怀地黄茎尖培养的研究

怀地黄(Rehmannia glutinosa)是常用中药材,属玄参科。在生产上一般采用营养繁殖,存在着严重的品种退化。田波朱本明等曾分别报道在怀地黄中分离到地黄退化病毒和地黄黄斑病毒。病毒感染可能是造成地黄退化的重要原因。茎尖培养是     

怀地黄SRAP扩增体系的建立与引物的筛选

为建立适合怀地黄SRAP-PCR分子标记技术体系,通过单因子实验分别研究了DNA模板浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、引物浓度以及dNTP浓度对怀地黄SRAP扩增反应的影响,确立了适合怀地黄SRAP最佳反应体系为:在25μL的反应体系中,模板DNA量20ng/25μL、2.5mmol/LMg2+、0.32μmol/L的上下游引物、0.30μmol/L的dNTP以及2.5UTaq酶,并利用确定的体系从88个引物组合中筛选出12对适合怀地黄SRAP-PCR反应的引物。     

怀地黄ISSR扩增条件优化的研究

用CTAB法提取怀地黄嫩叶DNA,进行简单重复间序列标记(ISSR)分析.通过单因子实验分别研究了退火温度、Taq酶单位、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响,找出各自的合适条件,而且每一个合适条件确定以后都被作为后续研究的一个条件.通过各个因子的组合研究建立了适宜于怀地黄ISSR分析的扩增体系25 μL PCR反应体积,1×Taq DNA酶缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl,0.1% Trion X-100,pH9.0 ),2.5 mmol/L MgCl2,1.5～1.0 U Taq酶,60 ng模板DNA,0.4 μmmol/L引物,各0.4 mmol/L的dATP、dGTP、dCTP和dTTP.合适的退火温度为53～55℃.为用ISSR技术分析鉴定怀地黄种质资源奠定了良好的基础.     

怀地黄块根的形态发生和结构发育

观察了怀地黄(Rehmannia glutinosa cv．Hueichingensis Hsiao．)块根的形态发生和生长发育过程中的形态结构变化。采用怀地黄的传统栽培方法,即用上一年的块根作母根进行繁殖,分别从母根和不定芽的茎基部发生不定根。怀地黄不定根的初生结构和维管形成层的发生与一般双子叶植物相同,但其次生生长却有两种方式,即正常次生生长和异常次生生长。一类不定根的形成层产生的次生结构与一般双子叶植物相同,即次生木质部中主要是导管,而薄壁细胞较少。这类不定根其次生生长为正常次生生长(normal secondary growth),是担负吸收和固着作用的正常根。另一种类型的不定根,其形成层产生的次生木质部含有大量的薄壁细胞,少量的导管分散在薄壁细胞之间。这种次生生长为异常次生生长(anomalous secondary growth),从而使不定根膨大,形成块根。因此,怀地黄的药用部分在起源和结构上都属于根的性质,其药用部分应称为块根。     

PP333对怀地黄试管苗生长和一些生理指标的影响

针对怀地黄试管苗细弱和移栽成活率较低的问题,本文研究了PP333对其生长发育和一些生理指标的影响.以怀地黄[Rehmannia glutinosa Libosch.f. hueichingensis(Chao et Sbhih)Hsiao]品种"9302"的无菌试管苗为材料,MS为基本培养基并附加不同浓度的PP333(0、0.01、0.05、0.1、2.0 mg·L-1),蔗糖浓度3%,琼脂浓度0.6%,pH5.8～6.2,培养容器为2.5 cm×20 cm的大试管,每个试管装20 mL培养基,加盖封口膜,在1.1kg·cm-2的压力下灭菌20 min.     

怀地黄叶片中总环烯醚萜苷及总苯乙醇苷含量快速分析模型的建立

本文旨在建立地黄叶片中总环烯醚萜苷及苯乙醇苷定量分析模型。利用紫外-可见分光光度法测定不同种质怀地黄生育期内的128份地黄叶片中总环烯醚萜苷及总苯乙醇苷的含量,并将其作为基础值,结合地黄叶片的近红外光谱图,利用TQ8.0分析软件结合偏最小二乘法(PLS),分别建立地黄叶片中总环烯醚萜苷及总苯乙醇苷的定量分析模型。地黄叶片中总苯乙醇苷定量校正模型决定系数(R2)为0.998 2,校正均方根偏差(RMSEC)为0.089 9,预测均方决定差(RMSEP)为0.142,交叉验证均方根偏差(RMSECV)为0.707 2;总环烯醚萜苷定量校正模型的内部交叉验证决定系数(R2)为0.972 1,校正均方差(RMSEC)为0.259,预测均方决定差(RMSEP)为0.095 4,交叉验证均方根偏差(RMSECV)为0.869 4。预测值与实测值差异无统计学意义。该定量模型可用于怀地黄叶片中总环烯醚萜苷及总苯乙醇苷含量的快速测定。     

利用RAPD和ISSR分子标记分析怀地黄种质遗传多样性

用RAPD与ISSR技术对怀地黄的8个品种和2个脱毒品系进行了种质遗传多样性分析。分别从80条RAPD引物和44条ISSR引物中筛选出适合怀地黄种质分析的17条RAPD引物和10条ISSR引物,用于RAPD和ISSR分析。17条RAPD引物共扩增出177条带, 多态性位点数为109; 多态性位点比率为61.58%;平均多样性指数(I)为0.3135;每个位点的有效等位基因数（Ne）是1.3641; 10条ISSR引物共扩增出110条带. 多态性位点数为79; 多态性位点比率为71.58%;平均多样性指数(I)为0.3577;每个位点的有效等位基因数（Ne）是1.4037。 基于扩增条带数据库建立了各自的Jaccard遗传相关系数矩阵,构建了相似的分子树状图,将10个供试材料分为2类:一类群含组培85.5、大田85.5、组培9302、大田9302、金状元和金白6个材料;另一类群含北京1号、大红袍、地黄9104和野生地黄4个材料。两种分子标记的分析结果呈极显著正相关(r＝0.649)。结果表明,RAPD与ISSR标记适合于怀地黄种质遗传多样性分析,ISSR标记技术是一种多态性和重复性优于RAPD技术的实用技术。     

怀地黄块根、茎的组织培养及植株再生

植物名称:怀地黄(Rehmannia glutinosa.f.hueichingensis(Chao et Schih Hsiao),品种为“北京1号”。材料类别:新鲜块根及嫩茎。培养条件:基本培养基为MS。诱导愈伤组织的培养基为MS,附加KT0.5mg/l(单位下同),2.4-D1-2;诱导芽分化的培养基为MS,附加BA3,     

地黄属种间亲缘关系研究

对地黄属6个物种进行了形态解剖学观察、染色体计数、核核糖体内转录间隔区(ITS)序列分析.结果表明,茎的高度、幼叶形态、花萼和花冠形态及颜色、种子千粒重和大小、外种皮网壁厚度、外种皮内侧网纹直径等均是该属内分类的可靠依据.高地黄与裂叶地黄在外部形态及解剖结构的各个方面均极为近似,地黄与茄叶地黄间也存在较大的相似性.茄叶地黄、高地黄、湖北地黄、天目地黄的染色体数目,分别为n=28、14、14、14,确认地黄和茄叶地黄为属内四倍体物种,其余种均为二倍体.ITS测序分析显示,地黄属为单系起源,天目地黄与湖北地黄、高地黄与裂叶地黄、地黄与茄叶地黄构成属内3个分支,与形态学及细胞学研究结果一致.研究认为,天目地黄与湖北地黄有较近的亲缘关系;高地黄和裂叶地黄应为同一物种;地黄与茄叶地黄是属内进化水平最高的类群.     

地黄自毒物质提取及其生物指标测定

连作障碍在药用植物地黄(Rehmannia glutinosa L.)栽培中尤其明显,同一地块上种植一茬地黄后,须经8-10a后方可再种。从怀地黄主产区河南省焦作地区采集种植1a地黄的茬后土壤,采用不同溶剂提取地黄土壤自毒物质并利用生物测试确定抑制率最强的土壤提取液作温室栽培实验以确定对植物生理指标的影响。利用高效液相色谱法(HPLC)对土壤提取液和根系分泌物进行比较,并利用高效液相色谱、傅立叶转换红外光谱(FTIR)和电喷雾离子阱质谱(ESI-MS)技术鉴定地黄连作自毒物质的化学成分。生物测试结果表明水和甲醇提取的地黄茬后土壤自毒物质对地黄生长具有最强的抑制作用;在培养器中加入浓度0.5g/mL的水和甲醇提取液对地黄胚根的抑制率分别达17%和26%,当浓度增至5.0g/mL时,抑制率增加到70%以上。盆栽结果显示甲醇提取的自毒物质导致地黄地上部叶绿素含量减少,根系活力下降,明显抑制了地黄体内超氧化物歧化酶、过氧化物歧化酶、过氧化物酶的活性,加剧了地黄膜质过氧化,以及引起地黄植体内生长素类激素含量下降。高效液相色谱法显示土壤提取液和根系分泌物具有相似图谱。电喷雾离子阱质谱分析共检测到6个特征物质:香草酸、D-甘露醇、二十六烷酸苯羟基乙酯、毛蕊花糖苷、β-谷甾醇和胡萝卜苷。     

地黄连作对叶际细菌群落结构及多样性的影响

地黄为玄参科多年生草本药用植物,以块根入药,是我国著名的大宗药材.但是地黄在农业生产过程中存在严重的连作障碍问题,造成产量和品质急剧下降.细菌作为叶际微生物中最为丰富的一类,对宿主植物的生长发育与健康至关重要.叶际细菌区系研究为探索连作障碍形成机制及其消减措施提供了一个全新视角,同时差异菌群也可作为连作障碍发生的指示菌.本研究采用16S rDNA基因高通量测序结合传统可培养法分析地黄连作下叶际细菌群落结构及多样性变化.结果表明: 地黄连作导致叶际细菌群落结构发生明显变化,重茬地黄和病株地黄的叶际细菌群落结构较为相似,聚为一类,并明显区别于头茬地黄.同时,重茬地黄和病株地黄叶际细菌群落的均匀度指数、Shannon多样性指数、Simpson多样性指数均显著低于头茬地黄.物种注释分析显示,地黄叶际细菌主要由变形菌门(91.2%)、厚壁菌门(5.1%)和放线菌门(3.7%)组成.韦恩图分析发现,连作下地黄叶际细菌种类变化不大,但是结合相对含量来看,地黄连作导致叶际变形菌门含量增加,而厚壁菌门和放线菌门下降.在属水平上,头茬地黄叶际的微小杆菌属、芽孢杆菌属、节细菌属等潜在有益菌相对含量显著高于重茬地黄和病株地黄,而假单胞菌属呈现相反的变化趋势.传统可培养法结合致病性验证发现,在病株地黄叶片上广泛分离到的变形假单胞菌D9对地黄叶片表现出较强的侵染致病性.综上可见,地黄连作下叶际细菌群落结构发生偏移,导致有益菌含量下降而病原菌含量上升,造成连作地黄叶片病症频发,加剧了地黄再植病害的发生.     

发根农杆菌转化怀地黄再生植株

利用发根农杆菌15834菌株感染怀地黄组培苗子叶、叶柄和茎切段,建立了有效的毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的外植体产生,能在无外源激素的1/2MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。用100μmol/L乙酰丁香酮处理对数生长期的农杆菌菌液感染子叶获得了46.7%的最高转化频率;在附加0.2mg/L KT和3.0mg/L 6/BA的1/2 MS培养基上,毛状根能100%形成愈伤组织,51.49%分化出芽;分化芽在1/2 MS培养基上100%生根,形成具有矮化、节间短和根系发达等特征的转化再生植株且移栽后生长旺盛;1个转化毛状根克隆的梓醇含量为0.557mg/g,是鲜地黄梓醇含量的48.5%,是生地鲜重梓醇含量的18%。rolB基因PCR、Southem blot分析、冠瘿碱纸电泳和RT-PCR扩增检测证明农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合到怀地黄基因组中并表达。     

地黄属和崖白菜属等位酶的变异研究

利用超薄平板微型聚丙烯酰胺凝胶的等电聚焦电泳技术,对玄参科Scrophulariaceae地黄属Rehmannia 6种植物和崖白菜属Triaenophora 2种植物共52份材料进行了7个酶系统的等位酶分析。在7个酶系中共检测到18个清晰位点和45个等位基因,多态位点为17个;并将遗传学数据用软件Biosys-1进行分析,结果表明:同种内个体间表现出较大的遗传同质性,而不同种的个体则表现出明显的趋异性。除高地黄R.elata和裂叶地黄R.piasezkii外,其余6种植物之间遗传分化较明显,8个种按聚类结果分为两支,崖白菜属的崖白菜T.rupestris和神农架崖白菜T.shennongjiaensis聚为一支,位于分支树的基部;地黄属的地黄R.glutinosa、茄叶地黄R.solanifolia、天目地黄R.chingii、湖北地黄R.henryi、高地黄和裂叶地黄为另一支。在地黄属中,高地黄和裂叶地黄之间的亲缘关系最近,地黄和裂叶地黄关系最远。本研究结果不支持把高地黄和裂叶地黄作为两个独立的种。地黄属与崖白菜属在遗传上具有较高水平的相似性,它们在生活史和形态学上仍然保留有许多共同的特征,说明它们之间分化的时间可能不长。     

产丁醇芽孢杆菌的分离、筛选与鉴定

通过富集培养和分离纯化等过程,从种植怀地黄的土壤中分离得到一株产丁醇兼性厌氧细菌菌株C2。以7%的玉米醪液为原料总溶剂(丙酮、丁醇、乙醇,ABE)产量可达17.17g/L,其中丁醇11.2g/L,占65.2%;发酵玉米秸秆糖化液(总糖浓度为25g/L)产总溶剂量为3.64g/L,其中丁醇2.63g/L,占72.3%。形态学、生理生化及系统发育研究表明该菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌(Bacillus),与B.vallismortis、B.atrophaeus和B.mojavensis亲缘关系最近。     

5种地黄花部综合特征与繁育系统的初步研究

生殖隔离是物种分化与延续的基础,地黄属植物是否存在生殖隔离仍不清楚。通过实地观测地黄属5个物种(天目地黄、湖北地黄、裂叶地黄、地黄和茄叶地黄)自然种群的花部形态、开花动态、花蜜体积、花蜜的糖浓度及其日变化、杂交指数、花粉-胚珠比等指标,结合人工授粉套袋,对地黄属植物的花部综合特征和繁育系统进行研究。结果显示:(1)地黄属植物的花为两性花,单花花期5～7 d,种群花期40～60 d;5种地黄在花序类型、花形态、花粉量、花粉-胚珠比等方面都存在差异,其中茄叶地黄的花粉完全败育。(2)5种地黄属植物的繁育系统属于异交,部分自交亲和,需要传粉者,不具有无融合生殖特性,地黄与茄叶地黄存在强烈营养繁殖。(3)5种地黄属植物的花朵基部有蜜腺可以产生糖浓度较高的花蜜,这也支持传粉者的存在,但除地黄确定为蜜蜂传粉外,其它地黄植物在野外并未观测到有效的传粉者,可能与地黄的散生特性、生境相互隔离以及传粉观测期气象条件恶劣有关。研究认为,5种地黄属植物较长的花期能有效弥补传粉者访问频率低的不足;除遗传屏障外,推测地黄属5个物种花展示方式的差异可能吸引不同的传粉者,加之地理、生态因素的作用导致了5种地黄属植物繁育系统的分化。     

地黄属的一个新异名

在比较研究标本室标本、野外考察、杂交实验和DNA片段序列分析的基础上,确认高地黄(Rehmannia elataN.E.Brown)与裂叶地黄(R.piasezkii Maxim.)为同种植物,并把前者作为后者的异名处理。     

怀地黄脱毒种苗大田生长性状及产量品质

为研究怀地黄(Rehmannia glutinosa)脱毒种苗大田生长、产量和品质状况,对大田中不同时期脱毒苗和非脱毒苗的形态指标、生理特性、光合特性、产量及品质等进行了测定。结果表明,脱毒苗的株高、冠幅、叶片数、最大叶面积、功能叶片的光合色素含量和净光合速率等各项指标均优于非脱毒苗,块根产量提高、品质改善,增产幅度在77.35%以上,药用成分梓醇含量提高了32.90%。     

不同来源的怀地黄叶外植体在培养中植株再生的差异

植物名称:怀地黄(Rehmannia glutinosaLibosch.f.hueichingensis(Chao et Schih)Hsiao).品种为“金状元”和“151”。材料类别:盆栽及试管苗上完全展开的叶片. 培养条件:盆栽苗的叶片用5％安替福民表面消毒10分钟,然后用无菌水洗涤三次;切成5×5mm~2的切块,试管苗的叶片较小,每叶片沿中脉纵切后,再横切一次成四块.随后将叶外植体移到附加1mg/l BA和不同浓度(0.2和 2mg/l)IAA或NAA的MS培养基上,在室温28℃,光强1000lx     

不同间隔年限地黄土壤的自毒作用和酚酸类物质含量

分别取2、4、6、8年前种植过地黄的土壤进行大田再植生物测试,并采用HPLC检测再植地黄土壤中与化感现象密切相关的5种酚酸（阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草酸、香豆酸和丁香酸）的含量。结果表明：随着土壤间隔年限的增加,大田再植地黄的块根干质量、体积和叶片干质量依次增加,且从地黄苗期就开始表现出这种变化趋势;地黄土壤中5种酚酸的含量也依次降低, 间隔2、4、6、8年的再植地黄土壤中5种一元酚酸总含量分别为1.503、1.323、0.700和0.340 μg·g^-1。间隔2、4、6、8年的再植地黄土壤水提液中阿魏酸、对羟基苯甲酸和香豆酸含量与地黄大田生物测试结果呈显著或极显著负相关。从整体看,地黄生育的前期和中期应当是地黄化感作用的重点时期。     

中华本草——地黄

人们对地黄的认识大多源于风靡大江南北的中成药——六味地黄丸.地黄作为我国民间传统植物药,有着久远的历史记载.其栽培记录亦可追溯到明朝,《神农本草经》中记载:"生咸阳川泽,黄土地者佳,八月采根."地黄是著名的"四大怀药"之一,其药效久负盛名,早在古代就经丝绸之路传到海外,且被当作名贵药材馈赠给欧洲皇室,因此被海外人士誉为...