鸡新城疫病毒RT-TaqMan-LAMP检测方法的建立及应用

【背景】新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)的传染可能会引发作为二类传染病之一的新城疫(Newcastledisease,ND),给养禽业带来巨大的经济损失,因而早期、精准的NDV筛查是防治ND暴发的关键。【目的】针对新城疫病毒(NDV)建立结合TaqMan探针的反转录环介导等温扩增技术(RT-TaqMan-LAMP)快速检测方法。【方法】根据NDV F基因序列设计特异性引物组和TaqMan探针,以重组质粒pMD-NDV-F为阳性标准品优化反应条件,验证该方法的特异性、灵敏性和重复性,同时与国家标准(GB/T16550—2020)中推荐的RT-qPCR方法比较,对70份实际样本进行验证。【结果】最佳反应条件为61℃60 min。引物和探针最优浓度：1.6μmol/L (FIP/BIP)、0.2μmol/L (F3/B3)、0.8μmol/L (LF/LB)、0.2μmol/L (GTP)。最低检测限为1.651×102 copies/μL,灵敏性是LAMP方法的100倍。无非特异性扩增,与禽流感病毒(avian influenza virus, AIV...     

LAMP技术快速诊断布鲁氏菌病的研究

旨在应用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)对布鲁氏菌进行研究。针对布鲁氏菌保守基因16S r DNA设计LAMP引物,通过浊度法对LAMP反应条件进行优化,应用建立好的LAMP反应条件进行特异性及灵敏性试验。结果显示:(1)优化后的反应条件是62℃恒温60 min,内引物1.50μmol/μL、外引物0.20μmol/μL、环引物1.0μmol/μL。(2)该LAMP方法与3株布鲁氏菌均发生了扩增反应,达到阳性浊度值,而与小肠耶尔森(ATCC9510)、大肠杆菌(ATCC25922)、沙门氏菌(ATCC10708)和金黄色葡萄球菌(ACTT33591)等标准菌株没有扩增反应。(3)浊度法和实时荧光法两种方法的检测最低限分别为4.36 fg/μL和436 fg/μL,其灵敏度均高于普通PCR的最低检出值4.36 pg/μL。LAMP检测技术用于布病临床诊断具有快速、高效、便捷等特点,对于基层布病的病原学诊断具有实用价值。     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的研究

应用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立一种准确、灵敏、快速的蜜蜂微孢子虫检测方法。本研究根据东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的依赖DNA的RNA聚合酶Ⅱ大亚基(RPB1)序列,用在线软件Primer Explorer V4.0 online设计4条特异性引物,分别对Mg2+、d NTP、内引物FIP/BIP和甜菜碱浓度及反应温度和时间优化;选择蜜蜂体内常见病原进行该方法的特异性验证,用MseⅠ酶切扩增产物验证其准确性;将N.ceranae的DNA梯度稀释进行灵敏度检测并与PCR比较分析;最后在临床检测中验证该技术的可行性。结果表明,优化的体系可在恒温57℃下完成扩增反应;引物的病原特异性检测仅N.ceranae有梯状条带,MseⅠ酶切产物条带符合理论值;LAMP反应检测的灵敏度较PCR高10倍;能够直接从蜜蜂体内检测出N.ceranae。本研究建立的LAMP检测N.ceranae体系准确、快速、成本低,可为蜜蜂微孢子虫病的检测提供有力的技术支撑。     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测志贺氏菌

【目的】将环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)联合应用,建立一种可应用于志贺氏菌快速检测的LAMP-LFD技术。【方法】以福氏志贺氏菌的侵袭性质粒抗原H(ipa H)基因为检测靶标设计3对特异性引物(其中上游内引物Sfl-ipa H-FIP由生物素标记),进行LAMP反应;同时设计1条异硫氰酸荧光素(FITC)标记的探针Sfl-ipa H-HP,与获得的LAMP产物进行特异性杂交,杂交产物经LFD完成检测。【结果】优化后的LAMP反应条件为63°C 40 min,加上LFD结果判读共需50 min。LAMP-LFD方法能够特异性检测出福氏志贺氏菌,而对肠炎沙门氏菌等其它4种导致腹泻的致病菌和创伤弧菌等5种常见食物源性致病菌,以及4株不同大肠杆菌的检测结果呈阴性。该方法针对福氏志贺氏菌的检测灵敏度为1.0×10~2 CFU/m L或4 CFU/反应,针对人工污染鲤鱼肠组织的检测灵敏度是5.0×10~2 CFU/m L,是以LAMP外引物Sfl-ipa H-F3/Sfl-ipa H-B3的常规PCR方法的100倍。【结论】建立的LAMP-LFD技术具有操作简单、检测快速准确、检测成本低等优点,有望在志贺氏菌的常规监测和即时检测中被普及使用。     

新疆外来入侵杂草豚草属LAMP快速检测技术的建立

【目的】开发外来入侵生物三裂叶豚草和豚草不同生育期、不同部位的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术,以达到田间快速、准确和高效识别的目的。【方法】以SYBR Green Ⅰ为指示剂,分别针对三裂叶豚草和豚草不同发育阶段(幼苗期、生长期、种子期)开展LAMP技术开发。【结果】特异性验证结果显示,所检测杂草的LAMP产物均呈阳性(产生白色沉淀),而与其对照的其他2种杂草的LAMP产物均为阴性(无白色沉淀)。灵敏度检测结果显示,该体系的DNA最低检测限为10^-10 ng·μL^-1,比常规聚合酶链式反应灵敏度高。【结论】本研究建立的LAMP检测体系能有效应用于三裂叶豚草和豚草样本的快速检测,为其快速、高效识别提供技术支撑。     

基于EB1基因的环介导等温扩增（LAMP）法检测感染家蚕微粒子病的蚕卵

【目的】家蚕 Bombyx mori 微粒子病一直影响着蚕种业的健康发展,快速而准确地检测出寄生于蚕卵中的家蚕微孢子虫 Nosema bombycis 对于有效控制家蚕微粒子病危害意义重大。【方法】环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）法是一种快速、灵敏、特异的DNA体外恒温扩增方法,本文基于LAMP检测法的原理,依据家蚕微孢子虫孢子繁殖复制相关的 EB1 基因（GenBank登录号：KF421134.1）设计LAMP引物,对LAMP反应体系的最佳反应温度、内外引物浓度比、检测反应的特异性、灵敏度等进行研究,建立了一种检测蚕卵感染家蚕微粒子病的LAMP检测方法。【结果】结果表明,基于EB1 基因建立的LAMP检测方法在63℃恒温下在1.5 h内就可完成对样品的有效检测,本LAMP法对家蚕微孢子虫孢子DNA的检测灵敏度为5.0×10^-3 ng/μL,对EB1-pMD^TM19-T质粒标准品的检测灵敏度为1.0×10² copies/μL,同时对人工感染家蚕微粒子病单个母蛾产下蚕卵的1/8卵圈量或1粒蚕卵均能检出阳性结果。上述结果都分别应用凝胶电泳法、恒温荧光检测仪以及SYBR GreenⅠ显色肉眼观察法得到同步判定。【结论】本研究建立的基于EB1基因LAMP法可用于蚕卵微粒子病的检测,LAMP法为蚕种质量检验及成品卵微粒子病现场检疫提供了新技术。     

甜樱桃品种SSR-PCR反应体系的优化

以甜樱桃品种那翁为试材,研究了樱桃SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响,并比较了采用聚丙稀酰胺凝胶及琼脂糖电泳检测扩增产物多态性的差异.结果表明:在PCR反应体系中,DNA最适浓度30～45 ng;Mg2+的最适浓度范围为1.5～3.0 mmol/L;dNTP最适浓度为0.2～0.3 mmol/L;引物的最适浓度为0.3～0.4 μmol/L;Taq聚合酶在20 μl反应体系中宜加入0.5 U.利用此反应体系,对24份樱桃代表资源进行了SSR反应,用6%的非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测,扩增产物在100～250 bp之间,不同品种间DNA谱带多态性丰富.琼脂糖电泳检测的DNA多态性不如聚丙稀酰胺凝胶丰富.     

环介导等温扩增技术在食品中痢疾志贺氏菌快速检测

【目的】探讨、优化基于环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的方法。【方法】在NCBI数据库中搜索获取志贺氏菌的特异性基因高度保守区,设计3对LAMP反应引物,建立、优化该LAMP可视化检测方法,并评价其特异性、灵敏度,同时与PCR检测方法和传统检测方法对比,进行结果统计分析。【结果】5株志贺氏菌标准菌株样品均检测为阳性,11株非志贺氏菌标准菌株样品均检测为阴性,无交叉反应。最低检验限为1.6×101 CFU/反应(或1.6×101 CFU/m L),且经比较,LAMP检测灵敏度比PCR检测高出1个数量级。通过对161份实际样品和人工污染样品进行检测,LAMP检测与传统方法检测结果具有较高的一致性。【结论】LAMP具有检测过程快速简便、检测结果稳定、可靠的特点,适用于对常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的高效、快速检测需求。     

家蚕核型多角体病毒可视化快速核酸检测方法

家蚕核型多角体病在广西多批次的养蚕生产中非常普遍,严重影响蚕农的经济效益。根据家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)广西分离株的多角体蛋白基因(polh)序列设计4条用于环介导核酸等温扩增(LAMP)特异性引物,以感染Bm NPV的5龄家蚕血淋巴的多角体DNA为模板,通过优化LAMP反应体系,确定Mg2+、d NTPs、甜菜碱最适终浓度分别为8 mmol/L、1.4 mmol/L和0.8 mol/L,外引物和内引物浓度为0.2μmol/L和1.6μmol/L,在64℃恒温条件下反应1 h;在反应管中加钙黄绿素,通过肉眼观察颜色变化直接判定结果实现可视化检测。该检测方法的Bm NPV最低模板DNA为25 fg/μL,其敏感度为常规PCR l00倍,兼具简便、快速、灵敏等优点,可用于家蚕核型多角体病的早期诊断及流行病学调查。     

基于EMA-qPCR的茄科青枯菌活体检测技术的建立

【目的】利用特异性核酸染料叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide bromide, EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合, 建立一种能有效区分青枯菌死活细胞的检测方法。【方法】样品DNA制备前经EMA渗透预处理, 再进行实时荧光定量PCR特异扩增菌体DNA。【结果】终浓度为2.0 mg/L的EMA能有效排除1.0×107 CFU/mL灭活青枯菌细胞DNA的扩增, 对活细胞和不可培养状态(Viable but non-culturable, VBNC)活菌的DNA扩增均没有影响。当每个定量PCR反应体系中的活细胞在5.0×100?5.0×104 CFU范围内时, 扩增Ct值与定量PCR反应体系中活细胞CFU对数值呈良好的负相关性(R2=0.992 5)。比较EMA-qPCR法和平板计数法对经过不同温度短期保存的青枯菌检测结果发现, 待检样品可在24 °C与4 °C冷藏条件下短期保存。【结论】本研究建立的EMA-qPCR方法能有效检测青枯菌VBNC细胞和有效区分死活菌, 避免或减少青枯菌PCR检测的假阳性和假阴性。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

青蒿素生物合成机理研究现状

本文总结了目前有关青蒿素生物合成机理方面的研究,主要包括青蒿素生物合成中生理因子的影响,青蒿素生物合成中间体及前体,青蒿素生物合成细胞定位等。指出了存在的一些问题及今后的研究发展前景。     

Time of detection of recessive genes: effects of system of mating and number of examined individuals

Summary Anthers were cultured from two sets of seven lines of hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) with different cytoplasms, the euplasmic nucleus donors, Siete Cerros 66 and Penjamo 62, as well as their six alloplasmic lines derived from wild relative species of the genera Triticum and Aegilops. Significant cytoplasmic and nuclear effects but no cytoplasmic-nuclear interaction were found for embryogenic anther response, with the best performance of Penjamo 62 in Ae. kotschyi cytoplasm. Plant regeneration was not affected significantly by the cytoplasmic background of the lines cultured. The possible genetic implications of the observed cytoplasmic and nuclear influences on the in vitro haploid induction of wheat are discussed.