达。结果:加入葡萄糖后24、48、96h,Gα的表达明显下降(相对对照组)。结论:持续高糖刺激,可导致β-TC3细胞Gα表达的下调,从而影响细胞信号转导,致使胰岛素抵抗的发生。     

人肾小球血管内皮细胞胰岛素抵抗模型的建立

目的:采用不同浓度的棕榈酸与葡萄糖在体外诱导建立人肾小球内皮细胞(Human glomerular endothelial cells,HRGEC)胰岛素抵抗模型。方法:以人肾小球内皮细胞为研究对象,不同浓度棕榈酸(100,200,300,400,500μmol/L)与不同浓度的葡萄糖(20,30,40,50,60 mmol/L)分别作用细胞24小时和48小时,应用MTT法和葡萄糖氧化酶法检测棕榈酸和葡萄糖对HRGEC存活率与葡萄糖消耗量的影响,蛋白免疫印迹法检测P-IRS、IRS、AKT和p-AKT (Ser473)的影响。结果:1、当棕榈酸500μmol/L干预细胞24小时,与正常组比较,细胞活性显著下降(P0.01),棕榈酸浓度大于或等于300μmol/L干预细胞48小时,细胞存活率显著降低(P0.01)。与空白组比较,300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L棕榈酸干预细胞24小时能够明显的降低细胞的葡萄糖消耗(P0.05);200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L干预细胞48小时能够明显的降低细胞的葡萄糖消耗(P0.01)。2、不同浓度葡萄糖刺激人肾小球内皮细胞(HGREC)24小时和48小时,与空白组比较,各组细胞的存活率与对照组比较均无显著变化(P0.05)。与空白组比较,40mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L葡萄糖干预细胞24小时能够降低人肾小球内皮细胞的葡萄糖消耗(P0.05)。与空白组比较,30mmol/L、40mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L葡萄糖干预细胞48小时能够明显降低人肾小球内皮细胞的葡萄糖消耗量(P0.01)。3、不同浓度的葡萄糖刺激人肾小球内皮细胞(HGREC)24小时后,结果显示,50 mmol/L、60 mmol/L葡萄糖刺激细胞24小时能降低P-IRS/IRS和p-AKT/AKT (Ser473)的水平(P0.01),而其他组无明显显著变化(P0.05)。结论:高糖诱导方法能够建立HRGEC细胞胰岛素抵抗模型,具有建模周期短、容易重复、可控性强的优点,可用于糖尿病胰岛素抵抗机制的研究和中药成分的筛选研究。     

TLR4 对人骨骼肌细胞炎症因子表达及胰岛素抵抗的影响

目的:研究TLR4对脂多糖(LPS)及Polymymin B(PMB)作用下的人骨骼肌细胞的炎症因子表达的影响及其在细胞胰岛素抵抗中的作用。方法:通过脂多糖(LPS)及Polymymin B(PMB)干预骨骼肌细胞24h,再用胰岛素刺激1h后,Real-time PCR检测检测骨骼肌细胞TLR4、MyD88、TNF-αmRNA的表达;Western blot检测TLR4,Myd88和CRP的表达;葡萄糖氧化酶法(GOD-POD法)检测细胞培养液中葡萄糖浓度。结果:TLR4高表达可以使炎症因子的表达增高,细胞培养液中的葡萄糖浓度增高;TLR4低表达可使炎症因子的表达降低,细胞培养液中的葡萄糖浓度没有明显变化。结论:TLR4调控了炎症因子的表达,继而可以引起胰岛素敏感性的改变,影响了胰岛素抵抗的发生。     

葡萄糖和胰岛素对血管内皮细胞中microRNA-21的表达影响

目的:研究miRNA-21和程序性细胞死亡因子4(PDCD4)在不同浓度葡萄糖或胰岛素培养血管内皮细胞中的表达情况,探讨miRNA-21对内皮细胞凋亡功能的影响。方法:用不同浓度D-葡萄糖(5.5、11、22及33mM)和胰岛素(0、1、10、50、100及1000nM)分别干预人脐静脉内皮细胞(HUVECs),2天后收集细胞用实时荧光定量RT-PCR方法检测细胞中miRNA-21及PDCD4的mRNA表达情况,用蛋白印迹方法检测PDCD4在细胞中的表达变化。结果:与5.5mM葡萄糖对照组相比,高葡萄糖浓度组(11、22及33mM)中HUVECs的miRNA-21随着葡萄糖浓度的增加表达明显降低(p<0.01);PDCD4的蛋白表达增加(p<0.05),但PDCD4的mRNA表达无差异(p>0.05)。与0nM胰岛素组相比,10、50、100、1000nM胰岛素组细胞中miRNA-21表达下降(p<0.05),PDCD4的蛋白表达增加(p<0.01),1000nM组miRNA-21表达降低程度和PDCD4的蛋白表达增加程度最为明显(p<0.05),但不同浓度胰岛素对PDCD4的mRNA表达无差异(p>0.05...     

盐酸胺碘酮注射液与4种输液的配伍稳定性考察

目的:研究探讨盐酸胺碘酮注射液与其他输液(包括浓度分别为5%与10%的葡萄糖注射液,浓度为0.9%的氯化钠注射液,以及葡萄糖氯化钠注射液四种)配伍过程中具有的稳定性。方法:以当前的临床用药标准为依据,将四种注射液分别注入到一次性灭菌注射器中,随后分别往灭菌注射器中加入20ml的舒血宁注射液后摇匀倒置,在配伍8h内观察混合液外观性状、含量以及PH的变化情况。结果:通过实验,观察到在完成与浓度为10%的葡萄糖注射液,浓度为0.9%的氯化钠注射液,以及葡萄糖氯化钠注射液配伍后,盐酸胺碘酮的PH值与含量均出现比较明显的变化,但是在与5%葡萄糖注射液配伍后,溶液的各项指标并未发生明显的变化,溶液相对比较稳定。结论:在临床用药中,将盐酸胺碘酮与5%葡萄糖注射液配伍后,保持溶液在常温下的一段时间内使用,可有效保证混合溶液的性质,药效不会发生改变。     

高浓度葡萄糖下调INS-1细胞血红素氧合酶1表达水平的研究

目的:观察高糖毒性对大鼠胰岛细胞系INS-1细胞中血红素氧合酶1蛋白表达的损害作用,并研究信号分子刺激下细胞损伤的自我保护机制.方法:分别采用不同葡萄糖浓度孵育或葡萄糖代谢物葡萄糖胺持续孵育培养INS-1细胞,造成高糖毒性损伤,进而采用胰岛素以及核转录因子Nrf2激动剂莱芜硫烷刺激细胞保护信号机制改善损伤,蛋白印迹法检测细胞中血红素氧合酶1的表达情况.结果:高浓度葡萄糖溶液中(25 mM)孵育INS-1细胞48小时,血红素氧合酶1的表达水平较正常情况显著下降(P＜0.05).高浓度葡萄糖与葡萄糖胺共刺激对实验细胞中血红素氧合酶1的表达下调具有协同作用.胰岛素对实验细胞中血红素氧合酶1表达具有上调作用,但上调作用强度随培养环境中葡萄糖浓度的增高而降低.核转录因子Nrf2激动剂莱芜硫烷孵育处理实验细胞后,胞内血红素氧合酶1表达水平在葡萄糖胺刺激下上调,且与培养环境中葡萄糖浓度水平无关(P＜0.05).结论:高糖毒性可损害胰岛β细胞内抗氧化酶-血红素氧合酶Ⅰ的表达,而胰岛素可激活下游通路尤其是Nrf2信号通路,对抗高糖诱导的氧化应激损伤,从而保护胰岛细胞.     

组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶重组大肠杆菌发酵条件研究

目的:对重组大肠杆菌组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(AfPGA)进行了发酵条件研究。方法:在摇瓶和5L发酵罐中研究了(NH4)2SO4和葡萄糖浓度对质粒的分离稳定性及青霉素G酰化酶表达的影响。结果:该工程菌质粒具有分离不稳定性,培养基中无(NH4)2SO4时发酵过程中pH和糊精水解生成葡萄糖的浓度变化较小,细胞前期(0h-12h)的生长速率降低,质粒分离稳定性和青霉素G酰化酶的表达水平提高。发酵过程中维持低葡萄糖水平可以限制细胞的生长速率,提高质粒稳定性和促进青霉素G酰化酶的合成。采用混合碳源发酵,发酵培养基含糊精2g/L,12h后以1g/L.h恒速流加葡萄糖至35h,控制流加过程葡萄糖浓度0.1g/L左右,平均比生长速率为0.06h-1,发酵结束时质粒稳定性为86%,青霉素G酰化酶的表达水平达23 000U/L。结论:重组大肠杆菌组成型表达青霉素G酰化酶的研究对工业生产有一定指导意义。     

葡萄糖对重组CHO细胞生长代谢及EPO表达的影响

在CHO细胞批培养中 ,葡萄糖浓度从8.9增加到49.6mmol/L ,最大活细胞密度没有明显的差异 ,乳酸对葡萄糖的得率系数首先随着葡萄糖浓度的增加而增加 ,葡萄糖浓度达到 17.9mmol/L后 ,乳酸对葡萄糖的得率系数基本上维持恒定。在本实验中 ,葡萄糖浓度对谷氨酰胺代谢没有明显的影响。EPO的累积浓度首先随着起始葡萄糖浓度的增加 ( 8.9～ 17.9mmol L)而增加 ,进而又随着葡萄糖浓度的增加 (17.9～ 49.6mmol L)而下降 ,表明存在一最适浓度 ,在此浓度下重组CHO细胞的EPO表达最大。     

microRNA-195 在棕榈酸诱导肝细胞L02 葡萄糖摄取障碍中的作用

目的:探究microRNA-195对棕榈酸诱导肝细胞L02葡萄糖摄取障碍中的影响及其作用机制。方法:体外培养人肝细胞L02,用不同浓度棕榈酸(0.6 mmol/L,1 mmol/L)诱导人肝细胞L02(10 h),显微镜观察其形态学变化。应用葡萄糖氧化酶法检测细胞培养液中剩余的葡萄糖含量,Real Time-PCR检测棕榈酸诱导肝细胞L02葡萄糖摄取障碍后microRNA-195(miR-195)表达变化,Real Time-PCR检测转染miR-195 mimics及miR-195 inhibitor后miR-195的表达水平,激光共聚焦检测转染效率,miR-195过表达或低表达后葡萄糖摄取的变化。结果:高浓度棕榈酸可诱导肝细胞L02葡萄糖摄取障碍,培养液上清糖浓度升高约2.5 mmol/L,miR-195表达量明显升高;转染miR-195 mimic后miR-195表达升高约200倍,转染miR-195 inhibitor后miR-195表达降低约40倍;过表达miR-195后细胞培养液上清中葡萄糖量升高2.5 mmol/L,即葡萄糖摄取降低;低表达miR-195后上清液中葡萄糖量降低约1 mmol/L,即葡萄糖摄取作用加强。结论:miR-195有可能参与调控肝细胞L02葡萄糖摄取障碍。     

食品上的应用

900831 碳源的类型和浓度对黑曲霉生产柠檬酸的影响研究了碳源及其浓度对黑曲霉(Aspergillus niger)B60生产柠檬酸的影响。麦芽糖、蔗塘、葡萄糖、甘露糖和果糖给予高的柠檬酸产率。在糖浓度为10％时(葡萄糖例外,为6.5％)产率最高。糖浓低于2.5％时不产生柠檬酸,用1％蔗     

葡萄糖和乙酸钠对湛江等鞭金藻兼养生长的影响

论文探讨了添加外源性有机碳葡萄糖和乙酸钠对湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis )生长及胞内总脂百分含量的影响.结果表明:随着葡萄糖和乙酸钠浓度的增加,湛江等鞕金藻的生长和产物积累均表现出先促进后抑制的现象.湛江等鞭金藻兼养利用葡萄糖和乙酸钠促进生长的浓度上限分别为50和30g·L^-1.葡萄糖浓度仅15g·L^-1时,对生物量具有显著促进作用,而乙酸钠浓度2.5～15g·L^-1时,对生物量均具有显著促进作用.葡萄糖对藻细胞内总脂百分含量的促进作用浓度范围是1.0～50g·L^-1,而乙酸钠仅在1.0～15g·L^-1时,表现出显著促进作用.葡萄糖浓度为15g·L^-1时,其生物量、总脂百分含量分别比对照增加了30%、30%.乙酸钠浓度为7.5g·L^-1时,其生物量、总脂百分含量分别比对照增加了30%、30%.添加适量的葡萄糖和乙酸钠能够显著促进湛江等鞭金藻生物量及胞内总脂百分含量,葡萄糖和乙酸钠的最适浓度分别是15g·L^-1和7.5g·L^-1.湛江等鞭金藻利用葡萄糖和乙酸钠进行兼养生长的能力是有限的.     

辣椒碱对3T3-L1 前脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

目的:探讨辣椒碱对3T3-L1前脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。方法:不同浓度的辣椒碱作用于3T3-L1前脂肪细胞,采用MTT测定细胞活性,GLU Test试剂盒法测定葡萄糖摄取,Western Blot法检测葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1)表达的变化。结果:25μM辣椒碱作用72 h和50μM、100μM辣椒碱作用48 h、72 h,可显著抑制3T3-L1细胞增殖,6.25、12.5、25μM辣椒碱作用可显著促进3T3-L1细胞的葡萄糖摄入,Western Blot结果显示辣椒碱能够显著增加GLUT1蛋白表达量,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论:低剂量辣椒碱具有降糖作用,其作用机制可能与增加GLUT-1蛋白表达有关。     

生淀粉糖化酶催化位点氨基酸及酶合成调控的初步研究

通过对Rhizopus OR-1UVN菌种所产生淀粉糖化酶在不同底物不同缓冲溶液条件下酶最适pH的测定,推测出该生淀粉糖化酶活力中心催化位点氨基酸是天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)。实验证明5～50mg/mL浓度葡萄糖对生淀粉糖化酶没有抑制作用。分别以浓度<5mg/mL葡萄糖和淀粉为碳源的培养基进行不同碳源发酵实验,发现以淀粉为碳源的培养基Ⅰ发酵15h开始产生淀粉糖化酶,以葡萄糖为碳源的培养基Ⅱ发酵35h开始产酶(葡萄糖浓度<8mg/mL),而且前者菌体较后者少,由此可知葡萄糖对产酶有阻遏作用。实验还发现解阻遏熟淀粉糖化酶的葡萄糖浓度(15mg/mL)比生淀粉糖化酶的要高。由于葡萄糖的阻遏作用不发生在翻译水平,而发生在转录水平上,而且生淀粉糖化酶(G1)与熟淀粉糖化酶(G2)来自同一条DNA链,可以推测存在mRNA的拼接。通过以生淀粉为碳源的比较实验,发现生淀粉对生淀粉糖化酶形成的诱导作用可能主要是通过mRNA拼接的调节来实现的。     

VC二步发酵种液质量判定

研究了影响种子质量的各个参数与提高种子质量的途径。结果显示 :在苏云金杆菌 (俗称“大菌”)与氧化葡萄糖酸杆菌 (俗称“小菌”)组成一新组合菌系中 ,种液中菌的浓度对发酵影响较大 ,种液中的 (大菌OD值 - 1 6×小菌OD值 )与发酵速度成正相关 ,可作为种子质量的判定指数。同时对种液的配方进行均匀设计实验 ,结果显示 :适当提高玉米浆、葡萄糖等成分与降低尿素的浓度及调高pH值均有利于种液质量的改善     

用填充床生物反应器连续灌流培养CHO细胞生产HBsAg

为了获得重组CHO细胞持续高效表达HBsAg的最佳条件 ,应用填充床生物反应器和聚酯片 ,连续灌流培养分泌HBsAg的重组CHO细胞 ,考察灌流培养基中葡萄糖浓度对细胞代谢和HBsAg生产的影响。连续培养 60天 ,细胞密度可达 5 0× 1 0 6 ml。灌流培养液中葡萄糖浓度从5 0g L增加到 7 6g L时 ,葡萄糖消耗速率和乳酸浓度均随之上升。当葡萄糖浓度继续增加至9 3g L时 ,葡萄糖消耗速率和乳酸浓度呈下降趋势 ;当将葡萄糖浓度降回至 7 6g L后又开始回升。培养过程中最高抗原滴度达 1∶5 1 2 ,出现在以含 5 0g L葡萄糖的培养液灌流阶段的末期 ,即第 2 6天 ,维持 1 0天左右即迅速下降至 1∶1 2 8水平。共收液 335L ,纯化后获得抗原蛋白2 1 3 0 4mg ,平均产率为 635 94μg L ,较传统转瓶工艺 ( 4 1 4μg L)提高 5 3 6%。表明CHO细胞较长时间处于高乳酸水平下 ( >30mmol L)会严重影响产物的表达 ,应控制灌流培养液中的葡萄糖浓度在较低水平 ,或通过适当提高灌流速率使培养基中乳酸水平维持在较低水平 ,从而有利于HBsAg的高效稳定表达