电荷耦合器件荧光成象及生物学应用

冷却慢扫描电荷耦合器件照相机附在荧光显微镜上组成了一个系统,可把一系列成象进行贮存,通过标记颗粒的位置、强度以及强度分布的差别,在每幅象上可区分500个荧光点.荧光点的运动可以跟踪,通过分析可区分不同的运动方式,在活细胞表面,已观察到受体有直接扩散,随机扩散和局部随机扩散三种运动方式.电荷耦合器件的高灵敏度使观察过程中只产生少量的漂白.现介绍这系统的测量原理和它在生物学上的应用.     

测量细胞内吞过程中膜受体流动性的新方法

本文首次提出用ＡＢＣ（ＡｖｉｄｉｎＢｉｏｔｉｎＣｏｍｐｌｅｘ）法标记细胞膜受体,通过ＦＲＡＰ（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＲｅｃｏｖｅｒｙＡｆｔｅｒＰｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）技术,测量细胞内吞过程中受体流动性变化的方法。实验选择巨噬细胞ＣｏｎＡ受体,比较了用ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ＋Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩＴＣ（ＡＢＣ法）和ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ（直接法）标记的膜表面ＣｏｎＡ受体荧光强度和内吞过程中受体的流动性测量结果。结果显示ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ＋Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩＴＣ标记的巨噬细胞膜受体的平均荧光强度比用ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ标记的平均荧光强度高大约３倍;ＡＢＣ法标记的受体,测量结果误差小、灵敏度高;ＣｏｎＡ刺激１５ｍｉｎ后,巨噬细胞膜表面ＣｏｎＡ受体的扩散系数和荧光恢复率较静息状态时明显下降。讨论了两种标记方法对测量结果的影响     

两种人胃癌细胞M期与间期时相质膜表面Con A受体复合物分布及侧向运动

利用荧光标记和荧光漂白恢复方法研究了两种人胃腺癌细胞M期与间期时梠中,细胞膜表面ConA受体复合物分子的分布与侧向运动.结果表明:MGC80-3细胞M期时相与SGC7901细胞间期时相膜表面ConA受体复合物分布近似,其侧向运动方式呈扩散型;SGC 7901 M期时相细胞膜表面ConA受体复合物的分布与MGC80-3细胞间期时和相基本类似,其侧向运动主要是流动型.凡是受体复合物是流动型运动的细胞.其膜上可动分子的百分比都寓于扩散型运为的细胞,P值小于0.01.     

两种人胃癌细胞M期与间期时相质膜表面Con A受体复合物分布及侧向运动

利用荧光标记和荧光漂白恢复方法研究了两种人胃腺癌细胞M期与间期时梠中,细胞膜表面ConA受体复合物分子的分布与侧向运动.结果表明:MGC80-3细胞M期时相与SGC7901细胞间期时相膜表面ConA受体复合物分布近似,其侧向运动方式呈扩散型;SGC 7901 M期时相细胞膜表面ConA受体复合物的分布与MGC80-3细胞间期时和相基本类似,其侧向运动主要是流动型.凡是受体复合物是流动型运动的细胞.其膜上可动分子的百分比都寓于扩散型运为的细胞,P值小于0.01.     

外源性层粘连蛋白对腹水型肝癌细胞内微丝组装和细胞游动的作用

本文研究外源性层粘连蛋白与癌细胞膜上受体结合调节胞内肌动蛋白微丝组装与改变细胞游动之间的关系,以及影响膜上层粘连蛋白受体的侧向扩散运动及膜脂分子流动性变化之间的关系.用各种荧光技术,如荧光显微米,荧光漂白恢复技术和荧光流式细胞术得到了明显的证据.层粘连蛋白与肝癌细胞膜有结合,使分散的腹水肝癌细胞粘连聚集,并膜下周动蛋白微丝增加,当把癌细胞分开则细胞从原位游动很大距离.如不分离粘连的细胞可减少其脱落和转移.层粘连蛋白与受体结合则受体的侧向扩散系数减小,膜脂流动性降低,使膜上分子运动受影响,对癌的生长不利.     

多序列比对的量子点荧光探针检测金黄色葡萄球菌的研究

利用以量子点（Quantum dot,QD）作为供体、有机荧光染料作为受体的荧光能量共振转移（Fluores—cence resonance energy transfer,FRET）体系检测核酸等大分子是一种非常重要的检测手段。本文构建了一种检测金黄色葡萄球菌种特异性16SrDNA的新方法。此方法以羧基修饰的525nm量子点与氨基修饰的DNA在EDC的作用下通过脱水连接形成QD—DNA复合物作为荧光能量共振转移体系的供体、有机荧光基团ROX修饰的DNA作为荧光能量共振转移体系的受体组成能与金黄色葡萄球菌种特异性16SrDNA杂交的检测探针。当探针与靶序列发生杂交时,作为供体的525nmQD与作为受体的ROX之间的距离被缩短至能有效发生荧光能量共振转移的距离之内。此时,以不能致ROX发光的波长激发量子点发光,其荧光强度下降,而ROX的荧光强度上升。在不存在靶序列的情况下,不会发生这种荧光强度的变化。QD与ROX荧光强度的变化是实现本检测体系快速、简单的重要保证。     

氧化HDL_2在大鼠肝窦状隙细胞内代谢

大鼠肝窦状隙细胞培养结果显示：氧化高密度脂蛋白２（ｏｘ－ＨＤＬ２）对异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）荧光标记ｏｘ－ＨＤＬ２的细胞结合有竞争抑制作用,而ＨＤＬ２则无。细胞内吞ＦＩＴＣ－ｏｘ－ＨＤＬ２的荧光强度（ＦＳ）和［３Ｈ］ＣＥ－ｏｘ－ＨＤＬ２（ｒ－ｏｘ－ＨＤＬ２）的放射强度分别是内吞ＦＩＴＣ－ＨＤＬ２的４５．５％和ｒＨＤＬ２的６１．４％。内吞ＦＳ主要存在于三氯醋酸（ＴＣＡ）沉淀部分,而放射强度主要存在于ＴＣＡ上清液部分。细胞释放的ＦＳ和放射活性分别是内吞量的６７．７％和１０．９％,且主要存在于ＴＣＡ可沉淀部分。结果提示：（１）大鼠肝窦状隙细胞可能存在着ｏｘ－ＨＤＬ受体,该受体不同于ＨＤＬ受体。（２）ｏｘ－ＨＤＬ２在细胞内代谢方式与ＨＤＬ２相似,均没有经历溶酶体分解途径。在细胞内载脂蛋白与胆固醇酯（ＣＥ）组分经历一个解离过程。细胞截留大部分ＣＥ后,将载脂蛋白（Ａｐｏ）与剩余ＣＥ重组成脂蛋白并以逆向胞饮方式释放到胞外。（３）氧化修饰减弱ＨＤＬ２逆向转运胆固醇能力     

基于单分子定位的超分辨显微中荧光激发密度的优化

基于单分子定位的超分辨显微技术中,荧光点的中心位置可通过对每个荧光点进行单点扩散函数(point spread function,PSF)逐个拟合定位或对多个荧光点进行多PSF同时拟合定位获得。定位误差以及图像采样时间与荧光激发密度直接相关。为定量得到基于这两种算法的最优荧光激发密度,模拟了成像与定位过程,比较了常见的几种荧光分子在采用基于单PSF逐个拟合和多PSF同时拟合两种算法定位时的中心定位误差、荧光获取比率、获取的有效荧光点数与荧光激发密度间的关系,进而得到了采用这两种算法对不同荧光染剂进行超分辨成像时的最优荧光激发密度。该结果对单分子成像过程中荧光激发密度的选择和激发激光的强度控制具有指导意义。     

凝集素受体在正常及缺氧—再给氧脑微血管内皮细胞的表达

本文应用凝集素亲和细胞化学的方法,通过荧光标记的麦胚凝集素（ＦＩＴＣ－ＷＧＡ）对培养的大鼠脑微血管内皮细胞进行染色,观察了ＷＧＡ凝集素受体在缺氧－再给氧后脑微血管内皮细胞上的表达。通过图像分析定量细胞表面的荧光强度,发现脑微血管内皮细胞单纯缺氧６小时后凝集素受体表达与正常对照组相比无明显变化;其显著改变发生于再给氧１小时后,ＷＧＡ的结合位点明显增加,荧光强度达峰值;再给氧３小时及６小时后有所下降,但与正常对照组相比仍具有显著性差异。上述结果与我们以往的动物在体实验,即大鼠脑缺血－再灌注后内皮细胞ＷＧＡ受体的表达趋势相吻合。说明脑微血管内皮细胞凝集素受体在细胞损伤后发生改变,并显示了在单纯缺血损伤和再灌注损伤的表达有所不同,它与其它内皮损伤后的变化,如细胞因子及其受体、粘附分子等的关系有待于深入研究     

人胃癌不同周期细胞膜表面ConA受体的分布与侧向运动

本文研究了人胃低分化粘液性腺癌细胞MGC 80-3不同周期时相中ConA受体的分布与侧向运动。MGc 80-3细胞经同步化培养,用F-ConA标记。被标记细胞中G_1、S和G_2期呈不连续的分布,但它们之间又存在显著的差异。M期呈较均匀的强荧光分布(与其它时相细胞比较)。荧光漂白恢复方法测定ConA受体复合物侧向运动表明:各个周期时相之间不仅运动方式不同,而且运动速率也有显著差异。M期与G_1期主要表现出扩散型运动;而S期与G_2期表现为流动型运动。G_1期的扩散系数大干M期的;S期的流动速率大于G_2期的。但可动分子百分比以G_2期最高。这些结果表明了ConA受体的动力学性质。它受到细胞周期的调节。     

肠系膜微血管通透速度的图象分析

本文应用微循环活体观察和荧光示踪技术,通过计算机数字图象处理对荧光素钠（ＦＩＮａ）和ＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎｓ（ＦＤ－４,ＭＷ４０００,ＦＤ－１５０,ＭＷ１５００００）在肠系膜微血管的通透过程进行了定量研究,建立了正常大鼠肠系膜微血管对不同分子量荧光物质的通透方程,得到了通透系数及对通透系数评价的定量方法。结果证实：颈动脉注射荧光素钠后４ｓ即可在微血管中见到,扩散速度很快,通透系数为３．３６２×１０－８ｃｍ２／ｓ。注射ＦＤ－４后１５ｓ可在微血管中见到,扩散速度比荧光素钠慢１倍左右,通透系数为１．７１８×１０－８ｃｍ２／ｓ。注射ＦＤ－１５０后８ｓ可在微血管中见到,扩散速度很慢,约为荧光素钠扩散速度的１／７０,通透系数为０．０４８６×１０－８ｃｍ２／ｓ。荧光物质的渗出部位主要在毛细血管及细静脉,在细动脉则极少见到。证实我们计算得出的通透系数能够较好地反映肠系膜微血管通透的实际情况,所采用的评价方法及得到的通透方程可以用于微血管物质交换参数的定量评价。     

鼻咽癌上皮细胞表面con A受体复合物侧向运动的研究

本文所用的鼻咽癌上皮细胞(CNE株)有能在常温和高温下生长的特性。常温和高温下生长的CNE细胞表面都有能与荧光标记的伴刀豆球蛋白A(conA)特异结合的受体。我们用激光漂白荧光恢复测量装置测定了这二类细胞表面conA受体复合物在光漂后的荧光恢复过程,发现膜上有半数以上的conA受体复合物的运动受到限制,或者说是不动的。可以运动的分子其运动形式是扩散运动,它们的侧向扩散系数是:CNE37在37℃和41℃下分别是4.0×10~(-11)cm~2s~(-1)和21.5×10~(-11)cm~2s~(-1)。CNE41在37℃和41℃下分别是2.3×10~(-11)cm~2s~(-1)和4.1×10~(-11)cm~2s~(-1)。本文对上述结果以及对激光漂白荧光恢复测定法本身进行了讨论。     

荧光能量转移和偏振研究小牛胸腺DNA与组蛋白在高低离子盐溶液中的离合

本文研究小牛胸腺DNA和组蛋白在体外低、高离子强度盐溶液中的动态缔合与解离。 实验结果是低离子溶液中荧光给体DANsyl-Cl-组蛋白在发射峰位上荧光强度降低,荧光受体吖啶橙-DNA在发射峰位上的荧光强度增高。此两峰位上荧光受体的荧光增量比值是2.7/1(大于1),有能量转移发生,DNA和组蛋白缔合。高离子溶液中两峰位上受体的荧光增量比值降到1.6/1,能量转移减少,DNA和组蛋白解离。 低离子溶液中所得的吖啶橙-DNA的荧光偏振度P值小而高离子溶液中的P值大。说明解离的DNA硷基排列比缔合的DNA硷基排列有序程度强,进一步证明低离子溶液中DNA和组蛋白是缔合的,而高离子溶液中它们是解离的。     

ABC法在膜受体支流性测量中的应用

本文首次把ＡＢＣ法应用于反体流动性测量中的膜表面体荧光标记,利用ＦＲＡＰ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ａｆｔｅｒ Ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）技术实现了细胞内吞过程中膜受体流动变化的测量。实验用ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ和Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩＴＣ（ＡＢＣ法）标记巨噬细胞ＣｏｎＡ受体,测量ＣｏｎＡ刺激不同时间细胞膜表面受体的荧光强度、扩散系数和荧光恢复率的变化。结果显示ＡＢＣ标记法适合于     

C－反应蛋白与模型受体的特异性结合

Ｃ－反应蛋白是动物体内一种典型的急性期反应蛋白。本文人工合成了两种可以与Ｃ－反应蛋白特异性结合的兼性分子作为Ｃ－反应蛋白的模型受体,以便进一步在脂单层膜表面上组装Ｃ－反应蛋白的二维晶体。作为第一步工作,本文研究了兼性分子的特性以及荧光光谱方法监测兼性分子与Ｃ－反应蛋白之间特异性相互作用。荧光光谱实验结果表明受体与Ｃ－反应的特异结合会引起荧光强度的下降。     

丹氏鱲（ Zacco temminki ）黑色素细胞肾上腺素受体的研究

本文报道了丹氏鴞（Ｚａｃｃｏｔｅｍｍｉｎｋｉ）黑色素细胞肾上腺素受体的特性。实验在６０条鱼上进行，分别在４－１１月随机抽采体侧黑色斑纹处的鱼鳞。使用苯肾上腺素、甲氧明、肾上腺素、去甲肾上腺素、α２苯甲唑啉、可乐啶等受体激动剂，以及柯楠次硷、育享宾等受体拮抗剂，分析其受体特性。发现黑色素细胞颗粒凝结的肾上腺素受体为α２型，而颗粒扩散的肾上腺素受体为β１型或与β２型混合型。     

人胃癌细胞在丁酸钠的诱导下膜分子运动与膜相关骨架的关系

体外培养的人胃癌细胞,用丁酸钠处理后,显示细胞表面FN及细胞胞质微丝的变化,同时用荧光漂白恢复方法对细胞膜ConA受体复合物侧向扩散运动进行测定。结果表明,经丁酸钠处理后的细胞,胞质微丝及细胞膜表面FN均较对照组增加,而细胞膜分子侧向扩散运动减慢,说明与细胞膜相连的细胞骨架的变化对膜分子侧位运动具有牵制作用。     

C－反应蛋白与模型受体的特异性结合

Ｃ－反应蛋白是动物体内一种典型的急性期反应蛋白,本文人工合成了两种可以与Ｃ－反应蛋白特异性结合的兼性分子作为Ｃ－反应蛋白的模型受体,以便进一步在脂单层膜表面上组装Ｃ－反应蛋白的二维晶体。作为第一步工作。本文研究了兼性分子的特性以及荧光光谱方法监测兼性分子与Ｃ－反应蛋白之间特异性相互作用。荧光光谱实验结果表明受体与Ｃ－反应的特异结合会引起荧光强度的下降。     

利用荧光探针直接测定线粒体活性氧的形成

目的与方法：根据荧光探针－还原型二氯荧光素（2‘,7‘-dichlorodihydrofluorescin,DCFH)可与活性氧（reactive oxygen species,ROS)反应生成荧光物一氧化型二氯荧光素（2‘,7‘-dichlorofluorecin,DCF)的原理,设计了利用荧光分光光度计直接定量检测线粒体活性氧生成并可观察在各种实验条件下线粒体活性氧产生动态变化的方法。结果与结论：线粒体在态4呼吸状态下,DCF的荧光强度随时间呈线性增加,表明活性氧以恒定速率产生。将荧光强度随时间变化的数据点拟合,线性回归直线斜率与活性氧产生的速率呈正比,测定中加入叠氮钠和丙二酸可分别使线粒体活性氧产生增加和减少。DCF荧光强度增加速率与线粒体浓度在一定范围内呈线性关系。复管实验表明重复性良好。     

巨噬细胞细胞内吞过程中膜受体流动性的测量——两种标记受体…

本文首次实现了细胞内吞过程中膜受体流动性的测量。实验选择巨噬细胞膜和伴刀豆凝集素Ａ（ＣｏｎＡ）。分别用ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ＋Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩＴＣ（ＡＢＣ法）和ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ（直接法）两种方法标记巨哓细胞膜ＣｏｎＡ受体，比较了这两咱方法标记的巨噬细胞ＣｏｎＡ受体的荧光强度，利用ＦＲＡＰ技术。分别用两种标记方法测量了巨细胞ＣｏｎＡ受体的流动性。结果显示ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ＋Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩ