利用SRY基因和微卫星标记鉴定反刍动物性别

以反刍动物为研究对象,应用多重PCR技术扩增绵羊基因组中X、Y染色体上的4个微卫星标记和SRY基因, 根据基因型进行性别鉴定,试图通过一次DNA扩增同时提供性别鉴定和基因分型的信息。结果表明所设计SRY基因的引物具有高度特异性,是性别鉴定的主要依据,而Y染色体上的MCM158、MAF45两标记由于特异性不好,因此不适用于性别鉴定,对于X染色体上所选的两标记MILVET09和AE25只能进一步验证所鉴定的雄性个体。得出结论在被检个体中,能同时扩增出SRY基因、MCM158、MAF45,X染色体上MILVET09和AE25,且X染色体上的MILVET09、AE25基因型为纯合子的个体为正常的雄性;被检个体中只有Y染色体上MCM158、MAF45和X染色体上MILVET09、AE25的扩增产物,而没有SRY基因的扩增产物,则被检个体为雌性,且MILVET09、AE25的基因型对雌性个体的性别判断无影响。MCM158、MAF45两标记基因型不影响个体的性别鉴定结果。
     

山楂蜂花粉中脂肪酸的GC-MS分析

用乙醇-氯仿作溶剂,提取出山楂蜂花粉粗脂肪,然后进行甲酯化处理,用气相色谱/质谱联用技术进行分离鉴定,共鉴定出10种脂肪酸,并测定相对含量,多不饱和脂肪酸含量较高,其中亚油酸相对含量为47.84%,亚麻酸相对含量为19.30%.     

用于结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌鉴定的4种方法效能比较

比较硝基苯甲酸/噻吩−2−羧酸肼（PNB/TCH）生长试验、胶体金法、荧光PCR法和基因芯片法用于结核分枝杆菌（MTB）和非结核分枝杆菌（NTM）鉴定的效能,从而为临床选择鉴别MTB和NTM的实验室方法提供参考依据。

收集2021—2022年疑似肺结核患者痰液和肺泡灌洗液样本,选择经BACTEC MGIT 960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪液体培养阳性的440份标本,分别采用PNB/TCH生长试验、胶体金法、荧光PCR法和基因芯片法鉴定MTB和NTM。以16S rRNA基因测序法为金标准,比较4种方法的效能。

440份分枝杆菌阳性标本,16S rRNA基因测序法鉴定出MTB和NTM分别为316株和124株。PNB/TCH生长试验、胶体金法、荧光PCR法和基因芯片法鉴定MTB的敏感度分别为96.5%、97.8%、100.0%和99.7%,差异具有统计学意义（χ² = 17.261,P = 0.012）;特异度分别为90.3%、100.0%、100.0%和98.4%,差异具有统计学意义（χ² = 29.110,P＜0.001）;符合率分别为94.8%、98.4%、100.0%和99.3%,κ值分别为0.87、0.96、1.00和0.98。

PNB/TCH生长试验、胶体金法、荧光PCR法和基因芯片法均可用于MTB和NTM鉴定。胶体金法和荧光PCR法鉴定MTB时效性较好,但胶体金法经济、便捷,更适合于基层临床实验室MTB快速鉴定;基因芯片法对软、硬件均有一定要求、检测成本较高,在一定程度上限制了临床的普及应用。

     

猪笼草中产蛋白酶内生菌的分离及鉴定

采用研磨法分离纯化猪笼草各组织器官中的内生菌,并采用水解圈法和摇瓶发酵法分别进行初筛与复筛,对筛选出的菌株进行16SrDNA分析鉴定。结果表明:在猪笼草叶片、捕虫囊、根和茎等4种器官中共分离出25株内生菌;进一步从中筛选出2株可产胞外蛋白酶的细菌A3、L5,其中菌株A3的产酶能力较高,水解圈/菌落直径比(D/d)值为6.5,发酵液的蛋白酶活力为17.58U/mL;菌株L5的D/d值为3.0,发酵液的蛋白酶活力为15.77U/mL;16SrDNA鉴定结果表明,菌株A3、L5与芽孢杆菌属成员具有99%的同源性,其中A3是枯草芽孢杆菌(Ba-cillus subtilis),L5可能是其的新变种或新亚种。     

黄腹山鹪莺和纯色山鹪莺性别的分子鉴定

黄腹山鹪莺Prinia flaviventris和纯色山鹪莺P. inornata共同体现出一个特点,其繁殖期尾羽短于其冬季尾羽,但由于两者的雄雌外形相似而难以野外鉴别.为此,我们采用CHD基因法对二者的性别进行鉴定,并通过解剖对鉴定结果进行验证.结果发现: 1) P2/ P8引物适用于这两个物种的性别鉴定,而2550F/2718R不适用; 2) 分子方法鉴定结果与解剖鉴定结果完全相符; 3) 使用非伤害性取样法拔取的羽毛中提取的DNA具有同样效果.为此,我们认为使用P2/ P8引物对这两个物种进行性别鉴定可靠,具快速鉴定的效果,而2550F/2718R引物可能不适用于莺科鸟类的性别鉴定.     

诊断引物应用于我国三种重要赤眼蜂分子鉴定的研究

本研究根据螟黄赤眼蜂rDNA-ITS2序列设计了螟黄赤眼蜂Trichogramma chilonis Ishii特异引物,同时采用文献中发表的松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolimi Matsumura 和玉米螟赤眼蜂Trichogramma ostriniae Pang et Chen的特异引物以及赤眼蜂属Trichogramma 特异引物对赤眼蜂成虫和寄主卵样品进行了PCR特异扩增分析。结果表明,采用上述特异引物可从单头蜂稳定地扩增出明显的目的DNA条带,并且分子鉴定结果与形态学鉴定结果完全吻合。因此,采用上述3对特异引物可以实现对我国3种重要赤眼蜂种,即松毛虫赤眼蜂、螟黄赤眼蜂和玉米螟赤眼蜂的分子鉴定。     

麦长管蚜唾液中几种酶的鉴定、活力测定与功能分析

用Parafilm膜夹营养液法,以两种食料介质饲喂麦长管蚜Macrosiphum avenae 3龄若蚜并收集其唾液,对唾液中的酶类进行了鉴定、活力测定和功能分析。结果表明,在20%蔗糖介质提取液中,鉴定有果胶酶、多酚氧化酶和纤维素酶; 在水介质提取液中鉴定有纤维素酶; 两种介质提取液中都未鉴定出过氧化物酶。酶活力测定结果表明, 在20%蔗糖介质提取液中, 每30头蚜虫分泌的果胶酶、多酚氧化酶和纤维素酶的酶活力分别为2.59×10^-3 U/g、7×10^-3 U/g和7.89×10^-3 U/g; 在水介质提取液中,纤维素酶活力为3.68×10^-3 U/g。行为反应试验结果表明,果胶酶处理麦苗的挥发物组分能引起麦长管蚜寄生性天敌燕麦蚜茧蜂Aphidius avenae和捕食性天敌七星瓢虫Coccinella septempunctata 的嗅觉偏好反应,因此,果胶酶在麦长管蚜取食诱导小麦植株的间接防御反应中具有重要作用。     

北京泛菌的生长特性及快速鉴定方法研究

[目的]研究分析了杏鲍菇软腐病病原菌北京泛菌的生长特性以及病原菌的快速鉴定方法,从而为杏鲍菇软腐病的防控打下基础。[方法]测定了北京泛菌在不同温度、不同种类抗生素、不同浓度的杀菌剂二氧化氯的生长情况,以及采用特异性引物进行PCR鉴定病原菌。[结果]北京泛菌生长的最适温度28℃,对硫酸链霉素、羧苄青霉素等7类抗生素敏感,在含有50 mg/L的杀菌剂二氧化氯的培养基中不能生长,引物对hrp LF/R、wzx CF/R、tua GF/R和lps DF/R在北京泛菌能够扩增出目的条带。[结论]明确了北京泛菌的生长特性,50 mg/L的杀菌剂能够有效杀灭病原菌,并开发了4对特异性引物用于病原菌的快速、准确鉴定,为杏鲍菇软腐病的防控打下基础。     

酒酒球菌的快速特异性PCR鉴定

以Oenococcus oeni苹果酸-乳酸酶基因(mleA)为目标基因,设计了1对特异性引物PmleaL/PmleaR进行酒酒球菌的快速鉴定研究。结果表明,直接以O.oeni的菌落为模板,通过引物对PmleaL/PmleaR的PCR扩增,可得到mleA基因的特异性条带;用此特异性引物进行供试乳酸菌的PCR鉴定,所有O.oeni菌系均得到特异性条带,而供试的其它种类乳酸菌未扩增出目标带。PmleaL/PmleaR可用于O.oeni的快速PCR鉴定。     

凤丹籽油理化特性及脂肪酸GC-MS分析

凤丹,因产于安徽铜陵凤凰山而得名。采用索氏提取法提取得到凤丹籽油,并对其部分理化特性进行测定;经甲酯化处理后,应用气相色谱/质谱(GC-MS)联用仪分析鉴定其组分,采用峰面积归一化法确定各组分含量。结果表明:凤丹籽含油率为34.86%;凤丹籽油的相对密度(d204)0.91、酸值(KOH)3.85 mg/g、碘值(I)175.63 g/100 g、皂化值(KOH)113.66 mg/g、过氧化值2.91 meq/kg;凤丹籽油中共分离鉴定出21种组分,主要是亚油酸、亚麻酸、棕榈酸和硬脂酸等,不饱和脂肪酸占89.00%,饱和脂肪酸占10.77%;除脂肪酸外,还检测出少量的酚类和烷烃。凤丹籽油是一种高不饱和脂肪酸含量的油脂,可作为油脂新资源进行深度开发。     

利用荧光PCR技术对Crispr/Cas9敲除microRNA 505的小鼠进行鉴定

利用荧光PCR技术对Crispr/Cas9系统敲除的micro RNA 505小鼠进行鉴定,能快速检测出敲除小鼠的基因型,有效加快敲除小鼠基因功能验证的进程。首先,在Crispr/Cas9系统敲除的基因位点区域设计PCR引物,并在上游引物的5′端使用羟基荧光素(5-carboxyfluorescein,FAM)荧光修饰。模板经过PCR的扩增后,将PCR产物与已知片段大小的6-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯(6-carboxy-X-rhodamine,ROX)混合,在377测序仪上通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。随后,根据相对分子质量内标法计算出PCR产物大小,从而达到鉴定小鼠基因型的目的。将上述荧光PCR技术应用于实践发现,两只奠基鼠、16只F1代小鼠以及26只F2代小鼠都能得到准确的鉴定,其中包括microRNA 505基因区段被敲除了17 bp和23 bp。因此,利用荧光PCR技术可以快速、准确地鉴定Crispr/Cas9敲除小鼠。     

双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3的构建与鉴定

目的：构建与鉴定骨形态发生蛋白BMP2和转化生长因子TGFβ3双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3。方法：首先,用PCR方法从质粒pGEMT/BMP2中扩增出BMP2基因全长,并将其连入双基因真核表达载体pIRES,得到质粒pIRES-BMP2,其次,从人胚胎组织提取总RNA,反转录成cDNA,以反转录的cDNA为模板,PCR扩增出TGFβ3基因全长,将TGFβ3基因连入质粒pIRES-BMP2;用酶切的方法筛选出阳性重组质粒,并进行测序鉴定。结果：酶切鉴定证明已将BMP2和TGFβ3两个基因连入载体中,测序结果完全正确。结论：成功构建PIRES-BMP2/TGFβ3双基因真核表达载体。     

双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3 的构建与鉴定

目的:构建与鉴定骨形态发生蛋白BMP2和转化生长因子TGFβ3双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3。方法:首先,用PCR方法从质粒pGEMT/BMP2中扩增出BMP2基因全长,并将其连入双基因真核表达载体pIRES,得到质粒pIRES-BMP2,其次,从人胚胎组织提取总RNA,反转录成cDNA,以反转录的cDNA为模板,PCR扩增出TGFβ3基因全长,将TGFβ3基因连入质粒pIRES-BMP2;用酶切的方法筛选出阳性重组质粒,并进行测序鉴定。结果:酶切鉴定证明已将BMP2和TGFβ3两个基因连入载体中,测序结果完全正确。结论:成功构建PIRES-BMP2/TGFβ3双基因真核表达载体。     

El Tor型霍乱弧菌分泌性蛋白初步分析

摘要：【目的】利用高通量蛋白质组分析技术,初步探讨El Tor型霍乱弧菌的分泌性蛋白组成,为进一步的功能研究打下基础。【方法】选取El Tor型霍乱弧菌流行株N16961和非流行株92-3,用双相电泳和激光辅助解析-飞行时间串联质谱（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight,MALDI-TOF）技术对培养上清的全部蛋白质组份进行鉴定和分析。【结果】从N16961株培养上清中可检测到206个蛋白点,并鉴定出49种蛋白;从92-3株培养上清中可检测到236个蛋白点,并鉴定出42种蛋白,两株菌共鉴定蛋白68种,其中经预测含有信号肽的蛋白占总数的55.88%（38/68）。按功能不同将所鉴定出的蛋白分为10类,其中代谢酶、蛋白折叠/伴侣蛋白、蛋白合成以及信号传导相关蛋白占全部培养上清蛋白数的36.76%,转运蛋白占14.71%,鞭毛蛋白占11.76%,降解酶占10.29%,外膜蛋白占5.88%,毒素占1.47%,在所鉴定出的蛋白中有11种具有信号肽的假想蛋白和2种功能未知的蛋白为首次被实验证实可出现在霍乱弧菌培养上清中,占19.12%。【结论】初步获得了El Tor型霍乱弧菌流行株和非流行株的分泌性蛋白谱及其组成特征,并提示与霍乱弧菌致病关系密切的鞭毛蛋白在胞外释放机制、红血球凝集素/蛋白酶在非流行株中的高表达特征等值得高度关注。     

利用UHPLC-ESI-MS/MS法测定川陈皮与其混伪品中的黄酮类成分

为研究区分川陈皮与其常见混伪品,采用UHPLC-MS/MS对川陈皮与其常见混伪品的黄酮类成分进行分析,并利用基于代谢物信息公共数据库对UHPLC-MS/MS检测的一级谱、二级谱数据进行定性分析,并采用主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)以及聚类分析三种方法对化合物进行分析。依靠数据库共鉴定出228种黄酮类化合物,其中多酚12种、花青素21种、黄酮类132种、黄酮醇36种、黄烷酮20种、异黄酮7种,川陈皮中鉴定出特有化合物15种,混伪品中鉴定出特有化合物16种,通过PCA、OPLS-DA以及聚类分析均可将川陈皮与其混伪品准确地区分开来。结果表明基于UHPLC-ESI-MS/MS技术的代谢组分析方法可有效区分川陈皮与其混伪品,可以作为一种川陈皮与混伪品区分以及差异性评价的有效方法,并为其它中药材品种的真伪鉴别以及质量评控提供参考。     

多裂翅果菊的挥发油成分

用GC/MS联用技术分离鉴定河南桐柏产多裂翅果菊 (Pterocypselalaciniata)挥发油的化学成分 ,应用峰面积归一化法测定各组分的相对含量 ,共鉴定出 3 5种化合物 ,占挥发油总量的 79.0 3 % ,主要为长链脂肪烃和萜烯类及其含氧衍生物等。     

姜樟叶油的化学成份研究

姜樟鲜叶经水蒸汽蒸馏得到一种淡黄色的精油,得率为0.5-0.8％。我们应用气相色谱、红外光谱、气相色谱/质谱/计算机联用以及测定衍生物熔点等方法,对该精油进行成份分析、鉴定。共鉴定出α-,β-柠檬醛,香叶醇,柠檬烯,1,8-桉叶油素,芳樟醇,氧化芳樟醇,樟脑,龙脑,石竹烯等47个已知化合物,其中α-,β-柠檬醛含量高达64.11％。它们是香料工业和医药工业上的重要原料。     

MALDI-TOF MS技术在侵袭性丝状真菌快速鉴定中的应用

探索不同培养基、不同培养时间和不同蛋白质提取方法对侵袭性丝状真菌质谱鉴定准确率的影响, 旨在提高基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术鉴定侵袭性丝状真菌的准确率。

采用分子生物学方法为金标准, 同时运用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术对所收集临床丝状真菌进行鉴定。根据分子生物学的鉴定结果, 去除VITEK-MS v3.0数据库中没有的菌株, 其余菌株接种在沙氏葡萄糖琼脂(SDA)、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)和察氏培养基(CA)3种不同的培养基中, 采用2种不同的蛋白质提取方法(甲酸乙腈法和磁珠法), 获得了不同培养时间点(2、3、5、7和9 d)的特异性质谱指纹图谱。

不同丝状真菌蛋白质提取方法进行比较, 甲酸乙腈法总鉴定准确率为79.8%, 磁珠法总鉴定准确率为77.5%, 2种丝状真菌蛋白质提取方法的质谱鉴定准确率差异无统计学意义(χ²=1.040, P=0.308)。不同培养基进行比较, SDA培养基总鉴定准确率为90.7%, PDA培养基总鉴定准确率为81.4%, CA培养基总鉴定准确率为67.4%, 3种不同培养基的丝状真菌质谱鉴定准确率差异有统计学意义(χ²=36.609, P < 0.001), 其中使用SDA培养基鉴定准确率最高, 使用CA培养基鉴定准确率最低(SDA vs PDA, χ²=7.748, P=0.005;SDA vs CA, χ²=35.131, P < 0.001;PDA vs CA, χ²=10.994, P=0.001)。不同培养时间进行比较, 丝状真菌培养2、3、5、7和9 d后的质谱总鉴定准确率分别为64.3%、88.4%、89.1%、79.1%和78.3%, 不同培养时间的质谱鉴定准确率差异有统计学意义(χ²=32.274, P < 0.001)。培养3 d和培养5 d的质谱鉴定准确率优于培养7 d和培养9 d的质谱鉴定准确率, 培养2 d的质谱鉴定准确率明显低于其他时间(3 d vs 5 d, χ²=0.039, P=0.844;7 d vs 9 d, χ²=0.023, P=0.879;3 d vs 7 d, χ²=4.095, P=0.043;2 d vs 9 d, χ²=6.139, P=0.013)。

侵袭性丝状真菌使用SDA培养基培养3 d, 运用甲酸乙腈法提取蛋白质进行质谱鉴定最理想。

     

条形柄锈菌33号生理小种的分子标记

采用RAPD-SCAR分子标记技术,从300条RAPD随机引物中筛选到了对条形柄锈菌Puccinia striiformis f. sp. tritici 33号生理小种特异的2条引物,将特异性片段回收、克隆和测序后（GenBank注册号为AB914691和AB914692）,依据其序列设计出了2对引物S261F33/S261R33和S300F33/S300R33,能够特异性地从33号生理小种基因组DNA及发病小麦叶片总DNA中分别扩增出247bp和763bp的片段,其结果与采用常规的鉴别寄主法鉴定的结果一致。因此,这2对引物都可用于条形柄锈菌33号生理小种的快速鉴定与监测。     

用MLVA技术和多重PCR对犬种布氏菌基因分型

目的：对犬种布氏菌的遗传关系进行不同分子分型方法的对比研究,为犬布病分子流行病溯源提供有效方法。方法：采用多重PCR和多位点可变数量串联重复序列分析（MLVA）方法对24株犬种布氏菌的遗传关系进行比较研究。结果：多重PCR只鉴定出1株犬种布氏菌,其余23株均鉴定为猪种鲁氏菌,但不能鉴定型别;MLVA方法对已鉴定为猪种的布氏菌仍可再细分为型,87%（20/23）为猪3型,13%（3/20）为猪1型。结论：MLVA可以对布氏菌种（生物型）进行基因分型鉴定,可以作为传统表型鉴定方法的补充。