黑鲷精子的超低温冻存及DNA损伤的SCGE检测

以0.5 mL的麦细管为冻存管和DMSO为抗冻剂进行超低温冷冻黑鲷精子,对冻精核DNA的损伤情况进行单细胞凝胶电泳（SCGE）检测,其结果表明,以Cortland溶液为稀释液,5%、10%、15%及20%DMSO为抗冻剂的超低温冻存的黑鲷精子活力、受精率与鲜精无显著差异。其中以10%DMSO为抗冻剂的冻存效果最佳,冻精的激活率、运动时间、寿命及受精率分别达（92.91±1.25）%、（39.90±2.70）min、（53.82±2.84）min及（89.35±1.99）%;而以25%及30%DMSO为抗冻剂时,冻精活力及受精率显著下降。SCGE检测结果显示,DMSO浓度为5%、10%、15%及20%时,黑鲷冻精与鲜精的彗星率及损伤系数差异不显著;DMSO浓度为25%及30%时,冻精与鲜精的彗星率及损伤系数差异显著;冻精的彗星率与抗冻剂DMSO浓度成正相关。黑鲷鲜精及冻精核的DNA损伤主要为轻度和中度损伤,重度损伤比例较低,完全损伤仅存在于25%及30%DMSO为抗冻剂的冻精中,且比例低。分析认为,较高浓度的DMSO是引起冻精核DNA损伤的主要原因。     

鮸鱼精子的生理特性及超低温冻存

通过测定精子的激活率、运动时间及寿命,研究了鮸鱼精子的生理特性,以0.5mL麦细管为冻存管、两步降温法超低温冻存鮸鱼精子。结果表明,鮸鱼精子激活与运动的适宜盐度为20~30、适宜pH值为5.5~9.0,适宜的KCl、NaCl、CaCl2溶液浓度分别为（500~600）mmol/L、（400~500）mmol/L、（300~400）mmol/L,适宜的葡萄糖溶液浓度为（800~900）mmol/L。无Ca2＋、Mg2＋及HCO3-的人工海水均能使鮸鱼精子激活,但运动时间及寿命有所下降。以Cortland溶液为稀释液,10%Gly、15%Gly、5%DMSO、10%DMSO、15%DMSO、10%EG、10%PG、15%PG及20%PG为抗冻剂,超低温冻存鮸鱼精子15d后,冻精的活力与鲜精相比无显著差异,其中,以10%Gly为抗冻剂冻存精子的效果最好,冻精的激活率、运动时间及寿命分别达（86.38±1.63）%、（8.24±1.37）min及（10.21±0.42）min。     

乙二醇降低超低温冷冻黄姑鱼精子的DNA损伤

为了解乙二醇(EG)为抗冻剂超低温冻存黄姑鱼(Nibea albiflora)精子的活力及DNA损伤情况,本研究以Hank′s盐溶液(HBSS)为稀释液,5%~30%乙二醇(EG)为抗冻剂,0.5 ml麦细管为冻存管,两步降温法超低温冷冻保存黄姑鱼精子,用显微观察法测定精子活力,用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)检测精子的DNA损伤,用SPSS 11.5处理实验数据。黄姑鱼鲜精的激活率为85.67%±2.09%、运动时间为(318.67±6.11)s、寿命为(405.67±7.77)s。5%、10%、15%乙二醇(EG)组冻精的运动时间及寿命与鲜精相比差异不显著,其中10%乙二醇(EG)组冻精的激活率为84.67%±1.15%、运动时间为(319.00±12.12)s、寿命为(400.67±4.73)s;20%、25%、30%乙二醇(EG)组冻精的运动时间及寿命与鲜精相比差异显著。5%、10%、15%、20%乙二醇(EG)组冻精核DNA损伤状况与鲜精无显著差异,25%、30%乙二醇(EG)组冻精核DNA损伤状况与鲜精差异显著,且冻精核DNA的损伤程度与乙二醇(EG)浓度成正相关。分析认为,5%~15%乙二醇(EG)适宜作为黄姑鱼精子超低温冷冻保存用抗冻剂。     

红藻糖苷对超低温冻存微藻的保护作用

为研究红藻糖苷对超低温冻存微藻细胞的保护作用,研究将3种不同的微藻置于含10% DMSO和不同浓度红藻糖苷的冻存液中,冻存并解冻后,以流式细胞仪检测细胞存活率,测定复养后藻株的生长曲线及相关生理参数。结果显示,由于冷冻损伤,冻存后各种藻细胞的生长速率、细胞密度及生理指标都显著性下降,而红藻糖苷协同DMSO能够显著增加细胞的存活率,尤其15%红藻糖苷能将紫球藻存活率提升20%（P0.05）;生长曲线得到明显改善;且对PSII最大光能转化效率也有显著性提高（P0.05）。总体结果来看,红藻糖苷对超低温冻存微藻,特别是紫球藻具有明显的保护作用,且效果强于蔗糖。     

斑马鱼精子冻存与复苏实验方法与流程

斑马鱼是研究胚胎发育及其遗传机制的重要模式脊椎动物。目前人们已经积累了大量的突变体和转基因鱼系, 如何安全、妥善地长期保存这些品系是每一个研究斑马鱼的实验室都会面临的问题。精子冻存与复苏技术是目前最为简单有效的一种长期保存斑马鱼遗传品系的方法。应用这一技术不仅可以节省大量的鱼房空间与人力、物力, 使鱼系的使用与保存更加灵活和持久, 更重要的是能够防止珍贵鱼系的意外丢失, 为鱼系保种提供额外的保障。这类方法一般是通过体外挤出精子或研磨精巢获取新鲜的精子, 用适量的冻存液混匀后, 分装保存在液氮罐中。需要时可以随时通过体外授精的方法使精子复苏。经过30年的发展, 随着冷冻保护剂的不断改良和冻存与复苏条件的不断优化, 斑马鱼精子冻存与复苏技术已逐渐成熟。文章简单回顾了斑马鱼精子冻存与复苏技术的历史与发展, 并重点介绍本实验室自2005年以来常规使用的斑马鱼精子冻存与复苏的方法及具体流程。
补充资料 ：冻存与复苏实验指南 [视频]     

精子DNA损伤检测技术的研究进展

精子DNA完整性与男性生育力之间的关系是近些年来生殖医学研究领域的热点之一,精子DNA损伤已成为反映男性生育力的一个新指标。精子DNA的损伤原因有很多,有时可能是多种因素共同作用的结果。生殖系统疾病、环境污染、吸烟、微量元素及各种理化因素等原因都可能导致精子DNA完整性受损。常见的精子DNA完整性检测技术有原位末端标记法、精子染色体扩散实验、精子染色质结构分析试验、单细胞凝胶电泳、荧光原位杂交技术和8-羟基脱氧鸟苷测定法等。随着检验技术的不断发展,关于精子DNA损伤的检测技术也在不断更新改进。本文主要就近十年来精子DNA损伤机制、检测技术的相关研究进展作一综述,提示现有的精子DNA完整性检测技术尚不能满足临床和科研需要,急需找到一种理想的检测方法为男性不育的诊断和治疗提供重要依据。     

环境因子及超低温冻存对黄姑鱼精子活力的影响

通过测定精子的激活率、运动时间及寿命研究了环境因子变化对黄姑鱼精子活力的影响及超低温冻存后黄姑鱼精子的活力。结果表明,黄姑鱼精子激活与运动的适宜盐度为25～35、适宜pH为7.5～8.5。在pH 8.0～8.5、盐度25条件下,精子激活率达(85.33±2.52)%,运动时间及寿命分别为(336±14.02)s及(405.33±12.22)s。精子激活与运动的适宜NaCl、KCl、MgCl₂及葡萄糖溶液浓度分别为300～500 mmol·L^-1、600 mmol·L^-1、800～1000 mmol·L^-1及900mmol·L^-1;精子在缺少HCO₃^-的人工海水中未能被激活;精子在无Ca²⁺或无Mg²⁺的人工海水中激活率均大于80%,但运动时间及寿命均有所缩短。以Cortland及HBSS溶液为稀释液、10%EG为抗冻剂冻存黄姑鱼精子,冻精激活率>80%,运动时间均超过200s。     

非人灵长类动物精子冻存技术的研究进展

随着生物医学技术的发展,应用非人灵长类动物模型进行基础科学研究日益广泛。与此同时,由于栖息地破坏、狩猎和基因隔离,许多非人灵长类动物濒临灭绝。因此,改进非人灵长类动物精子冻存技术对物种遗传资源的保藏具有重要的意义。本文概述了非人灵长类动物的精液特征,介绍了精液液化和冷冻精子质量评估的方法,分析了冷冻保护剂、冷冻稀释液及冷冻方法等因素对精子冻存效果的影响,总结了目前非人灵长类精子冷冻常用的冷冻保存液和冷冻方法,并对相关精子参数进行了比较,同时探讨了非人灵长类动物精子冻存研究面临的困境,并提出了可行的方案。总之,本文综述了近年来非人灵长类动物精子冻存的重要研究成果,对开发新的冷冻保护剂及改进冷冻技术具有一定的参考价值。     

中国花鲈精子的超低温冷冻保存及酶活性检测

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溴氰菊酯对真鲷肝胰脏组织及细胞DNA的损伤

为研究溴氰菊酯亚急性染毒对真鲷肝胰脏的毒性作用,将真鲷分为5组进行不同剂量半静置染毒.染毒25 d后取真鲷肝胰脏进行组织切片显微观察,并采用彗星试验技术对其肝胰脏细胞进行DNA损伤分析.结果表明: 在0.025、0.125、0.250和0.375 μg·L^-1暴露浓度下,真鲷肝胰脏组织出现了不同程度的淤血、细胞核浓缩、细胞坏死等病理性损伤,且染毒浓度越高组织细胞损伤越显著.与空白对照组相比,各染毒浓度组肝胰脏细胞DNA均有不同程度损伤,彗星拖尾率、彗尾DNA相对含量、Olive距等指标均与对照有显著性差异.一元回归分析表明,染毒浓度与拖尾率、彗星尾长等参数呈极显著正相关; 染毒浓度与各指标均呈线性关系,回归方程拟合度(R)极高,范围为0.909～0.996.表明溴氰菊酯对真鲷肝胰脏组织和细胞DNA均可产生不同程度损伤,且损伤程度与染毒浓度之间具有高度线性相关关系.     

兰州鲇精液超低温冷冻保存技术研究及细胞损伤检测

为保护兰州鲇(Silurus lanzhouensis Chen)种质资源,促进新品种选育,文章开展了兰州鲇精液超低温冻存抗冻剂筛选及程序保存技术研究,并通过精子解冻激活率、核DNA检测、扫描电镜和透射电镜检测技术对冻存效果和冻存损伤情况进行了评测。结果表明:兰州鲇精液以10%DMSO为抗冻剂, 4℃平衡20min,–80℃平衡30min后立即置于液氮超低温保存,并于40℃水浴解冻时精子冻存效果较佳,冻精激活率达(75.56±3.91)%。SCGE检测DNA损伤结果显示超低温冻存10d、20d及30d兰州鲇精液的彗星率和损伤系数无显著差异。扫描电镜检测显示兰州鲇精子明显分头部,中段及尾部3部分,属于单鞭毛型,无顶体,无侧鳍,中心粒相互垂直呈"T"形,鞭毛为典型的"9+2"微管结构。冻存结构损伤主要表现为膜损伤,细胞质膜与染色质膜发生破损、折皱、囊泡化或整体脱落,细胞核膜与质膜空隙加大,核发生变形,核质疏散,线粒体结构弥散,线粒体内容物外流,中心粒复合体易位,鞭毛外膜变形脱离,中段位置断裂,微管结构基本完好。研究筛选的超低温冷冻保存技术可长期有效保存兰州鲇精液,为兰州鲇种质资源保护及今后...     

CRYOPRESERVATION OF SEA URCHIN EMBRYOS AND SPERM

A simple method for preserving live sea urchin embryos and sperm in liquid nitrogen (LN) wasdeveloped through the use of DMSO as a cryoprotective additive. Samples of late embryos in double test tubes were cooled to— I96°C by two-step freezing, first to — 76°C and then by plunging in LN. In the case of fertilized eggs, samples were previously frozen to — 40°C, at which temperature the samples were kept for 15 min; they were then transferred into LN. After preservation in LN for various lengths of time, samples in the double test tubes were thawed in water at 15°C. The post-thaw survival was more than 90% for late embryos, and about 10% for fertilized eggs. Difference in the length of the cryopreservation period did not affect survival. Post-thaw development in cryopreserved embryos often showed abnormalities in structure. Sperm with 1.5 M DMSO was successfully preserved in LN by a similar method to the one used for cryopreservation of late embryos. Fertilizability in cryopreserved sperm was complete, regardless of the length of the preservation period. Nearly all the eggs fertilized by cryopreserved sperm developed to normal plutei.     

昆明小鼠精子冷冻的研究(简报)

胚胎工程技术是动物品种、品系培育,种质资源保存及转基因动物制备、保种的重要手段。配子的冷冻保存技术目前广泛应用于胚胎工程。和胚胎冷冻相比小鼠精子冷冻技术方便、高效尤其适用于转基因及突变系小鼠的保种。成功的精子冷冻要求复苏后通过体外受精(IVF)获得胚胎,再移植入受体,生长发育并产出幼仔。胚胎体外培养获得足够的晚桑葚胚和早期囊胚是胚胎干细胞建立与制备嵌合体小鼠的成功关键,暂时不用的胚胎应仍能耐受冷冻保存,待复苏移植,建立新的繁殖群。但小鼠精子冷冻研究在我国开展的十分有限,缺乏相关资料数据。本实验对不同周龄SPF级昆明(KM)小鼠进行精子冷冻及冻融精子IVF,并将IVF获得的2-细胞胚胎分别进行胚胎移植、体外培养、胚胎冷冻及复苏后移植,应用冻融小鼠精子进行胚胎工程实践。     

SPERM COMPETITION AND THE EVOLUTION OF NONFERTILIZING SPERM IN MAMMALS

Nonfertilizing sperm with special morphologies have long been known to exist in invertebrates. Until recently, abnormal sperm in mammals were considered errors in production. Now, however, Baker and Bellis (1988, 1989) have proposed that mammalian sperm, like some invertebrate sperm, are polymorphic and adapted to a variety of nonfertilizing roles in sperm competition, including prevention of passage of sperm inseminated by another male. More specifically, their “kamikaze” sperm hypothesis proposes that deformed mammalian sperm are adapted to facilitate the formation and functioning of copulatory plugs (Baker and Bellis, 1988). Here I argue that most, maybe all, mammals are unlikely to produce nonfertilizing sperm. First, mammals might not be able to afford to evolve nonfertilizing sperm, given that a) fertilization is often unlikely despite the huge numbers of sperm produced; b) production of larger numbers of sperm is constrained, presumably because of metabolic costs, evidence for which includes the fact that in species in which sperm morphology and anatomy of the female reproductive tract increase the probability of fertilization, the numbers of sperm produced is lower than in others; and c) selection appears to act against the production of deformed sperm. Second, some of the evidence advanced for the existence of nonfertilizing sperm does not in fact support the idea. Third, accessory gland secretions are sufficient on their own to coagulate semen and produce fully functioning plugs; thus the male that used accessory gland secretions would be at a clear advantage over the male that diluted his fertilizing sperm with “kamikaze” sperm; and indeed, current evidence indicates selection on accessory glands, not sperm morphology, to enhance coagulation of semen. Fourth, predictions made on the basis of the “kamikaze” sperm hypothesis are not supported by quantitative comparisons of data from polyandrous and monandrous primates (i.e., those in which several males mate with a fertile female, and therefore in which sperm competition should be operating, and those in which only one male mates). Although sperm competition is almost certainly more intense in polyandrous genera than in monandrous genera (as indicated by, e.g., more frequent copulations and the production of more sperm per ejaculate from larger spermatogenic organs), polyandrous genera do not produce a greater proportion of deformed (i.e., nonfertilizing) sperm than do monandrous genera, or even necessarily a greater number of deformed sperm; nor a greater variety of sperm sizes—indeed they might produce fewer; nor fewer motile sperm (as might be expected if sperm are selected to stay behind and compete with sperm from subsequent males); and nor larger sperm (as might be expected if sperm are produced for functions other than to reach the egg). In sum, currently available evidence suggests that the function of all mammalian sperm is to fertilize, and that sperm competition in mammals occurs through scramble competition, not contest competition.     

低温和超低温保存对中国大鲵成熟精子的影响

中国大鲵Andrias davidianus是中国特有的一种濒危有尾两栖类动物,为了保护这一珍稀物种并且为中国大鲵人工辅助繁育建立一套可靠的技术,对中国大鲵的精子在0—4℃下低温短期保存和在液氮中超低温长期保存进行了研究。研究表明中国大鲵精子原液在常温下一般仅存活3—5h,4℃下能存活6d,0℃下存活时间可达9d。精子原液中添加Ringer氏液或Holtferter氏液,精子存活率比原液保存显著降低。在改良的超低温冻存条件下,中国大鲵精子在液氮中保存两周后解冻,精子复苏率可达10%—15%。利用扫描和透射电镜观察冻融前后中国大鲵精子的超微结构,发现受冷冻损伤精子质膜出现膨胀、破裂;精子穿孔器和轴丝显著弯曲,甚至断裂;波动膜明显脱落或膜结构损坏;精子线粒体嵴变形。结果表明,超低温冻存导致部分中国大鲵精子超微结构发生变化而产生冻伤,进而导致精子活力、复苏率下降。研究为建立规范化的中国大鲵精液保存程序和中国大鲵规模化人工繁育提供重要参考。     

牵牛属生殖细胞和精细胞中细胞器DNA的研究

用ＤＡＰＩ荧光技术观察了大花牵牛（ Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ ｌｉｍ ｂａｔａ Ｌｉｎｄｌ．）和圆叶牵牛（Ｐ． ｐｕｒｐｕｒｅａ（Ｌ．） Ｖｏｉｇｈｔ）生殖细胞的细胞质ＤＮＡ及其在精细胞形成过程中的动态。牵牛属这两个种的生殖细胞均为细长形,具有大量细胞器ＤＮＡ。刚形成的一对精细胞大多数一端钝,另一端呈尾状。较后期的精细胞多呈凸透镜状。生殖细胞分裂形成的一对精细胞多是同型的,也有的表现为异型。精细胞的核多偏于细胞的一端。在细胞质中有大量细胞器ＤＮＡ分布。精细胞中的细胞器ＤＮＡ 荧光点在大小及荧光强度上有所不同,可能代表线粒体和质体这两种不同的细胞器ＤＮＡ。大花牵牛与圆叶牵牛之间,无论是生殖细胞或精细胞在细胞形状和细胞质ＤＮＡ 分布状况上基本相似。一个明显的差异是,后者的细胞质ＤＮＡ 荧光点体积较小和荧光弱。研究表明,精细胞存在具有ＤＮＡ 的细胞器,为牵牛花细胞质具有双亲遗传或父系遗传的潜能提供了细胞学证据。本文还对研究的两个种的精细胞存在同型和异型的现象,以及精细胞在核质比率上的特点与质体双亲遗传的关系进行了讨论     

真鲷视网膜结构及其视觉特性研究：Ⅱ视网膜光感受细胞超微结构研究

对真鲷光感受细胞的超微结构进行观察,结果表明：视杆外段膜盘为游离膜盘,视锥外段膜盘则为连续的膜结构,视锥和视杆均含有连接纤毛和辅助外段。花萼状突起起源于内段。椭体内充满线粒体,无球状小体。双锥椭圆体并生膜为六层,视锥内段无鳍状突起,视锥突触带,在明适应视网膜中数量增多,在暗适应视网中数量减少,视杆突触带在这两种适应网膜中数量不变,每一杆小球只有一个突触带,而锥小足有４－６个突触带。