具有生物安全性的杆状病毒杀虫剂基因工程技术的发展与前景

杆状病毒作为杀虫剂在世界各地已被广范应用．但与化学农药相比,杆状病毒具有杀虫速度慢,对高龄害虫需用量大,杀虫谱窄等缺点．随行基因工程技术的发展,从80年代末期起,科学家开始尝试对杆状病毒的遗传性状进行各种分子生物学改造,以获得更优良的病毒虫剂。近年来这方面的研究已取得了可喜进展,同时重组病毒的安全性也引起了世界范围的广泛关注。因此．研制既有优良杀虫性能,又有生物安全性的重组病毒．已成为当今病毒杀虫剂的发展方向。本文及时地总结了重组杆状病毒杀虫剂研究的历史,从提高病毒杀虫速度、增强病毒杀虫毒性、以及病毒宿主特异性等三个方面进行了系统归纳,并对重组病毒的安全性进行科学地分析。重点阐述了新时期研制具有生物安全性的重组病毒的各项基因工程策略,如对重组病毒进行混合包装、前包装：或生产缺陷型的重组病毒（p10基因,p74基因．egt基因,pp34基因的缺失）等。这些措施将把重组病毒对环境可能造成的危害控制在最小范围。理想的重组病毒杀虫剂应具有杀虫快、杀虫谱广、不危害其它生物、在环境中滞留时间短等特点。     

重组病毒杀虫剂应用研究进展

应用分子生物学技术可以将昆虫特异性的毒素基因、某些酶基因等外源基因插入昆虫病毒基因组,或通过改造昆虫病毒基因组等方法构建重组病毒杀虫剂,提高杀虫效果。温室及田间释放实验证实,重组病毒杀虫剂可以显著提高现场防治效果。连续多代抗性筛选实验表明,宿主被诱导产生对重组病毒杀虫剂抗性的速度低于野生型病毒杀虫剂。采用在剂型中添加光增白剂等保护剂、在基因组中插入具有增效作用的基因、应用病毒增强蛋白等技术可以提高重组病毒杀虫效果。随着基因工程技术的发展和安全性研究的深入,以重组杆状病毒为主的重组昆虫病毒杀虫剂的应用研究正面临着突破。     

杆状病毒侵染的分子基础*

相状病毒是昆虫的专一性寄生病毒,可作为一种有效的生物杀虫剂。杆状病毒侵染寄主表现在其基因的功能上。侵染是一个复杂的过程,包括许多不同基因的表达、调控等,以苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa califormica mucleopolyhedrovirus,AcMNPV）为例,从分子水平上概述了与杆状病毒侵染有关的基因及蛋白质的结构特性与功能,为进一步了解杆状病毒侵染寄主的机制,从而有效的改良杆状病毒,扩大杀虫谱,提高其杀虫效果提供参考。     

表达昆虫特异性神经麻痹毒素AaIT的杀虫杆状病毒的构建

根据杆状病毒核多角体基因及植物基因的密码子选择偏向、G+C含量和密码子第三位碱基的G+C含量,同时综合在真核系统中影响基因转录、翻译及影响mRNA稳定性等因素,在不改变所编码的氨基酸序列的基础上,设计并人工合成了昆虫特异性神经蝎毒素AaIT基因。合成的AaIT基因与合成的gp67信号肽DNA序列正确融合后通过杆状病毒转移载体pSXIV VI⁺X3体内重组到粉纹夜蛾多角体病毒(Trichoplusia ni nuclear polyhedrosis virus,TnNPV)上,得到重组病毒TnNPV-AaIT。经Southern blotting验证了AaIT基因整合在TnNPV基因组中,SDS-PAGE证明AaIT基因在重组病毒中的表达。通过用重组病毒口服感染供试昆虫,证明了含AaIT基因的重组病毒能显著缩短杆状病毒的杀虫时间,提高杀虫效率。这是迄今为止我国构建的第一株具有实用价值和应用前景的基因工程病毒。     

表达蝎毒素的重组斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)的构建及毒力

【目的】开发高毒力的重组斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedroviruse,SpltMNPV)杀虫剂。【方法】构建编码蜕皮激素UDP-葡萄糖基转移酶(ecdysterioid UDP-glucosyl transferase gene,egt)基因缺失并插入东亚钳蝎神经毒素(B.martensi Karsch,BmK ITa1)基因的重组转移载体,重组转移载体与SpltMNPVⅡ基因组DNA共转染斜纹夜蛾细胞,通过荧光斑法与有限稀释法相结合筛选重组病毒。【结果】成功筛选出缺失egt基因的、早期启动子(ie-1)启动的、表达BmK ITa1成熟肽的重组病毒SpltMNPV-Δegt-Pph-egfp-ie-1-BmK ITa1。生物测定结果显示,重组病毒的杀虫速度(LT50)较野生病毒提前0.7-0.8 d。【结论】通过在SpltMNPV病毒基因组中插入外源毒素基因可明显增强病毒的杀虫效果,结果说明开发高毒力SpltMNPV生物杀虫剂具有可行性。     

昆虫病毒的增强蛋白

在某些昆虫病毒的包涵体中相继发现了增强蛋白．这类蛋白可以增强核型多角体病毒对昆虫幼虫及体外培养的昆虫细胞的感染力,缩短杀虫时间,提高杀虫效率;还可以增强其他生物杀虫剂（如：Bt）的毒力．关于增强蛋白的作用机制有两种观点：降解围食膜以利于病毒粒子侵染细胞或直接作用于细胞质膜促进病毒粒子的套膜与之融合．该蛋白是由病毒编码的,现已克隆出第一个增强蛋白基因,该基因含有一个2703bP的开放阅读框,其核苷酸序列分析业已完成．增强蛋白的发现有望对病毒杀虫剂的推广产生积极影响．     

第四届全国杀虫微生物学术讨论会

1990年10月16—20日,中国微生物学会农业微生物专业委员会在武汉华中师范大学召开了第四届全国杀虫微生物学术讨论会。来自全国21个省、市、自治区高校、科研、管理、出版、生产等74个单位的137名代表出席了会议。大会收到论文141篇。大会报告包括转B.t.杀虫基因的植物基因工程、昆虫病毒分子生物学研究、苏芸金杆菌和球形芽孢杆菌的分布及     

斜纹夜蛾核型多角体病毒分子生物学研究进展

斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera lituramulticapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)属NPV科A亚群。近几年有关该病毒的序列测定、基因结构、功能和表达调控等系统的分子生物学研究工作进展迅速,特别是对一些重要基因的结构分析,有助于筛选毒力较强的杀虫毒株,并为这一病毒杀虫剂的改良和发展以及组建昆虫杆状病毒表达载体奠定基础。综述了与SpltMNPV相关的分子生物学领域的研究进展。     

含外源类蜗牛毒素基因的AcMNPV的虫体感染性研究

类蜗牛毒素基因(conotoxinlike,ctl)是在一些杆状病毒基因组中存在的与蜗牛毒素类似的一类基因,其功能尚不清楚。本文利用苜蓿银纹夜蛾核多角病毒(AcMNPV)bacmid表达系统构建了含油桐尺蠖核多角体病毒(BusuNPV)ctl基因的重组病毒AcBac-ph-ctl。在细胞水平上对ctl基因的RT-PCR分析表明,该基因转录出mRNA。在甜菜夜蛾体内进行了生物活性测定,结果表明AcBac-ph-ctl与对照野生型AcMNPV的LC50,ST50无显著性差异,表明在此系统中,外源的CTL无杀虫增效性能。     

含外源类蜗牛毒素基因的AcMNPV的虫体感染性研究

类蜗牛毒素基因(conotoxinlike,ctl)是在一些杆状病毒基因组中存在的与蜗牛毒素类似的一类基因,其功能尚不清楚.本文利用苜蓿银纹夜蛾核多角病毒(AcMNPV)bacmid表达系统构建了含油桐尺蠖核多角体病毒(BusuNPV)ctl基因的重组病毒AcBac-ph-ctl.在细胞水平上对ctl基因的RT-PCR分析表明,该基因转录出mRNA.在甜菜夜蛾体内进行了生物活性测定,结果表明AcBac-ph-ctl与对照野生型AcMNPV的LC50,ST50无显著性差异,表明在此系统中,外源的CTL无杀虫增效性能.