快速检测伪狂犬病毒荧光定量PCR技术建立及应用

以伪狂犬病毒(PRV)保守的gE基因序列为参考,设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针,结合RotorGene检测系统,建立一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为1.0×102-1.0×107拷贝/μL,灵敏度达102拷贝/μLDNA,比常规PCR高10倍。检测的特异性明显高于常规PCR,同时避免了常规PCR因电泳造成的污染。应用该技术检测66例猪组织或鼻咽拭子样品,阳性42份,阳性检出率为63.6%(42/66)。与病毒分离培养、常规PCR相比较结果显示,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,该方法可用于猪场PRV感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫。     

荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用

荧光定量PCR技术是近些年来发展起来的一种核酸检测技术,它以灵敏度高、特异性强、重复性好、快速准确定量等特点被广泛应用于各个领域。现主要介绍荧光定量PCR技术在病毒、细菌、真菌和寄生虫4个临床微生物检测方面的应用进展。     

建立快速定量检测猪瘟兔化弱毒苗的荧光定量PCR技术

在猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株的5’非编码区设计一对引物和一条荧光探针,利用荧光定量PCR原理,结合LightCycler检测系统,首次建立了定量检测猪瘟兔化弱毒苗方法。结果表明,该方法的灵敏度为10^2拷贝数,线性范围为10^7—10^2,达6个数量级;标准样品的变异系数为2．3％—5．1％(n＝10),疫苗样品组内实验变异系数为0．85％—2．8％(n＝5)、组间实验为2．5％—7．3％(n＝5),对同一样品分5次RNA提取和逆转录,其变异系数为5．0％;对9份疫苗样品进行了检测,与免体定型热反应方法相比较,有很好的相关性;整个检测过程仅需4h。该法可望取代传统的兔体定型热反应用于疫苗生产过程中的效价测定及指导疫苗的配制,也为猪瘟病毒分子生物学研究提供了一种新的、简捷有效的工具。     

建立快速定量检测猪瘟兔化弱毒苗的荧光定量PCR技术

在猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株的5'非编码区设计一对引物和一条荧光探针,利用荧光定量PCR原理,结合LightCycler检测系统,首次建立了定量检测猪瘟兔化弱毒苗方法.结果表明,该方法的灵敏度为102拷贝数,线性范围为107-102,达6个数量级;标准样品的变异系数为2.3%-5.1%(n=10),疫苗样品组内实验变异系数为0.85%-2.8%(n=5)、组间实验为2.5%-7.3%(n=5),对同一样品分5次RNA提取和逆转录,其变异系数为5.0%;对9份疫苗样品进行了检测,与兔体定型热反应方法相比较,有很好的相关性;整个检测过程仅需4h.该法可望取代传统的兔体定型热反应用于疫苗生产过程中的效价测定及指导疫苗的配制,也为猪瘟病毒分子生物学研究提供了一种新的、简捷有效的工具.     

PCR快速检测伪狂犬病病毒野毒感染

根据已发表的伪狂犬病病毒(PrV)gE、gI基因的序列,设计并合成了一对引物,以PrV容A株细胞培养毒为模板,筛选最佳反应条件和试剂工作浓度,建立了区分PrV野毒株和疫苗弱毒的鉴别PCR方法。该方法能从PrV容A株(RA)、上海株(SH)、鲁A株(LA)中扩增出一条848bp的片段,但Bartha-K61株没有扩增出该片段。测序结果表明PCR扩增产物和方法的特异性。对正常细胞与其它6种引起猪病毒性疫病相关病毒进行检测,结果均为阴性,没有出现交叉反应。对PrV容A株细胞毒提取物DNA进行检测,其最低检出量为5pg。PCR对感染野毒的发病猪不同组织器官检测发现,淋巴结检出率最高,依次为脾、脑(海马角)、肺、肾、肝等。对2003～2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的37个大中型猪场送检的172份病料进行PCR检测病料阳性率为20．34％(35／172),猪场阳性率为40.54％(15／37)。实验结果表明所建立的PCR技术可用于伪狂犬病野毒感染的快速鉴定和流行病学调查。     

鸭冠状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种鸭冠状病毒（Duck coronaviruses,DuCoV）的临床快速诊断方法,根据鸭冠状病毒1b基因保守区域设计特异性引物,成功建立了用于检测鸭冠状病毒的特异性SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法特异性强、敏感性高、重复性好,对鸭冠状病毒有特异性扩增,最低检测限为8.04×100拷贝/μL,比普通PCR方法敏感10倍,批内变异系数与批间变异系数分别为0.28%～0.34%、0.25%～0.36%,均小于1%。对临床可疑鸭泄殖腔拭子进行检测,本方法与常规PCR方法的检测结果阳性符合率为100%,阴性符合率为96.43%,样本总符合率为97.62%。本研究建立的鸭冠状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于鸭冠状病毒的临床快速诊断及流行病学监测。     

木糖葡萄球菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

目的 本研究拟建立一种灵敏快速的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)方法,用于检测大、小鼠木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus,S.xylosus)。方法 本研究选择特异性gehM基因片段作为靶标合成了一套引物,建立了木糖葡萄球菌检测的qPCR方法。对木糖葡萄球菌标准菌株和其他非目标菌进行特异性分析。将木糖葡萄球菌的DNA进行10倍稀释测定其灵敏度。用送检的样本进行了临床应用并测序验证,同时与培养法进行比较。结果 仅木糖葡萄球菌出现特异性扩增曲线,而其他非目标菌未出现,表明设计的引物对木糖葡萄球菌具有特异性,灵敏度为100 fg/μL,组内和组间重复性均小于3%。共检测60份临床样品,有5份样品扩增曲线为典型的S曲线,将该qPCR产物克隆测序并进行同源性比对,该序列与木糖葡萄球菌的同源性为99.63%,表明该样本木糖葡萄球菌核酸阳性,所检测样本阳性率为8.3%,而培养法的阳性率为6.7%,qPCR方法阳性检出率比培养法略高。结论 建立的木糖葡萄球菌qPCR方法,具有快速、灵敏度高、特异性强和重复性好的优点,可用于实...     

荧光定量PCR检测土拨鼠肝炎病毒核酸方法的建立

目的建立土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus,WHV）核酸的荧光定量PCR（Real-time PCR）检测方法,应用于土拨鼠肝炎病毒模型的研究。方法分别根据土拨鼠肝炎病毒核心抗原（WHcAg）和表面抗原（WHsAg）的DNA序列设计13对扩增引物,从中筛选无非特异性扩增及引物二聚体且灵敏度高的引物,用于土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测。建立感染土拨鼠肝炎病毒的土拨鼠血清中WHV核酸的Real-timePCR检测方法。结果根据WHsAg基因的5＇端设计的一对引物WHVSF1与WHVSR1,检测灵敏度可达1×101拷贝/μL,病毒拷贝数与Real-time PCR Ct值的标准曲线的R2值为0.997,且电泳未见明显非特异性条带及引物二聚体。结论建立了土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测方法,该方法为进一步研究土拨鼠肝炎病毒模型奠定了基础。     

复合探针荧光定量PCR方法的建立

为了对特定基因进行实时检测,根据荧光能量转移(FRET)原理,设计及合成了一种新的FRET复合探针,该探针由一条长的荧光杂交探针和短的淬灭探针构成,其中荧光探针5′端接一荧光素分子,3′端接一延伸阻断分子磷酸,淬灭探针3′端连接一个淬灭分子对甲基红,淬灭探针与荧光探针5′端互补,无模板时,该探针杂交形成复合探针。无荧光产生,当有模板时,荧光探针与模板杂交,荧光不能被淬灭,产生的荧光与模板量成正比。根据复合探针的反应原理,研究了该探针的FRET性质及影响因素包括淬灭探针及扩增片段长度、荧光探针与淬灭探针的合适比例及镁离子浓度。实验结果显示淬灭探针及扩增片段长度对复合探针的作用有明显的影响,本实验采用淬灭探针长21个核苷酸,扩增片段长127bp,荧光探针与淬灭探针的合适比例为1：1,镁离子浓度为3mmo1／L,可获得最佳的反应体系;该复合探针合成简单,淬灭彻底,具有良好的准确性与特异性,敏感性达10^2拷贝,并具有较宽的动力学定量范围,可对10^2—10^9拷贝范围内的待检样品进行准确的定量。复合探针技术可应用于病毒感染水平、转基因拷贝数及单核苷酸多态性等检测。     

荧光定量PCR技术及其在科研中的应用

荧光定量PCR技术是一种新型的核酸定量技术,与常规的PCR相比,荧光定量PCR具有检测灵敏,精确,特异性强,无污染,快速等特点.目前该技术已广泛应用于不同研究的多个领域.主要从荧光定量PCR的基本原理,主要类型和检测应用进行了综述.     

鉴别伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒荧光定量PCR方法的建立

根据猪伪狂犬病病毒(PRV) gH、gE基因的序列, 设计了两对引物及其对应的TaqMan探针, 通过对引物、探针、Mg2+的浓度和样品DNA提取方法等进行优化, 建立了鉴别PRV野毒与疫苗毒感染的荧光定量PCR方法。该方法线性范围为101~108拷贝/mL, 达8个数量级, 灵敏度可达101拷贝/mL, 比常规PCR高100倍。用此方法对60份疑似组织样品进行检测, 并与血清中和试验、常规PCR相比较, 结果显示该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能对样品进行定量检测等优点, 并且该法以闭管的模式操作, 减少了后续步骤污染的可能性, 整个PCR检测过程不到2 h。此方法的建立, 为猪伪狂犬病病毒的早期鉴别诊断和定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础。     

PCR快速检测伪狂犬病病毒野毒感染

根据已发表的伪狂犬病病毒(PrV)gE、gI基因的序列,设计并合成了一对引物,以PrV容A株细胞培养毒为模板,筛选最佳反应条件和试剂工作浓度,建立了区分PrV野毒株和疫苗弱毒的鉴别PCR方法.该方法能从PrV容A株(RA)、上海株(SH)、鲁A株(LA)中扩增出一条848bp的片段,但Bartha-K61株没有扩增出该片段.测序结果表明PCR扩增产物和方法的特异性.对正常细胞与其它6种引起猪病毒性疫病相关病毒进行检测,结果均为阴性,没有出现交叉反应.对PrV容A株细胞毒提取物DNA进行检测,其最低检出量为5pg.PCR对感染野毒的发病猪不同组织器官检测发现,淋巴结检出率最高,依次为脾、脑(海马角)、肺、肾、肝等.对2003～2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的37个大中型猪场送检的172份病料进行PCR检测病料阳性率为20.34%(35/172),猪场阳性率为40.54%(15/37).实验结果表明所建立的PCR技术可用于伪狂犬病野毒感染的快速鉴定和流行病学调查.     

检测PCV2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法

本文建立了一种同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、细小病毒（PPV）、及伪狂犬病毒（PRV）疫苗株与野毒株的多重PCR方法.根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp（PCV2）、581bp（PPV）、372bP（PRV gB）及147bp（PRV gE）四条特异性片段.对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出10pg PCV2、PPV和PRV gB、gE检测敏感度分别为10^-6.2、10^-3.8、10^-5.8TCID50的模板.该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测具有重要意义.     

Host Interferon-Stimulated Gene 20 Inhibits Pseudorabies Virus Proliferation

Virologica Sinica - Host interferon-stimulated gene 20 (ISG20) exerts antiviral effects on viruses by degrading viral RNA or by enhancing IFN signaling. Here, we examined the role of ISG20 during...     

伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区的原核表达及其在疫苗接种和自然感染鉴别诊断中的应用

根据伪狂犬病病毒（PRV）Min-A株gE基因序列,利用PCR方法扩增了PRV-gE基因不含信号肽、胞内区和跨膜区的主要抗原表位区,并克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,获得的重组质粒命名为pGEX-tgE。经SDSPAGE电泳分析证实克隆的部分gE基因获得了表达,融合表达产物大小约为63kD,并在终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导下,3.5h其表达量达到高峰。通过改变诱导条件,有效抑制了包涵体形成,提高了重组蛋白的溶解性。Western blot分析证实表达的重组gE蛋白具有抗原反应活性。将表达产物利用亲和层析法纯化后作为ELISA抗原,通过对其特异性、敏感性及工作条件的优化试验,和对48份PRV阴性血清样品的检测结果的统计学分析,建立了猪伪狂犬病tgE-ELISA鉴别诊断方法。通过对400份送检血清样品的检测结果分析,表明其与PRV全病毒ELISA试验的符合率高达95%以上,与基于抗gE蛋白单抗竞争性ELISA的符合率达94%。此方法可用于gE基因缺失PRV疫苗免疫动物和PRV自然感染动物的鉴别诊断。     

Genome Characteristics and Evolution of Pseudorabies Virus Strains in Eastern China from 2017 to 2019

Since late 2011, outbreaks of pseudorabies virus(PRV) have occurred in southern China causing major economic losses to the pig industry. We previously reported that variant PRV forms and recombination in China could be the source of continued epidemics. Here, we analyzed samples from intensive pig farms in eastern China between 2017 and 2019, and sequenced the main glycoproteins(gB, gC, gD, and gE) to study the evolution characteristics of PRV. Based on the g C gene, we found that PRV variants belong to clade 2 and detected a founder effect during by the PRV epidemic. In addition,we detected inter-and intra-clade recombination; in particular, inter-clade recombination in the g B genes of strains FJ-ZXF and FJ-W2, which were recombinant with clade 1 strains. We also found specific amino-acid changes and positively selected sites, possibly associated with functional changes. This analysis of the emergence of PRV in China illustrates the need for continuous monitoring and the development of vaccines against specific variants of PRV.     

PCR检测伪狂犬病病毒DNA

 根据伪狂犬病病毒 (PRV)gB基因的序列 ,设计并合成了一对引物 ,以闽A株细胞培养毒为模板 ,筛选最佳反应条件 ,建立了检测PRV的PCR方法 应用该方法对Fb、Bartha、BJ、GD、V2F4、S、S3、SR、Buk、Shope、Norden、MinkⅢ、HB、F8、F9、F12等毒株的细胞培养液进行基因扩增 ,均获得了分子量为 2 81bp的特异性目的DNA片段 ,而对Vero细胞与FMDV、SVDV、HCV、PRRSV、JEV、PPV等病毒进行检测 ,结果均为阴性 ,没有出现交叉反应 对PRV毒株扩增的产物测序 ,结果序列与文献报道一致 ,证明PCR扩增产物和方法的特异性 对 1994～ 2 0 0 0年期间送检的临床样品和保存的PRV毒种 ,用病毒分离、双抗体夹心ELISA和PCR等 3种方法进行检测 ,结果前 2种方法检测为阳性的 ,PCR检测均为阳性 ;PCR检测为阴性 ,前 2种方法检测也为阴性 ;可是 ,前 2种方法检测为阴性的 ,PCR却检测出部分阳性 ;经x2 检验 ,证明PCR检出率明显高于前 2种方法的检出率 对PRV闽A株细胞毒提取物DNA进行检测 ,其最低检出量为 15 8pg 对 1999～ 2 0 0 0年期间广东、福建、海南等省的 31个大中型猪场送检的 191份病料进行检测 .结果病料阳性率为 2 6 2 % ( 50 191) ,猪场阳性率为 71% ( 2 2 31) 实验结果表明 ,所建立的PCR技术可用于伪狂犬病的快速诊断