DNase的DNA-PAGE快速分析法

核酸酶,特别是DNase,往往和机体的生理状况及病变有密切的关系,如果能建立一种简便的核酸酶分析方法,将对临床诊断、探讨病变机制及筛选药物都有一定的价值。关于DNase的分析Boyd等先后建立了DNA-聚丙烯酰胺凝胶电泳(DNA-PAGE)法;Brown等又将它加以简化,并将它直接用于细胞抽提液中DNase的鉴定与比较。本文又作了改进,降低了分离胶中的DNA含量,并以溴化乙锭(Ethidum Bromid),代替焦宁Y(Pyronin Y)。结果表明,改进后保温与染色时间可以大大缩     

参与细胞凋亡的核酸酶

细胞凋亡是机体内一种重要而且保守的细胞去除机制。染色质的降解是凋亡的重要标志之一,它需要核酸酶的参与。到目前为止,参与凋亡的核酸内切酶可以分为三类:DNaseⅠ家族,DNaseⅡ家族,CAD。不同的细胞在凋亡的时候会激活不同的核酸酶,相同的细胞在不同的诱导方式下也会激活不同的核酸酶,因此,凋亡过程中,那些核酸酶的激活是由细胞种类和诱导方式等特异性所决定的。     

脱氧核糖核酸内切酶与细胞凋亡

哺乳动物细胞广泛存在细胞凋亡。脱氧核糖核酸内切酶(DNase)在细胞凋亡中发挥重要作用,染色质DNA降解、浓缩及细胞核结构的破坏都与DNase有关。目前已发现多种DNase参与不同类型细胞的凋亡。本重点对DNaseⅠ、DNaseⅡ、NUC18、NUC70、AN34、DFF(DFF40/DFF45)等内源性DNase与哺乳动物细胞凋亡的关系作系统的归纳和分析。     

检测柯萨奇B病毒RNA的原位RT-PCR技术

建立I检测柯萨奇B病毒（CBV）RNA的原位RT—PCR技术（直接法）,并对CBV（1～6型）感染Hds细胞中的病毒RNA进行检测,同时对照检测了经核酸酶（DNase和RNase）处理后的病毒感染Hthe细胞和非感染的Hds细胞。实验结果表明,经原位RT－PCR扩增后,CBV感染的Hem细胞呈蓝黑着色,阳性信号充满细胞;而非病毒感染的Hem细胞不着色;核酸酶消化实验证实,经RNase作用后CBV感染Hem细胞的原位RT－PCR阳性信号消失,DNase和RN＿共同作用时,阳性信号也消失,但DNase作用个影响阳性信号。说明原位RT～PCR的阳性信号是CBV特异性…     

毛竹笋体生长过程中脱氧核糖核酸酶活性的变化

细胞生长与代谢状况的变化密切有关,在细胞从分生期到成熟期的转变过程中,酶活性首先有很大的变化(Robison等1959)。DNase是参与核酸代谢的重要酶类之一,它在体内能降解DNA,但是它也可以参加 DNA的合成(Lehman 1967)。虽然在微生物和动物组织中已经证明 DNase的活性水平与DNA合成和生长速度之间具有正相关(Eley等1966,Shortman等1964),但是在高等植物中这方面的研究很少。竹笋生长极为迅速,而且在笋体生长过程中还会出现退败现象。关于竹笋生长和退败过程中DNase活性的变化尚无报道。为此,我们对竹笋DNase的活性与生长的关系进行了探讨,为阐明竹笋退败的生理原因和拟定防止措施提供参考。     

辐射增敏剂甲硝唑氨酸对坪期V_(79)细胞DNase活力的影响

研究了辐射增敏剂甲硝唑氨酸(CM)对受照前后坪期V_(79)细胞DNase活力的影响。结果表明CM在一定浓度范围内(1—10mmol/L)对DNase的激活作用有浓度依赖关系。细胞经6—12Gyγ线照后DNase活力亦增高,若照射合并CM处理后,则对DNase激活有相加作用。还就DNase活力升高与DNA链断裂间的可能关系进行了讨论。     

测定脱氧核糖核酸酶的简单方法——荧光法

脱氧核糖核酸酶 (DNase) 是真核与原核细胞中广泛存在的DNA水解酶。1962年Kurnick曾对某些根据底物特性变化来测定DNase活性的方法作了评述。近年来建立了更灵敏的用同位素测定DNase活性的方法。但由于同位素价格高昂,危险,又受本身半衰期和比强度的限制,有时又需自己标记合成底物,所以在应用上有一定的局限性。本文介绍一种简单、灵敏的测定DNase活性的荧光法。其基本原理是根据DNA和溴化乙锭(EB)结合发生荧光,其强度与DNA量成正比。当EB-DNA复合物经DNase处理后,由于DNA被降解、     

正常及白血病小鼠白细胞染色质和DNA的酶切分析

 本文应用的核酸酶为DNaseⅡ、微球菌核酸酶与限制性内切核酸酶BstNI、EcoRⅡ、HpaⅡ和MspⅠ,将它们作用于正常小鼠615和可移植性白血病小鼠L7712脾脏白细胞染包质及其DNA,根据酶切电泳谱及水解动力学分析表明:1.白血病小鼠染色质相对正常小鼠染色质易被DNaseⅡ微球菌核酸酶水解;2.白血病小鼠染色质比正常小鼠者易被MspⅠ水解,但其DNA的MspⅠ酶切电泳谱无明显差别;3.白血病小鼠染色质及其DNA较正常小鼠染色质及其DNA易被EcoRⅡ水解。这些观察说明,白血病小鼠脾脏白细胞染色质有较活跃的构象状态;其染色质DNA的CCATGC区段内有较低的甲基化程度。     

RNA促进小鼠重组染色质白蛋白基因DNaseⅠ消化敏感性

同样的基因在不同的分化细胞中表达不同,基因的选择性表达问题涉及分化和衰老的本质。转录基因对DNaseⅠ(DNA酶Ⅰ)消化敏感,本文研究了RNA对小鼠重组染色质白蛋白基因DNaseⅠ消化敏感性的影响。分离BALB/c小鼠脑细胞核,加入终浓度为2mol/L的NaCl破坏核小体结构,加入不同量、不同来源的RNA,装透析袋,逐渐降低离子强度进行染色质重组。重组染色质中加入DNaseⅠ消化DNA,PCR扩增白蛋白基因的外显子1到外显子2约1200bp区段,PAGE电泳后,用银染色观察不同来源RNA促进DNaseⅠ对白蛋白基因的消化作用。不同组织来源（肝、肺、肾、脑）RNA对小鼠重组染色质中白蛋白基因DNaseⅠ消化敏感性均有促进作用,其中肝和肺RNA促进消化作用较强;酵母tRNA无显著促进消化作用;消化促进作用与RNA剂量有关。RNA能增加DNaseⅠ对白蛋白基因的消化敏感性且有组织（细胞）来源特异性。又委托丹麦Chemical R D 实验室合成2条与白蛋白基因互补的各23核苷酸的RNA,用其进行重组试验。结果表明,重组混合物中含有低至0.2μg/mL的RNA,即可以发挥显著的DNase I消化促进作用。     

柚子(Citrus grandis Osbeck)S-like核酸酶基因CgSL1的分离与特征分析

从柚子(CitrusgrandisOsbeck)2个自交不亲和品种溪蜜柚和度尾蜜柚的花柱中克隆出一个类似S核酸酶基因CgSL1(C.grandisS-likeRNase),它的cDNA序列全长1074bp,编码297个氨基酸。通过与其它植物S-like核酸酶和S核酸酶氨基酸序列进行比较,发现CgSL1类似于S-like核酸酶,与拟南芥中的RNS2一致性为62.5%。对CgSL1的表达分析表明该基因在花柱、花药、叶片不同器官以及花柱的不同发育阶段均有表达,且在花柱中的表达随衰老增强,由此推测它可能与衰老有关。     

巴豆油正丁酸对Raji细胞的联合诱导作用

以4mM正丁酸,400ng/ml巴豆油对Raji细胞进行联合激发,24小时后DNase活性及EA阳性细胞百分率均平行地急剧上升,72小时后达到高峰,以后EA阳性细胞急速下降,而DNase活性仍保持在高峰水平,粗酶液中的DNase活性能被EBV阳性血清中和90％以上。 激发Raji细胞粗酶液DEAE层析谱显示,有三个DNase活性峰,主峰洗脱浓度为220mM磷酸盐。检测了未激发及经激发(48小时)Raji细胞提取液的DNA多聚酶活性,前者能被50mM(NH_4)_2SO_4所抑制,抑制?原酶活性的23.3％,后者能被50mM(NH_4)_2SO_4所激活,激活为原酶活性的147.7％。     

重组旋毛虫plancitoxin-1-like活性位点突变体蛋白的核酸酶活性

旋毛虫plancitoxin-1-like(Ts-Pt)是旋毛虫125种DNaseⅡ家族蛋白中唯一具有典型DNaseⅡ活性区域HKD基序的核酸酶,且普遍认为,组氨酸位点是DNaseⅡ的活性氨基酸位点。为研究Ts-Pt活性位点突变体蛋白的核酸酶活性,利用重叠PCR方法获得Ts-Pt活性位点突变体片段,以p ET-28a(+)为载体构建重组表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达。重组Ts-Pt突变体蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE分析。利用琼脂糖凝胶电泳法和核酸酶酶谱分析重组Ts-Pt突变体蛋白的核酸酶活性。成功构建含Ts-Pt突变体重组质粒的基因工程菌,SDS-PAGE和亲和层析纯化结果显示,重组Ts-Pt突变体蛋白呈包涵体表达。重组蛋白经复性后并没有表现出核酸酶活性,但核酸酶酶谱分析结果显示,包涵体表达的重组Ts-Pt突变体蛋白表现出降解DNA的能力。同时,N端和C端活性位点H及HCK和DHSK突变并不影响Ts-Pt的核酸酶活性,研究结果为进一步研究庞大的DNaseⅡ家族蛋白在旋毛虫发育和感染方面的作用提供一定的参考。     

柚子(Citrus grandis Osbeck)S-like核酸酶基因CgSL1的分离与特征分析

从柚子（Citrus grandis Osbeck)2个自交不亲和品种Guan溪蜜柚和度尾蜜柚的花柱中克隆出一个类似S核酸酶基因CgSL1（C.grandis S-likde RNase),它的cDNA序列全长1074bp,编码297个氨基酸,通过与其它植物S-like核酸酶和S核酸酶氨基酸序列进行比较,发现CgSL1类似于S-like核酸酶,与拟南芥中的RNS2一致性为62．5％。对CgSL1的表达分析表明该基因在花柱,花药,叶片不同器官以及花柱的不同发育阶段均有表达,且在花柱中的表达随衰老增强,由此推测它可能与衰老有关。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏、激活细胞模型建立

【目的】建立单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)潜伏感染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y及激活的细胞模型。【方法】分别加入20,40,60,80,100,120,140μmol/L的阿昔洛韦(ACV),观察对SH-SY5Y细胞生物性状的影响;在ACV存在的情况下,分别将含有0.1、1、10、100MOI的病毒液接种SH-SY5Y细胞,运用相差显微镜观察病毒对细胞的影响,确定潜伏的建立;分别用41℃、42℃、43℃、44℃、45℃加热0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h,观察加热时间及温度诱导HSV-2在SH-SY5Y细胞中激发的最适条件;加入25、50、75、100、125μmol/L福斯高林(Forskolin)诱导病毒在细胞中激活,探讨诱导的最佳浓度;对HSV-2在SH-SY5Y细胞中的潜伏及激发进行验证并测序;运用相差显微镜观察病毒激活后细胞形态的变化。【结果】60μmol/LACV的存在最适合HSV-2在SH-SY5Y细胞中建立潜伏状态;1-10MOI的感染量均能取得较好的病毒潜伏及激发效果;通过观察,病毒在SH-SY5Y细胞中最长可潜伏14d;43℃,1.5h及75μmol/LForskolin均为诱导病毒潜伏激发的最佳条件;相差显微镜观察病毒激发后细胞病变,从24h到72h,细胞变性、坏死的程度、数量随感染时间延长而增加;HSV-2LAT、gG基因PCR扩增及电泳结果,证实病毒在细胞中的潜伏及激活。【结论】初步在人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y上建立了HSV-2潜伏感染及激活的细胞模型,为下一步研究HSV-2的潜伏与激发机理,了解HSV-2的致病机制打下基础。     

人工锌指核酸酶突变EGFP基因的功能分析

锌指核酸酶技术在基因定点修饰中具有效率高和特异性好等特点,并成功应用于数十种生物。目前,该技术是否能应用羊上尚未报道。为了敲除转基因山羊标记基因 (EGFP),构建了一对针对EGFP外显子上的锌指核酸酶表达载体,将其电转染至转EGFP基因胎儿成纤维细胞中,研究了锌指核酸酶突变EGFP基因的效率和方式,利用基因显微注射单细胞获得获得的转基因 (EGFP) 细胞系作为锌指核酸酶的靶细胞。结果显示,通过锌指核酸酶的突变作用,转染后的细胞发绿色荧光比例下降,测序结果显示在EGFP外显子中插入1个碱基G,导致编码EGFP基因的阅读框改变,从而起到基因突变的作用。结果表明,文中构建的锌指核酸酶对EGFP基因有突变作用,可以为以后获得无标记基因供核细胞进行体细胞核移植生产克隆羊奠定基础。     

DNA与蛋白质的相互作用及其生物学研究方法

DNA和蛋白质是构成生物体最为重要的两类生物大分子,两者特异性或非特异性识别及相互作用在整个基因组表达调控过程中发挥着重要的作用,是了解生命活动基本过程的分子基础。为此,从DNA与蛋白质相互作用的概述及其作用形式入手,对目前应用较多的几种分子生物学检测方法,如电泳迁移率变动分析(EMSA)、DNase I足迹法(DNase I footprinting)、酵母单杂交技术(Y1H)以及染色质免疫沉淀技术(Ch IP)的原理、优缺点、优化方法及其最新应用等进行了综述。     

小麦原生质体高效转化体系的建立

植物原生质体广泛应用于植物基因功能研究中,包括瞬时基因表达、亚细胞定位、蛋白互作和蛋白活性分析等。当前,小麦基因的亚细胞定位和功能分析,大多利用模式植物拟南芥等异源的原生质体,易于造成研究结果的不准确。为避免这种情况,小麦原生质体制备及高效转化体系的建立与应用是必需的。在PEG介导的小麦原生质体转化过程中,原生质体分泌的核酸酶大量降解质粒DNA,转化效率的提高因此受到阻碍。为了建立小麦原生质体的高效转化体系,本文测试了抑制胞外核酸酶活性的因素和提高质粒DNA浓度等多个条件对转化效率的影响。结果表明,转化过程中加入双倍用量的质粒DNA进行转化,且始终保持低温环境(1℃)用以抑制核酸酶酶活性,可以使小麦原生质体的转化效率提高至85%。本文还将该系统成功地应用于2个小麦抗病相关蛋白的亚细胞定位研究,证明了该系统的高效性和实用性。该研究对未来相关研究有一定参考价值。     

原虫凋亡中相关酶类研究进展

近年鉴定到Metacaspase、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、核酸酶(Endo G、Tatd、Fen-1)等分子参与了原虫的凋亡,但不清楚这些分子在凋亡信号途径中的位置及相互关系。实验结果显示,Metacaspase可能具有调节原虫凋亡与细胞周期等功能,但是Metacaspase与Caspase的活化方式及作用底物不同,提示原虫存在与多细胞动物不同的凋亡途径;在疟原虫及利什曼原虫中发现其线粒体及溶酶体参与了其凋亡,提示原虫可能具有类似哺乳动物的溶酶体-线粒体凋亡途径;在利什曼原虫和锥虫中发现存在通过核酸酶而不依赖Caspase的凋亡途径。阐明原虫的凋亡机制有助于通过设计新药物诱导原虫凋亡来达到治疗疾病的目的。