副猪嗜血杆菌外膜囊泡激活caspase-11和NLRP3炎性体诱导炎性细胞因子IL-1β和IL-18分泌

【背景】副猪嗜血杆菌可引起多种炎性反应和较高死亡率,其致炎机制目前尚不清楚。【目的】探究副猪嗜血杆菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)诱导RAW264.7细胞caspase-11及NLRP3炎性体活化的功能,以及caspase-11在OMVs活化炎性体诱导炎性因子表达过程中的关键作用。【方法】副猪嗜血杆菌OMVs感染RAW264.7细胞,收集6、12和24h细胞,RT-PCR检测caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表达;收集感染后48 h细胞,Western blotting检测caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达。收集感染后6、12、24、48和72h细胞上清,ELISA检测interleukin(IL)-1β和IL-18表达水平;不同浓度OMVs(0、2.5、10、25、50和100μg/mL)感染RAW264.7细胞24h,ELISA检测上清中IL-1β和IL-18水平。构建caspase-11沉默RAW264.7细胞株,收集OMVs感染后12、24和48h细胞培养上清检测IL-1β和IL-18水平。【结果】Caspase-11 mRNA转录水平在OMVs感染6、12和24h均极显著高于对照组(P<0.01);NLRP3 mRNA转录水平在感染后6、24h极显著高于对照组(P<0.01);ASC mRNA转录水平在感染后12、24h显著低于对照组(P<0.05);caspase-1 mRNA转录水平在感染后6、12和24h显著高于对照组(P<0.05)。Western blotting结果显示,与空白对照组相比,OMVs组caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达均明显升高。OMVs感染RAW264.7细胞后12、24、48和72h,IL-1β表达量极显著高于对照组(P<0.01),而且呈现时间依赖性升高,IL-18表达水平在感染后6、12、24、48和72h显著高于对照组(P<0.05);不同浓度OMVs感染细胞时,OMVs对细胞的致炎作用呈现剂量依赖性增强。Caspase-11沉默后,IL-1β水平在感染后12、24和48h显著低于未沉默组;Caspase-11沉默组IL-18表达量在感染后24、48h均显著低于未沉默组(P<0.05)。【结论】副猪嗜血杆菌OMVs在副猪嗜血杆菌诱导的炎症反应中发挥重要作用,OMVs可诱导RAW264.7细胞caspase-11介导的非经典NLRP3炎性体信号通路活化。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP0抑制I型干扰素信号通路的激活

[目的]研究口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白VP0对I型干扰素信号通路的影响。[方法]通过反转录PCR构建VP0真核表达载体,利用Western blotting验证VP0蛋白转染HEK-293T细胞后的表达情况;Real-time PCR检测VP0蛋白对FMDV在BHK细胞上复制的影响,检测VP0蛋白对SeV诱导的干扰素信号通路分子RIG-I、IRF3、IFN-β及下游刺激基因ISG15、ISG20表达的影响;双荧光素酶报告基因检测系统检测VP0蛋白对SeV诱导的IFN-β和NF-κB启动子激活以及对RIG-I样受体（RIG-I-like receptors,RLRs）信号通路分子激活IFN启动子的影响;免疫共沉淀检测VP0蛋白与RLRs信号通路中关键分子的相互作用。[结果]成功构建了pCAGGs-VP0真核表达载体,可以在HEK-293T细胞中表达;FMDV感染后的4-6 h,VP0蛋白显著促进FMDV在BHK细胞上的复制（P<0.01或P<0.05）;VP0蛋白明显抑制干扰素下游刺激基因的表达（P<0.01或P<0.05）。在双荧光素酶报告基因检测实验中,VP0蛋白抑制SeV诱导IFN-β和NF-κB的活化具有剂量依赖性（P<0.01）,并对RIG-I、MDA5、VISA、TBK1和IRF3介导的IFN-β产生具有抑制作用,但是对IRF7没有明显的影响。免疫共沉淀显示VP0蛋白可与IRF3发生相互作用。[结论]证实VP0蛋白可以通过与IRF3相互作用来抑制I型干扰素信号通路的激活。     

B3型柯萨奇病毒感染的胰岛β细胞中microRNAs表达的变化及生物学意义

B3型柯萨奇病毒（Coxsackie virus B3,CVB3）感染与1型糖尿病发病及胰岛β细胞损伤有关,但机制并不清楚。病毒性心肌炎的研究证实CVB3通过调控微小RNA(microRNAs,miRNAs)的表达引起心肌细胞损伤。本研究的目的是观察CVB3感染的胰岛β细胞中miRNAs表达的变化及生物学意义,进而初步探究CVB3感染引起胰岛β细胞损伤的分子机制。本研究培养了人胰岛β细胞株,感染CVB3后采用miRNAs芯片及荧光定量PCR检测miRNAs表达的变化;转染miR-阴性对照（NC）或miR-146a-5p后感染CVB3,检测细胞活力、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）及白介素-1β（IL-1β）的含量、IRAK-1及TRAF-6的表达水平;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-146a-5p靶向IRAK-1及TRAF-6。结果显示：CVB3组中miR-101a-3p、miR-140-5p、miR-146a-5p、miR-146b-5p、miR-340-5p的表达水平均低于对照组且miR-146a-5p表达降低最显著;miR-NC...     

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨miR-613对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移与侵袭的影响

摘要 目的：研究基于Wnt/β-catenin信号通路探讨微小RNA（miR）-613对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移与侵袭的影响。方法：体外培养宫颈癌SiHa细胞和正常宫颈上皮细胞H8,检测细胞中miR-613表达。根据转染miR-613 mimic浓度不同,将SiHa细胞分为0 μmol/L组,100 μmol/L和200 μmol/L组。MTT法检测细胞增殖情况,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。蛋白免疫印迹法检测miR-613表达对Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、Vimentin、E-cadherin和MMP9表达的影响。结果：宫颈癌SiHa细胞中miR-613表达水平均显著低于正常宫颈上皮细胞H8,差异有统计学意义(P<0.05)。转染miR-613 mimic后,100 μmol/L、200 μmol/L 组SiHa细胞中miR-613表达水平显著上调,并且具有浓度依赖性(P<0.05)。与0 μmol/L组相比,100 μmol/L、200 μmol/L组的SiHa细胞增殖,迁移,侵袭能力均明显下降,并且具有浓度依赖性(P<0.05)。免疫印迹结果,与0 μmol/L组相比,100 μmol/L、200 μmol/L各浓度组的SiHa细胞Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、Vimentin和MMP9表达显著下调,E-cadherin表达显著上调,并且具有浓度依赖性(P<0.05)。结论：miR-613能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制人宫颈癌细胞系SiHa细胞的增殖,迁移和侵袭。     

miR-20a靶向CCND1作用PI3K/AKT信号通路抑制皮肤鳞状细胞癌的发展

摘要 目的：探究miR-20a与CCND1蛋白在皮肤鳞状细胞癌（CSCC）中的作用关系,以及其可能涉及的信号通路分子机制。方法：分别收集皮肤鳞状细胞癌患者的皮肤癌组织及其邻近正常皮肤组织,采用qRT-PCR分析组织中miR-20a和CCND1基因表达水平。为探究miR-20a对CSCC细胞的影响,将SCL-1细胞分为对照组（不转染）、miR-NC组（转染miR-NC）和miR-20a mimics组（转染miR-20a mimics）;为探究CCND1与PI3K/AKT信号通路的关系,将SCL-1细胞分为对照组（不转染）、si-NC组（转染si-NC）和si-CCND1组（转染si-CCND1）;为探究miR-20a与CCND1间的作用关系及对CSCC细胞的影响,将SCL-1细胞分为miR-NC组（转染miR-NC）、miR-20a mimics组（转染miR-20a mimics）、mimics+pcDNA组（共转染miR-20a mimics和pcDNA）和mimics+CCND1组（共转染miR-20a mimics和pcDNA-CCND1）。采用Western blot分析p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K和GSK-3β蛋白表达水平;采用MTT检测细胞增殖情况;采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用Transwell分析细胞迁移和侵袭情况;采用双荧光素酶报告基因检测分析miR-20a与CCND1的靶向关系。结果：CSCC癌组织和SCL-1中miR-20a均低表达,CCND1高表达。与对照组和miR-NC组比较,miR-20a mimics组SCL-1细胞增殖水平以及侵袭和迁移数量均降低（P<0.05）,SCL-1细胞凋亡水平升高（P<0.05）,PI3K和AKT蛋白磷酸化水平降低（P<0.05）。TargetScanHuman数据库分析和双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-20a与CCND1存在靶向作用关系。与对照组和si-NC组比较,si-CCND1组SCL-1细胞中CCND1和GSK-3β蛋白表达水平以及PI3K和AKT蛋白磷酸化水平均降低（P<0.01）。与miR-20a mimics组或mimics+pcDNA组比较,mimics+CCND1组SCL-1细胞增殖水平以及侵袭和迁移数量均升高（P<0.05）,SCL-1细胞凋亡水平降低（P<0.05）,PI3K和AKT蛋白磷酸化水平均升高（P<0.05）。结论：过表达miR-20a可能通过靶向抑制CCND1的表达而抑制PI3K/AKT信号通路的激活,从而抑制CSCC细胞的增殖、侵袭和迁移,并促进癌细胞凋亡。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1在谷氨酸棒状杆菌中的表达及优化

【背景】口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的感染牛、羊和猪等偶蹄动物的主要疫病之一。口蹄疫病毒的结构蛋白VP1包含多个能够引起机体免疫反应的主要位点,因此VP1是研究亚单位疫苗的方向靶标。谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)作为安全生产菌株,是医药用蛋白生产的优势细胞工厂。【目的】利用C. glutamicum作为受体菌株表达外源蛋白的优势实现VP1的外源表达。【方法】根据VP1结构蛋白的基因序列、相应功能和C. glutamicum的密码子偏好性设计并合成VP1基因,与pXMJ19载体连接构成重组质粒pXMJ19-VP1。C. glutamicum CGMCC 1.15647菌株用于表达VP1-6×his蛋白,并对蛋白表达元件启动子、5′非翻译端(5′UTR)、目的蛋白自身N端等进行优化,同时对培养条件等进一步优化,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测VP1蛋白的表达情况。最后应用间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定本研究中生产的VP1的免疫活性。【结果】SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明VP1蛋白能在C. glutamicum CGMCC 1.15647菌株成功表达,将P_tac启动子替换为合成型启动子P_H36能提高蛋白产量。在此基础上,通过插入不同的5′UTR序列和VP1蛋白N端氨基酸的改变能进一步提高蛋白产量并可利用CspB信号肽实现分泌表达。发酵试验表明,VP1摇瓶发酵培养最优条件为30 ℃、24 h。ELISA试验表明,本研究中的VP1可与阳性血清特异性结合。【结论】本研究在谷氨酸棒状杆菌中成功表达FMDV的VP1蛋白,并通过优化蛋白表达元件的方法进一步提高了产量,为开发新型FMD免疫诊断试剂和安全高效的亚单位疫苗奠定了良好的基础。     

细胞自噬促进柯萨奇病毒B3复制的研究

本研究探索柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)感染引起的自噬与病毒复制之间的关系。CVB3感染HeLa细胞,并在病毒感染后6 h、8 h和10 h时检测LC3-Ⅰ蛋白、LC3-Ⅱ蛋白和p62蛋白的表达水平。结果显示CVB3病毒感染促使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,同时降低p62蛋白的表达。分别将自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamy-cin)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA)或溶酶体抑制剂阿洛司他丁(Aloxistatin,E46D)预处理HeLa细胞2 h,CVB3感染药物处理细胞并在病毒感染6 h后收集细胞、检测CVB3病毒VP1蛋白的表达。结果显示雷帕霉素和E64D促使CVB3病毒VP1蛋白表达增加,而3MA降低CVB3病毒VP1蛋白的表达。本研究得出结论 CVB3病毒感染诱导自噬进而促进病毒复制。     

Sfrp2通过下调Wnt/β-catenin通路抑制胶质瘤细胞系U251的迁移能力

摘要 目的：探讨使用Wnt3a蛋白受体竞争性抑制剂Sfrp2下调Wnt通路的关键蛋白β-catenin的表达对胶质瘤细胞U251线粒体功能以及细胞侵袭能力的影响。方法：使用外源性Sfrp2蛋白处理U251细胞,使用Western Blot技术,Mitotracker线粒体形态学染色,划痕实验观测Sfrp2蛋白对U251细胞Wnt通路的表达,线粒体功能以及细胞迁移能力的影响,并使用GSK-3β抑制剂LiCl上调Wnt通路进一步明确Sfrp2蛋白的作用机制。结果：Sfrp2蛋白可引起Wnt通路的抑制（P<0.05）,线粒体分裂（P<0.01）以及细胞迁移能力的下降（P<0.01）,而使用LiCl处理后,Wnt通路重现上调（P<0.05）,线粒体分裂受到抑制（P<0.05）,细胞的迁移能力也再次恢复（P<0.05）。结论：Sfrp2可通过下调Wnt通路引起线粒体分裂进而抑制U251细胞的迁移能力。     

miR-659-3p靶向CTNNBIP1调控甲状腺癌细胞凋亡的机制

[目的]探讨miR-659-3p在甲状腺癌细胞中的潜在功能和机制。[方法]纳入甲状腺乳头癌患者60例,比较甲状腺患者癌旁组织和癌组织中miR-659-3p的表达水平。过表达或敲低miR-659-3p后检测甲状腺癌细胞TPC-1的增殖水平和凋亡水平,并进行底物鉴定。[结果] miR-659-3p的表达水平在60个甲状腺癌组织中也显著上调(P<0.05)。miR-659-3p敲低后TPC-1的增殖水平显著下降(P<0.05)、 TPC-1的凋亡水平显著上升(P<0.05)。敲低CTNNBIP1时,TPC-1的凋亡水平下降(P<0.05)、 TPC-1的细胞活力水平上升(P<0.05)。过表达miR-659-3p时,CTNNBIP1的蛋白水平和mRNA水平显著下降(P<0.05);敲低miR-659-3p时,CTNNBIP1的蛋白水平和mRNA水平显著上升(P<0.05)。过表达miR-659-3p后,Wnt/β-catenin通路的关键蛋白β-catenin的核定位增多;敲低miR-659-3p后,β-catenin的核定位减少。[结论] miR-...     

微小RNA-451a对胰腺癌BxPc3细胞增殖、侵袭及迁移的影响

摘要 目的：研究微小RNA（miR）-451a对胰腺癌BxPc3细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法：体外培养BxPc3细胞,将不同浓度（50、100 和 200 μmol/L）miR-451a模拟物（mimic）转染至胰腺癌细胞株BxPc3中,利用荧光定量聚合酶链式反应（ PCR）法检测miR-451a的表达,MTT增殖实验检测不同浓度miR-451a对细胞增殖的影响,细胞划痕实验检测不同浓度miR-451a对细胞迁移能力的影响,Transwell实验检测不同浓度miR-451a对细胞侵袭能力的影响。Western blot法检测不同浓度 miR-451a转染后BxPc3细胞p-PI3K、p-AKT、TGF-β和p-smad2/3 蛋白的表达情况。结果：转染不同浓度miR-451a mimic后,胰腺癌BxPc3细胞内miR-451a的相对表达量明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。过表达miR-451a后,BxPc3细胞的增殖能力明显减弱,细胞迁移能力明显减弱,细胞侵袭能力明显减弱,差异均有统计学意义（P<0.05）。相比于0 μmol/L 组,转染50、200 μmol/L miR-451a后BxPc3 细胞p-PI3K、p-AKT、TGF-β和p-smad2/3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,并且p-PI3K、p-AKT、TGF-β和p-smad2/3蛋白表达水平变化具有浓度依耐性。结论：miR-451a能抑制胰腺癌BxPc3细胞株的增殖、迁移、侵袭能力。     

食管癌组织中β-catenin、E-cadherin及MMP-9的表达及其临床意义

摘要 目的：探讨食管癌组织中β-链蛋白（β-catenin）、E钙黏素（E-cadherin）及金属基质蛋白酶-9（MMP-9）的表达及其临床意义。方法：应用免疫组织化学染色法对60例食管癌患者癌组织和癌旁组织中β-catenin、E-cadherin及MMP-9蛋白表达进行检测,分析其表达与临床病理特征的关系。所有患者随访24个月,观察不同β-catenin、E-cadherin及MMP-9蛋白表达患者的生存情况,并分析食管癌患者癌组织中β-catenin、E-cadherin及MMP-9蛋白表达的相关性。结果：食管患者癌组织中β-catenin及MMP-9蛋白阳性率高于癌旁组织,E-cadherin蛋白阳性率低于癌旁组织（P<0.05）。中低分化、TNM分期为III+IV期、有淋巴结转移者β-catenin及MMP-9蛋白阳性率高于高分化、TNM分期为I+II期、无淋巴结转移者,E-cadherin蛋白阳性率低于高分化、TNM分期为I+II期、无淋巴结转移者（P<0.05）。经Log_rank检验发现,癌组织中β-catenin（-）、E-cadherin（+）、MMP-9（-）患者生存率高于β-catenin（+）、E-cadherin（-）、MMP-9（+）患者（P<0.05）。Spearman相关分析显示,食管癌患者癌组织中β-catenin蛋白表达与E-cadherin蛋白表达呈负相关,与MMP-9蛋白表达呈正相关（P<0.05）,MMP-9蛋白表达与E-cadherin蛋白表达呈负相关（P<0.05）。结论：食管癌患者存在β-catenin、MMP-9异常高表达,E-cadherin异常低表达,其表达与食管癌的分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关,检测β-catenin、MMP-9、E-cadherin的表达情况有助于预测食管癌患者生存预后。     

姜黄素通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨折愈合

摘要 目的：探讨姜黄素治疗骨折的潜在应用价值及其对Wnt/β-catenin信号通路的可能影响。方法：本研究建立了胫骨骨折SD大鼠模型（模型组）,然后应用不同剂量的姜黄素（50、100和200 mg/kg/d）治疗胫骨骨折大鼠4周。治疗4周后,通过苏木精和伊红（HE）染色评价骨折区域的形态,通过ELISA法测定大鼠血清中TGF-β、BMP-2、OC和CTX-I水平。应用不同浓度的姜黄素（0、5、10、20、和50 μM）或Wnt/β-catenin信号通路抑制剂ICG-001（10 μM）处理成骨细胞3 d,然后检测细胞的ALP活性、PCNA和COL-1的含量及Wnt /β-catenin信号通路相关分子的表达水平。结果：不同剂量的姜黄素处理组大鼠的小梁状骨和胶原明显增多。与模型组相比,不同剂量的姜黄素处理组大鼠血清中的TGF-β、BMP-2和OC水平均升高,而CTX-I水平降低（P<0.05）;与模型组相比,不同剂量的姜黄素处理组大鼠骨折区域中的COL-1阳性率升高（P<0.05）,而COL-2水平未发生显著变化（P>0.05）。在药物干预3 d后,10和20 μM的姜黄素促进了细胞增殖,而100和200 μM的姜黄素抑制了细胞增殖（P<0.05）。与0 μM组比较,10 μM和20 μM的姜黄素组成骨细胞上清液中PCNA和COL-1水平及ALP活性水平均显著升高（P<0.05）。与模型组相比,不同剂量的姜黄素处理组大鼠骨折区域中的Wnt-3a和β-catenin mRNA和蛋白表达水平升高,而GSK-3β降低（P<0.05）。与姜黄素组相比,ICG-001处理后成骨细胞活力、ALP活性和β-catenin的表达水平均显著下降（P<0.05）。结论：姜黄素通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨折愈合并刺激成骨细胞的增殖和分化。     

柯萨奇病毒B组3型VP1基因的体外表达鉴定

将克隆的CVB3 VP1基因亚克隆至真核表达载体pCEP4构建CVB3 VP1的真核表达质粒pCEP4-CVB3VP1.pCEP4-CVB3VP1转染HeLa细胞,蛋白印迹试验证明该表达体系可以在体外表达能为CVB3中和抗体识别的VP1蛋白.本研究为CVB基因疫苗的研究提供了实验依据.     

miR-455-5p靶向SOCS3抑制RSV感染致气道上皮炎症反应的机制研究

摘要 目的：揭示miR-455-5p对呼吸道合胞病毒（RSV）感染致气道上皮细胞炎症反应的作用机制。方法：qRT-PCR检测30例健康体检儿童（健康组）、RSV感染轻症组（n=41）和重症组（n=31）患儿血清miR-455-5p水平。将16HBE细胞分为Control组、NC-agomir组、miR-455-5p-agomir组、NC-antagomir组、miR-455-5p-antagomir组。使用Lipofectamine 3000转染16HBE细胞后培养48 h后,分为Blank组、NC组（转染了NC-agomir的细胞）、RSV+NC-agomir组、RSV+miR-455-5p-agomir组,用RSV病毒液感染RSV+NC-agomir组和RSV+miR-455-5p-agomir组16HBE细胞,Blank组和NC组16HBE细胞正常培养。用CCK-8法和EdU法检测细胞增殖、TUNEL法检测细胞凋亡、ELISA法检测上清液中TNF-α、IL-6、IL-8水平,qRT-PCR检测miR-455-5p和SOCS3的mRNA水平,Western blot检测SOCS3、IFN-α、STAT1、STAT2、p-STAT1和p-STAT2的蛋白水平。结果：与健康组相比,轻症组和重症组患儿的血清miR-455-5p水平降低（P<0.05）。与轻症组相比,重症组的血清miR-455-5p水平降低（P<0.05）。与Control组和NC-agomir组相比,miR-455-5p-agomir组16HBE细胞的miR-455-5p水平、相对细胞活力和EdU阳性率升高（P<0.05）,TUNEL阳性率降低（P<0.05）,上清液中的TNF-α、IL-6和IL-8水平降低（P<0.05）,SOCS3 mRNA和蛋白水平降低（P<0.05）,IFN-α蛋白、STAT1和STAT2磷酸化水平升高（P<0.05）。与Control组和NC-antagomir组相比,miR-455-5p-antagomir组16HBE细胞的miR-455-5p水平、相对细胞活力和EdU阳性率降低（P<0.05）,TUNEL阳性率升高（P<0.05）,上清液中的TNF-α、IL-6和IL-8水平升高（P<0.05）,SOCS3 mRNA和蛋白水平升高（P<0.05）,IFN-α蛋白、STAT1和STAT2磷酸化水平降低（P<0.05）。与Blank组和NC组相比,RSV+NC-agomir组16HBE细胞的miR-455-5p水平、相对细胞活力和EdU阳性率降低（P<0.05）,TUNEL阳性率升高（P<0.05）,上清液中的TNF-α、IL-6和IL-8水平升高（P<0.05）,SOCS3 mRNA和蛋白水平升高（P<0.05）,IFN-α蛋白、STAT1和STAT2磷酸化水平降低（P<0.05）。与RSV+NC-agomir组相比,RSV+miR-455-5p-agomir组的miR-455-5p水平、相对细胞活力和EdU阳性率升高（P<0.05）,TUNEL阳性率降低（P<0.05）,上清液中的TNF-α、IL-6和IL-8水平降低（P<0.05）,SOCS3 mRNA和蛋白水平降低（P<0.05）,IFN-α蛋白、STAT1和STAT2磷酸化水平升高（P<0.05）。结论：miR-455-5p在RSV感染患儿血清中下调,上调miR-455-5p通过抑制SOCS3的转录和表达从而激活RSV感染的16HBE细胞中IFN-α介导的抗病毒反应。     

miR-23b-3p通过靶向PDE4B基因调控山羊肌内前体脂肪细胞的分化

本研究旨在明确miR-23b-3p对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响，并确定这种作用是通过靶向基因PDE4B来实现的。基于实验室前期转录组测序结果，以筛选得到的山羊肌内脂肪细胞分化前后差异表达的miR-23b-3p为切入点，利用实时荧光定量PCR (real-time quantitative-polymerase chain reaction, qPCR)技术检测miR-23b-3p在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式，从形态学水平和分子水平确定miR-23b-3p对脂肪分化及脂肪分化标志基因的影响；利用生物信息学预测以及双荧光素酶报告基因试验确定miR-23b-3p的下游靶基因，明确miR-23b-3p与预测靶标基因的靶向关系。结果表明，过表达miR-23b-3p后山羊肌内脂肪细胞脂滴积聚减少，成脂标志基因AP2、C/EBPα、FASN、LPL表达水平极显著下调(P＜0.01)，C/EBPβ、DGAT2、GLUT4和PPARγ的表达水平显著下调(P＜0.05)。干扰miR-23b-3p表达后，山羊肌内脂肪细胞中脂滴积聚增多，ACC、ATGL、AP2、DGAT2、GLUT4、FASN和SREBP1表达水平极显著上调(P＜0.01)，C/EBPβ、LPL和PPARγ的表达水平显著上调(P＜0.05)。通过生物信息学分析预测，PDE4B可能为miR-23b-3p的靶标基因，且过表达miR-23b-3p后极显著降低PDE4B的mRNA表达水平(P＜0.01)，干扰miR-23b-3p后PDE4B的mRNA水平得到了显著提升(P＜0.05)。双荧光素酶报告基因试验结果表明，miR-23b-3p与PDE4B基因存在靶向关系。miR-23b-3p通过靶向PDE4B基因调控山羊肌内前体脂肪细胞的分化。     

B3型柯萨奇病毒上调NF-κB引起胰岛β细胞凋亡的作用及机制研究

B3型柯萨奇病毒（Coxsackie virus B3,CVB3）与1型糖尿病发病、胰岛功能破坏有关,但CVB3对胰岛β细胞凋亡的影响及机制尚不清楚。本研究的目的是观察CVB3上调NF-κB p-p65引起胰岛β细胞凋亡的作用及机制,进而初步探究CVB3感染引起胰岛β细胞损伤的分子机制。本研究培养了人胰岛β细胞株,分为对照组、CVB3组、阴性对照（NC）质粒组、NF-κB p65质粒组、si-NC组、si-NC+CVB3组、si-NF-κB p65+CVB3组,检测细胞活力A490水平、细胞凋亡率及细胞中cleaved caspase-3、NF-κB p-p65、IκB α的表达水平。结果显示与对照组比较,CVB3组的A490水平及细胞中IκB α的表达水平降低,细胞凋亡率及细胞中cleaved caspase-3、NF-κB p-p65的表达水平增加（P<0.05）;与NC质粒组比较,NF-κB p65质粒组的A490水平降低,细胞凋亡率及细胞中cleaved caspase-3、NF-κB p-p65的表达水平增加（P<0.05）;与si-NC+CVB3组比较,si-N...     

miR-134-5p靶向抑制PAK3表达增强多发性骨髓瘤细胞的化疗敏感性的研究

摘要 目的：研究miR-134-5p对多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）化疗敏感性的影响及其可能的作用机制。方法：CCK-8法测定人多发性骨髓瘤细胞KM3及其耐硼替佐米（bortezomib, BTZ）细胞株KM3/BTZ对BTZ的化疗敏感性,RT-PCR法检测KM3和KM3/BTZ细胞株中miR-134-5p和p21活化激酶3（p21 activated kinase 3, PAK3）mRNA的表达,生物信息学软件分析miR-134-5p的靶基因,荧光素酶报告实验进行验证,CCK-8法检测分别抑制miR-134-5p和PAK3后KM3/BTZ的化疗敏感性,Western-blot法检测抑制miR-134-5p后KM3/BTZ细胞株中PAK3蛋白的表达。结果：KM3/BTZ细胞株对BTZ的化疗敏感性显著低于KM3细胞株（P＜0.05）。MiR-134-5p在KM3细胞株的表达显著高于KM3/BTZ细胞株,而PAK3 mRNA在KM3细胞株的表达显著低于KM3/BTZ细胞株（P＜0.05）。PAK3为miR-134-5p的靶基因。MiR-134-5p inhibitor组和PAK3 siRNA组KM3/BTZ细胞株的化疗敏感性显著低于对照组（P＜0.05）。MiR-134-5p inhibitor组PAK3蛋白的相对表达显著高于对照组（P＜0.05）。结论：MiR-134-5p可提高KM3/BTZ细胞株的化疗敏感性,其机制可能与抑制PAK3的表达有关。     

富血小板纤维蛋白对人牙周膜细胞成骨能力、炎症因子表达和 Wnt/β-catenin信号通路的影响

摘要 目的：探究富血小板纤维蛋白（PRF）对人牙周膜细胞（hPDLCs）成骨能力、炎症因子表达和 Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路的影响。方法：通过刮取法、组织块法获取 2019年 1月至 2020年 1月期间我院口腔科收治的 10例正畸患者拔除健康阻生牙或正畸牙的牙周组织作为研究样本。将 hPDLCs细胞分为干预 1组、干预 2组、对照组、肿瘤细胞坏死因子 -α（TNF-α）组,各组均采用含有 10% FBSDMEM培养基培养,TNF-α 组加用 10 ng/mL TNF-α 诱导液,干预 1组加用 50% PRF培养,干预 2组加用 10 ng/mL TNF-α 诱导液和 50% PRF。对比各组的细胞增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性、炎症因子、Wnt/β-catenin信号通路关键因子的表达差异。结果：（1）相比于其他 3组,干预 1组的吸光度值（OD）明显升高,相比于 TNF-α 组,干预 2组、对照组的 OD值均明显升高（P<0.05）;（2）和其他 3组相比,干预 1组的 ALP活性明显升高,相比于 TNF-α 组,干预 2组、对照组的 ALP活性均明显升高（P<0.05）;（3）和其他 3组相比,干预 1组的骨形态发生蛋白 2（BMP2）mRNA、runt相关转录因子 2（Runx2）mRNA、BMP2及 Runx2蛋白表达水平均明显升高,相比于 TNF-α 组,干预 2组、对照组的 BMP2 mRNA、Runx2 mRNA、BMP2及 Runx2蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）;（4）相比于干预 1组、对照组,干预 2组、TNF-α 组的 TNF-α mRNA表达水平明显升高（P<0.05）;（5）和其他 3组相比,干预 1组的细胞周期蛋白 D1（CyclinD1）mRNA、β-catenin mRNA表达水平明显升高,相比于 TNF-α 组,干预 2组、对照组的 CyclinD1 mRNA、β-catenin mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）。结论：PRF可以促进 hPDLCs细胞增殖和成骨,并减少炎症因子表达,提升 ALP活性,其可能是通过激活 Wnt/β-catenin信号通路促进 CyclinD1、β-catenin mRNA表达加快hPDLCs细胞成骨。     

乳糖作为诱导剂对人β-防御素3蛋白表达的影响*

对人β-防御素3基因工程菌株BL21-pET-hBD3的乳糖诱导条件进行了研究。乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示,高浓度乳糖对菌株生长有抑制作用(P<0.01),对目的蛋白的表达无显著影响(P>0.05),延长诱导时间对菌株生长有利(P<0.01),但对蛋白的表达无显著影响(P>0.05)。以0.5%乳糖在37℃诱导4h对目的蛋白的表达有利,目的蛋白的含量可达28.1%。控制好诱导条件,乳糖与IPTG的     

单功能烷化剂MNNG对人胃粘膜上皮GES-1细胞的损伤及其对Wnt/β-catenin信号通路的影响

本文旨在从Wnt/β-catenin信号通路的角度探讨单功能烷化剂MNNG诱导人胃粘膜上皮GES-1细胞损伤的机制。用MNNG(2×10-5 mol/L)处理GES-1细胞24 h,处理后第3天用倒置显微镜对GES-1细胞形态进行观察,用MTT法检测GES-1细胞活力,用流式细胞术检测GES-1细胞凋亡和周期变化,用q PCR检测GES-1细胞中β-catenin、GSK-3β、c-Met和MMP7m RNA表达情况,用Western blot检测β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β和c-Met蛋白表达情况。结果显示:MNNG能够明显损伤GES-1细胞,细胞形态变为不规则的长梭形;MNNG能够诱导GES-1细胞凋亡,明显阻滞细胞周期进程;MNNG能够上调β-catenin、GSK-3β、c-Met和MMP7 m RNA表达水平,并上调β-catenin、GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表达水平。上述结果提示,MNNG对GES-1细胞的损伤可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活相关,这为胃粘膜损伤的细胞模型研究提供了参考。