我国人轮状病毒不同基因型NSP4的致病性研究

对我国轮状病毒流行株NSP4基因变异特点的分析表明,NSP4基因主要可分为Wa组和Kun组,在Wa组内可形成三个亚组,形成了4种NSP4基因型。为了进一步阐明人轮状病毒流行株NSP4基因变异与其致病性变化是否存在联系,我们首先利用杆状病毒载体对NSP4蛋白进行表达,获得了对应4种不同NSP4基因型的重组杆状病毒rvBac97B6,rvBac97S34,rvBac97S36和rvBac97SZ8。用这些病毒感染Sf9细胞后,检测细胞内Ca2 浓度的变化,发现与野生型杆状病毒感染细胞相比,重组病毒感染细胞内的Ca2 浓度显著升高,但各个重组病毒之间无显著性差异。在此基础上,我们进一步在E.coli中分别表达纯化了代表Wa和Kun基因分组的97S34和97SZ8流行株的NSP4。分别用纯化的重组NSP4蛋白攻击乳鼠后,发现不同基因型的NSP4蛋白的致腹泻活性没有明显差异,这种作用可被NSP4抗体拮抗,但这种拮抗作用存在基因型特异性。上述结果表明人轮状病毒流行株NSP4氨基酸序列间的变异并没有使其钙调节及致腹泻能力产生改变,在致腹泻作用中发挥关键作用(或决定性作用)的氨基酸位点在不同NSP4基因型间可能是相对保守的。针对NSP4抗体的有效性也为新型轮状病毒疫苗和药物研究提供了线索。     

轮状病毒不同基因型NSP4的免疫原性研究

NSP4作为轮状病毒的致泻相关蛋白,其在疫苗研究中的作用近年来深受瞩目。为比较不同基因型非结构蛋白NSP4的免疫原性,我们构建了四种基因型的重组表达质粒pCI-97B6、pCI-97S36、pCI-97S34和pCI-97SZ8,在细胞水平进行瞬时表达检测后,进一步免疫小鼠,检测血清IgG抗体滴度和亚型。结果表明利用真核表达质粒表达的NSP4蛋白既可以诱导体液免疫反应,又可以诱导细胞免疫反应,但以体液免疫为主,不同基因型NSP4可具有不同的免疫原性。     

人轮状病毒NSP4蛋白的表达及其致小鼠腹泻作用的初步研究

研究人轮状病毒非结构蛋白NSP4在轮状病毒致病性中的作用.分离得到我国人轮状病毒97SZ8株,以谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的形式在大肠杆菌BL-21中表达NSP4蛋白C端86-175氨基酸并用GlutathioneSepharoseTM 4B亲和纯化.将纯化蛋白分别以0.4nmol和1.5nmol的剂量腹腔注射新生Balb/C乳鼠,记录腹泻发生和体重变化情况.当注射0.4nmol GST-NSP4T重组蛋白时,有1只小鼠发生一过性腹泻(1/6),给予1.5nmol重组蛋白时,实验组所有乳鼠都先后出现了腹泻,存在一定的剂量依赖性.本研究初步在新生小鼠建立了一种人轮状病毒腹泻动物模型,该模型有望在人轮状病毒的致腹泻机理、治疗和预防研究中发挥重要作用.     

人轮状病毒NSP4蛋白的表达及其致小鼠腹泻作用的初步研究

研究人轮状病毒非结构蛋白NSP4在轮状病毒致病性中的作用。分离得到我国人轮状病毒97SZ8株,以谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的形式在大肠杆菌BL-21中表达NSN蛋白C端86-175氨基酸并用G1utathione SepharoseTM 4B亲和纯化。将纯化蛋白分别以0．4nmol和1．5nmol的剂量腹腔注射新生Balb／C乳鼠,记录腹泻发生和体重变化情况。当注射0．4nmol GST-NSP4重组蛋白时,有1只小鼠发生-过性腹泻(1／6),给予1．5nmol重组蛋白时,实验组所有乳鼠都先后出现了腹泻,存在一定的剂量依赖性。本研究初步在新生小鼠建立了一种人轮状病毒腹泻动物模型,该模型有望在人轮状病毒的致腹泻机理、治疗和预防研究中发挥重要作用。     

轮状病毒肠毒素NSP4:一个多功能糖蛋白

轮状病毒(rotavirus,RV)是在世界范围内造成婴幼儿和幼年动物病毒性腹泻的最主要病原。A组RV的NSP4蛋白被认为是病毒的肠毒素,近年来的研究发现,这个非结构蛋白NSP4在RV致病过程中起着重要的作用。本文简要综述了多功能肠毒素NSP4的研究进展。     

人轮状病毒NSP4基因变异与功能关系的初步研究

在比较我国人A组轮状病毒一般腹泻患者分离株和重症患者分离株非结构蛋白(NSP)4 cDNA序列时发现,两者在可能与致病性有关的区域(aa131～146)内存在着显著的差异.为进一步探讨这种变异是否与毒力改变有关,利用杆状病毒表达载体在昆虫细胞Sf9中表达两种毒株的NSP4,通过激光扫描共聚焦显微镜初步观察了它对细胞内钙离子浓度的影响.结果表明:两种来源的NSP4均可使细胞内钙离子浓度明显升高,在48h时大致升高3.1～3.4倍,96h时升高5.6～5.8倍,但两种毒株之间的差别并不明显.研究证实,人轮状病毒NSP4与以往报道的动物轮状病毒NSP4一样,可以引起细胞内钙离子增高,即可能与病毒的致病性有关.但重症腹泻毒株SZ1 NSP4第131～146位氨基酸位点出现的变异并未提高其毒力.轮状病毒的毒力改变可能与其它因素有关.     

轮状病毒非结构蛋白NSP1与宿主的相互作用

轮状病毒（rotavirus,RV）非结构蛋白1（nonstructural protein 1,NSP1）是轮状病毒逃避宿主天然免疫应答的关键蛋白质。它可以与干扰素调控因子家族（interferon regulatoryfactor family,IRFF）的共同区域结合,阻断干扰素表达的信号通路,降低宿主细胞I型干扰素（type I interferon,IFN-I）的表达,从而抑制宿主天然抗病毒免疫机制的建立。因此,NSP1被认为是轮状病毒的一种重要毒力因子。本文综述了近年来轮状病毒NSP1与宿主相互作用的研究进展。     

A组人轮状病毒NSP2基因的克隆、表达及免疫学性质研究

轮状病毒非结构蛋白NSP2在病毒基因组复制过程中起重要作用。在原核系统中重组表达了来自中国的第一株全基因组被克隆和研究了的轮状病毒NSP2,并进一步对其免疫学性质进行了研究。结果显示,在大肠杆菌中能够高效表达重组NSP2蛋白,而且该蛋白能够诱发豚鼠产生特异性抗体。Western blot和免疫荧光检测表明所得抗体不仅能与该重组NSP2蛋白发生特异性反应,而且可以与轮状病毒SA11株或Wa株感染的MA104细胞中表达的NSP2发生反应。以上这些结果为进一步研究该重组NSP2蛋白的结构、功能及免疫学性质奠定了基础.     

针对NSP4基因的shRNA抑制牛轮状病毒的体外增殖

本研究根据牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)的NSP4基因序列,设计并构建了shRNA重组慢病毒载体RNAi-H1-89,利用脂质体介导法,将RNAi-H1-89与辅助质粒共转染293细胞,包装shRNA重组慢病毒;重组慢病毒感染MA104细胞24h后继续接种BRV,以针对LacZ基因的shRNA重组慢病毒为对照,48h后与LacZshR-NA对照比较,RNAi-H1-89明显抑制MA104细胞病变;RT-PCR检测结果表明,针对NSP4基因的shRNA可特异性抑制牛轮状病毒NSP4基因表达;病毒滴度测定表明,在转染50%、75%、95%RNAi-H1-89质粒的细胞培养上清液中,病毒滴度分别是对照组的50%、20%和10%。上述实验结果表明,针对NSP4基因的shRNA能高效地沉默NSP4基因,并且能阻断牛轮状病毒增殖。     

表达轮状病毒nsp4基因重组腺病毒的构建与免疫评价

目的：应用非复制腺病毒表达系统构建表达人轮状病毒非结构蛋白4（NSP4）的重组腺病毒,初步评价其免疫保护效果。方法：构建含野生轮状病毒NSP4基因的穿梭质粒pshuttle-NSP4,与腺病毒骨架质粒pAdeasy经同源重组后在Ad-293细胞中包装获得pAd-NSP4重组腺病毒颗粒。电镜、RT-PCR、免疫荧光等方法鉴定病毒特征及在体外细胞中的表达。肌肉注射及滴鼻方式免疫小鼠,检测小鼠血清抗体效价及其中和保护效果。结果：获得了滴度为10^8.25CCID50/ml的重组腺病毒pAd-NSP4,免疫荧光检测到特异性目的蛋白的表达。二次免疫后肌肉注射和滴鼻小鼠的ELISA血清平均效价分别为1：320 和1：1436.8;中和抗体效价1：45.3和1：71.8。结论：表达轮状病毒NSP4蛋白的非复制型重组腺病毒颗粒具有良好的免疫原性。滴鼻途径比肌肉注射可更加有效地诱导小鼠的免疫应答。     

Mutations in Rotavirus Nonstructural Glycoprotein NSP4 Are Associated with Altered Virus Virulence

Rotaviruses are major pathogens causing life-threatening dehydrating gastroenteritis in children and animals. One of the nonstructural proteins, NSP4 (encoded by gene 10), is a transmembrane, endoplasmic reticulum-specific glycoprotein. Recently, our laboratory has shown that NSP4 causes diarrhea in 6- to 10-day-old mice by functioning as an enterotoxin. To confirm the role of NSP4 in rotavirus pathogenesis, we sequenced gene 10 from two pairs of virulent and attenuated porcine rotaviruses, the OSU and Gottfried strains. Comparisons of the NSP4 sequences from these two pairs of rotaviruses suggested that structural changes between amino acids (aa) 131 and 140 are important in pathogenesis. We next expressed the cloned gene 10 from the OSU virulent (OSU-v) and OSU attenuated (OSU-a) viruses by using the baculovirus expression system and compared the biological activities of the purified proteins. NSP4 from OSU-v virus increased intracellular calcium levels over 10-fold in intestinal cells when added exogenously and 6-fold in insect cells when expressed endogenously, whereas NSP4 from OSU-a virus had little effect. NSP4 from OSU-v caused diarrhea in 13 of 23 neonatal mice, while NSP4 from OSU-a caused disease in only 4 of 25 mice (P < 0.01). These results suggest that avirulence is associated with mutations in NSP4. Results from site-directed mutational analyses showed that mutated OSU-v NSP4 with deletion or substitutions in the region of aa 131 to 140 lost its ability to increase intracellular calcium levels and to induce diarrhea in neonatal mice, confirming the importance of amino acid changes from OSU-v NSP4 to OSU-a NSP4 in the alteration of virus virulence.     

A组轮状病毒NSP1基因克隆表达及免疫学性质研究

轮状病毒（rotavirus, RV）非结构蛋白1（non structural protein 1, NSP1）在病毒与宿主的相互作用中发挥着重要的功能。运用基因克隆和表达技术在大肠杆菌中表达了TB-Chen株RV NSP1蛋白,进行了NSP1的免疫学性质和RV感染细胞中NSP1蛋白的合成与分布以及NSP1的系统进化和基因分型研究。结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)能高效表达重组NSP1蛋白（rNSP1）,rNSP1表达量约占菌体总蛋白的34.4%。rNSP1能诱导免疫豚鼠产生特异性血清抗体。Western blot及免疫荧光检测结果表明,抗rNSP1血清抗体能特异性识别自身蛋白,对SA11、Wa株的NSP1蛋白有交叉反应性;免疫荧光结果还表明,SA11感染的MA104细胞中合成的NSP1蛋白在细胞质中区域化聚集形成辐射状排列的颗粒状结构,而Wa株的NSP1不能形成此样结构。至今发现的A组RV至少可以分为16个不同的NSP1基因型,TB-Chen株NSP1为A2型。不同基因型有独特的敏感宿主范围,同一基因型可能感染不同种动物,同一种动物也可能感染不同基因型。基因型A4型和A16型仅在鸟类病毒株中出现;而且鸟类中只有A4型和A16型。研究结果为进一步研究NSP1蛋白质的结构功能及其应用开发奠定了很好的基础。     

A组人轮状病毒NSP3基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:获得轮状病毒NSP3基因的表达产物及其抗血清。方法:将TB-Chen株轮状病毒NSP3基因插入质粒pETL,构建重组表达质粒pET-NSP3,并转化大肠杆菌BL21(DE3)表达重组蛋白NSP3;用凝胶分离回收的方法纯化该蛋白,免疫豚鼠制备该蛋白的抗血清。结果:构建了重组表达质粒pET-NSP3,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白NSP3,目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的28.6%;有效地纯化了目的蛋白并制备了该蛋白的抗血清,Western印迹表明该抗血清能与重组蛋白NSP3发生特异性免疫反应。结论:通过质粒pETL能高效表达轮状病毒NSP3蛋白,该重组蛋白具有较好的免疫反应性,为进一步研究其结构、功能及免疫学性质奠定了基础。     

G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6和NSP4编码基因的分子特征

最近在亚洲首次发现并报道了感染人的G5型人A组轮状病毒LL36755株,为进一步探讨其进化来源,克隆了G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6、NSP4编码基因,并分析其基因序列的分子特征。结果发现卢龙株LL36755为罕见的G5P[6]型,其VP6的亚群为SGⅡ型,NSP4的基因型为B型。系统进化树分析表明,卢龙株LL36755的VP7、VP4编码基因与猪来源的毒株关系密切,而VP6、NSP4编码基因与人来源的毒株紧密相联系。可以推断新的人腹泻A组轮状病毒LL36755株是猪的VP7,VP4编码基因与人的VP6,NSP4编码基因的自然重组;而且该毒株不是G5的原型,很可能是人类轮状病毒与猪轮状病毒毒株的自然重组后逐步进化而来。     

Expression and Immunoreactivity of a Human Group A Rotavirus Vp4

Rotavirus capsid protein Vp4 plays an important role in the virus adhering and entering the cells. In this study, a Vp4 gene cloned from a rotavirus strain TB-Chen was highly expressed in E.coli BL21 (DE3). The results of the Western blot showed that the protein possesses specific immuno-reactivities and can be specifically recognized by guinea pig antibodies against rotavirus strain SA11 or Wa. Some Vp4 dimers were formed during renaturation. These data obtained from this study provide a strong basis for further study on the structure and function of the Vp4.     

在中国卢龙县发现G5型人A组轮状病毒

轮状病毒是引起我国儿童重症腹泻的主要病原。按照WHO轮状病毒监测方案,对2003年间河北省卢龙县开展了以医院和社区为基础的小于5岁儿童轮状病毒腹泻的监测,发现一株新型轮状病毒。该病毒用传统分型引物(G1、G2、G3、G4)扩增不出条带,对其VP7基因全序列测定和分析后确定该毒株为G5型。这是我们在亚洲首次发现的人类G5型轮状病毒。该毒株与猪的G5型C134毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88·6%和95·4%,与非洲发现的人的G5型毒株MRC3105核苷酸和氨基酸的同源性为89·9%和94%,与巴西发现的IAL-28毒株核苷酸和氨基酸的同源性为87·2%和93·3%。系统发生树分析表明:卢龙毒株LL36755与其他已经报告的两种猪和一种人类的G5型毒株可能具有相同的起源。这是人轮状病毒G5型首次在亚洲国家发现,而且该毒株可能是由人类轮状病毒与动物轮状病毒毒株自然重组产生。