ELISA技术筛选200种中草药抗HBsAg的实验研究

使用ＥＬＩＳＡ技术对２００种中草药水提取物进行抗ＨＢｓＡｇ的实验研究,共筛出有效药物７种（占总数的３．５％）。若按５种不同剂量（０．３、０．６、１．２、２．５、５．０ｍｇ／１００μｌ）的药物、２种不同浓度的ＨＢｓＡｇ（１０．９２、１４．２６Ｐ／Ｎ值）与３种不同接触时间（立即、１ｈ、２ｈ）的１０项Ｐ／Ｎ值均数来综合评价药效指数时,７种有效药物的次序为青蒿（１．６７Ｐ／Ｎ值）、大蒜（２．１９Ｐ／Ｎ值）、红孩儿（２．３１Ｐ／Ｎ值）、仙鹤草（２．３１）、魔芋（２．３２Ｐ／Ｎ值）、冬瓜皮（２．６３Ｐ／Ｎ值）和猕猴桃（２．８９Ｐ／Ｎ值）。     

应用重定向超速区带离心法纯化HBsAg的研究

采用重定向超速区带离心法进行了从乙肝阳性血清中提纯ＨＢｓＡｇ的研究，获得了一套最佳离心条件，可清除阳性血清中的各种杂蛋白，获得不含乙肝病毒（Ｄａｎｅ颗粒）的纯ＨＢｓＡｇ。此方法具有离心时间短、不漏液、故障少及成本低等优点。本试验结果为采用重定向超速区带离心法大规模纯化ＨＢｓＡｇ、基因工程表达产物及其它生物大分子蛋白提供了实验依据     

三氧化二砷脂质体透过载瘤大鼠血脑屏障的实验研究

目的：观察三氧化二砷（As2O3）脂质体通过载瘤大鼠血脑屏障（BBB）的效果。方法：超声薄膜分散法制备三氧化二砷脂质体,建立药物标准曲线,检测包封率;立体定向技术建立C6／Wistar大鼠脑胶质瘤模型;取Wistar雄性载瘤大鼠84只,随机分为三氧化二砷脂质体组和三氧化二砷组,分别经静脉注射三氧化二砷脂质体和三氧化二砷注射液,给药后0．5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h取大鼠脑组织冻存,应用双道原子荧光法检测载瘤大鼠脑组织中的砷含量。结果：制备稳定的三氧化二砷脂质体,包封率分别为92、2％,92．2％,92．3％;As2O3脂质体组及As2O3给药后7个时间点鼠脑组织中砷含量（μg／L）分别为：341．09±18．18,523、98±27．36,475．19±15、52,467.02±22．46,471．52±24．38,382.30±13．26,282．47±19．71;99.93±17.10,148.07±26、21,101.78±17．54,89．09±19．41,74.39±13．85,50．44±15.31,51．52±19．23。比较给三氧化二砷组及给三氧化二砷脂质体组载瘤大鼠脑组织中砷含量有显著差异（P〈0．05）。结论：三氧化二砷脂质体对血脑屏障的透过性明显优于单纯砷剂。     

转铁蛋白修饰脂质体的制备及其肝癌靶向性研究

目的：肿瘤的靶向治疗是当前研究的热点,肝肿瘤细胞表面有大量的转铁蛋白受体表达,而正常组织较少,因此本研究制备转铁蛋白（TF）修饰的脂质体（TFLPs）,并对其肝肿瘤靶向性进行研究。方法：采用薄膜分散法制备普通脂质体,考察其形态,粒径,电位。通过体外血清稳定性模拟脂质体进入体内后的稳定性。通过HepG2肿瘤细胞对TFLPs的摄取实验考查脂质体与肝癌细胞的亲和力。构建荷瘤裸鼠模型,考查TFLPs在荷瘤裸鼠体内的分布。结果：所制备的TFLPs平均粒径为108．8±9．5nm,Zeta电位为．1．80±0．73mV。学期稳定性试验结果显示,TFLPs在24h内具有良好的血清稳定性。体外细胞摄取实验表明,HepG2细胞对TFLPs的摄取效率是普通长循环脂质体（LPs）的3．4倍。荷瘤裸鼠肝组织和肿瘤组织切片结果显示,TFLPs比LPs具有更好的肿瘤靶向性。结论：该脂质体制备方法简单,与LPs相比,经转铁蛋白修饰可显著提高肿瘤细胞对脂质体的摄取,TFLPs是一种潜在高效的肝癌靶向给药系统。     

生物可降解微球作为乙型肝炎基因免疫佐剂的研究

探讨生物可降解微球对基因免疫的增强作用。采用有机溶剂蒸发法制备聚乳酸聚乙醇酸共聚 物（ＰＬＧＡ）微球,构建含有乙型肝炎病毒表面抗原Ｓ基因的ｐＲＣ－ＣＭＶ真核表达载体,用微球与基因 载体共孵育法制备其混合物。肌肉注射免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠。结果表明：微球注射组的血清抗体滴度达到 ｌ：１６００,其效果与乙型肝炎病毒表面抗原加铝佐剂注射组相近,而裸ＤＮＡ注射组没有反应。说明了 生物可降解微球可显著的提高基因免疫的免疫反应。     

HPC脂质体的制备及抗HL-60细胞增殖作用的初探

采用十六烷基磷酸胆碱（ＨＰＣ）作为脂质体膜材,配以胆固醇和双十六烷基磷酸盐,反相蒸发法制备出ＨＰＣ脂质体,连续５周每周测定一次它对ＣＦ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ,羧基荧光素）的包封率,可知制备的脂质体在前２周内相当稳定,５周后包封率仅减少２４％,可满足实际应用的需要．冰冻蚀刻法测定脂质体的平均直径在５００ｎｍ左右,该直径的脂质体较适于和细胞发生相互作用且稳定性比小单层脂质体好．四氮唑（ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｄｉｐｈｅｈｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏ－ｍｉｄｅ,ＭＴＴ）分析可知,在脂质体浓度达１５μｍｏｌ／Ｌ,对ＨＬ－６０细胞的增殖具有抑制作用．在相同的脂浓度下,ＨＰＣ脂质体抑制ＨＬ－６０细胞生长比游离ＨＰＣ有较强的抑制细胞增殖作用,当ＨＰＣ浓度低于５μｍｏｌ／Ｌ时,细胞生长不受抑制．当ＨＰＣ浓度在１０μｍｏｌ／Ｌ时,ＨＰＣ脂质体表现出对细胞生长的抑制作用,而游离ＨＰＣ在此浓度下的抑制作用较低     

重组人Fab金属螯合层析法纯化条件的研究

在重组人Fab(rh Fab)表达载体的羧基端插入六个组氨酸, 使其对金属螯合层析介质产生特异性吸附, 可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化. 采用自制金属(铜、锌金属离子)螯合层析介质, 以pH和咪唑两种洗脱方法,对rh Fab段的纯化效果进行了探讨. 结果显示: 铜离子螯合层析介质比锌离子螯合层析介质对rh Fab的亲和能力更强; pH洗脱方法的重复性优于咪唑法; 金属铜离子螯合层析法对rh Fab进行一步纯化可得到纯度大于95%的rh Fab产品.     

影响小鼠体细胞脂质体法转染效率的因素

We studied the effects of the amount of liposome and plasmid, exposure time of cells to the liposome-plasmid complexes, number of cell passages and cell types on GFP gene transfection of mouse somatic cells. The maximal GFP transgene expression (30.7%) was achieved when mouse fetal fibroblast cells (MFFC) at 70%-90% confluence of passage 3 were exposed for 6 h to the complexes of 4 microg liposome (LipofectAMINE) and 0.3 microg plasmid (pEGFP-N1). Under these conditions, we compared the effect of the number (from primary to 15) of passages on the transfection efficiency of MFFC. The transfection efficiency of MFFC was 10.0%, 28.9% and 7.2% at the primary, 3rd and 15th passage, respectively, which indicated that the transfection efficiency decreased with passaging. When MFFC, mouse oviductal epithelial cells (MOEC) and mouse granulosa cells (MGC) were transfected at passage 3, the transfection efficiency was 27.8%, 13.7% and 14.2%, respectively, under the described transfection conditions. When the cell cycle stages of different cell types at transfection were examined, it was found that 17.2% of MFFC, 8.7% of MOEC and 9.9% of MGC were at M phases of the cell cycle. Examination of the cell cycle stages of MFFC at different passages showed that MFFC at the third passage had the highest percentage of M cells and the percentage decreased afterwards. This suggested that the transfection efficiency was correlated with the percentages of cells at M phase, and provided essential data for improvement of the transfection efficiency.     

Ca~（2＋）与含β－桐酸磷脂脂质体的相互作用

通过测定含β－桐酸（β－ＥＳＡ）的双棕榈酰磷脂酰胆碱（ＤＰＰＣ）脂质体在加入Ｃａ（２＋）后浊度,粒度及内包荧光物释放的变化,研究了Ｃａ（２＋）与ＤＰＰＣ／β－ＥＳＡ脂质体的相互作用,结果表明,ＤＰＰＣ／β－ＥＳＡ脂质体是一类对外加Ｃａ（２＋）敏感的脂质体,Ｃａ（２＋）的作用首先是引起脂质体间的集聚然后使脂质体融合;此时加速脂质体内包荧光物的释放。     

艾氏腹水癌细胞膜质子跨膜外转运与脂质体融合:Ca2+及脂质体膜脂成份的作用

研究了Ca^2 及脂质体膜脂成分对艾氏腹水癌细胞质膜质子跨膜转运驱动的脂质体融合中的作用。结果 表明Ca^2 促进质子跨膜转运驱动的质子跨膜转运驱动艾氏腹水癌细胞与脂质体间的融合,膜融合程度与膜表面电荷密度的相关曲线显示,在下述条件膜融合与膜表面电荷密度呈正相关：（1）介质Ca^2 浓度小于6mmol/L,脂质体磷脂组成为PE：PC：CL＝6：2：2;（2）介质Ca^2 浓度为6mmol/L,脂质体鳞脂组成为PE：PC：CL＝6：2：2;（3）无Ca^2 介质,脂质体磷脂组成为PE：CL＝8：2;（4）介质Ca^2 浓度10mmol/L,脂质体磷脂组成为PE：CL＝8：2。脂质体PE／PC含量对膜融合的影响表明,当PE含量减少PC含量增加时,膜融合程度不断下降,提示影响膜融合的另一因素可能是生物膜结构形成“柄”融合中介体的能力。     

抗乙型肝炎病毒表面抗原preS1（20－47）多抗的制备、性质和应用

ＨＢｓＡｇｐｒｅＳ１（２１－４７）肽参与乙肝病毒与肝细胞受体的结合。我们用固相法合成了ＨＢｓＡｇｐｒｅＳ１（２０－４７）２８肽,并用此肽与ＢＳＡ的偶联物免疫家兔;抗血清经亲和层析纯化后,得到了高纯度、高活力及专一性的抗ＨＢｓＡｇｐｒｅＳ１（２０－４７）多抗,它能成功地用于基因工程表达产物及病人血清中的ＰｒｅＳ１抗原的检测。     

关于重组乙肝表面抗原纯化收率的研究

本文采用回归分析法研究了超速离心纯化时,固定一次溴化钾密度梯度比例,选择不同的二次溴化钾梯度比例对下一步ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ柱层析纯化收率的影响。结果表明：回归分析不仅能揭示纯化的最佳条件,即,二次溴化钾超速离心时溶液由２４０ｍｌ（１．０４ｇ／ｍｌ）：８００ｍ１（１．２８ｇ／ｍｌ）：６００ｍｌ（１．３２ｇ／ｍｌ）：５０ｍｌ（１．３４ｇ／ｍｌ）构成时柱层析收率最高。而且还能解释层析纯化中出现的异常结果。     

一种新的乙型肝炎病毒表面抗原结合蛋白的筛选、表达及其生物学活性的初步研究

为了研究乙肝病毒侵染肝细胞过程中的功能蛋白 ,通过印迹免疫分析技术从人肝cDNA噬菌体表达库中筛选出一株编码乙肝表面抗原结合蛋白 (hepatitisBsurfaceantigenbindingprotein ,HBsAg BP)的cDNA克隆 .基因测序结果表明 ,该cDNA具有独立的开放阅读框架 ,编码 1个由 344个氨基酸残基构成的可溶性蛋白分子 ,属于免疫球蛋白超家族成员 .将该基因克隆到原核表达载体pTriplEx后 ,在E .coliXL1 Blue菌株中获得 4 4kD的重组蛋白 .重组蛋白经Western印迹和ELISA实验证明具有与乙肝表面抗原特异性结合的能力 .进一步经流式细胞仪实验显示 ,在纯化的重组蛋白存在的情况下 ,天然的HBsAg与肝细胞株HepG2的亲和力显著增高 .结果显示 ,该乙肝表面抗原结合蛋白可能是介导乙肝病毒对肝细胞亲和侵染的可溶性辅助受体 .     

脂质体膜上的8—苯胺基—1—萘磺酸的荧光研究

８－苯胺基－１－萘磺酸（简称８．１－ＡＮＳ）作为荧光探针被大量地用于蛋白质和生物膜的研究［１,２］,但人们对其荧光特点和发光机制的了解很不全面,一直处于争论之中［３］。本文从膜表面电荷和膜极性的角度研究了８．１－ＡＮＳ在脂质体膜表面的荧光强度和峰位。...     

肝细胞生长因子的分子生物学研究

肝细胞生长因子 (HGF)是一种多功能细胞因子 ,其分子为异二聚体糖蛋白 ,有NK1,NK2 ,NK4三个变种。HGF启动子的结构很复杂 ,其表达受多种因素和调控元件的调节。因HGF在体内有重要作用 ,HGF的基因工程表达和基因治疗正在研究中     

多肽靶向脂质体的表面配体修饰密度及其体内肿瘤靶向效果的研究

脂质体作为一种药物载体广泛应用于肿瘤药物输送中。配体修饰的靶向脂质体,其靶向配体分子在脂质体表面修饰的构象和密度等参数,对脂质体本身的特性及其体内的靶向效果,有很大的影响。但有关其中的具体相互关系,以及可能的最优条件,国内外文献都尚无定论。据此我们建立了多肽靶向脂质体表面配体修饰的分析方法,并通过影像学手段来研究不同靶向肽含量对脂质体在荷瘤裸鼠中的靶向行为的影响。首先采用孵育插入法将带有多肽的脂质分子插入脂质体表面,用分子筛色谱法分离修饰后的脂质体和未插入的多肽脂质,再用HPLC-ELSD定量各脂质成分,得到多肽靶向脂质体表面的靶向肽密度。而后将修饰有不同密度靶向多肽的荧光脂质体经荷瘤小鼠尾静脉注射,分别在给药前后各时间点对小鼠进行扫描,对扫描得到的图像进行处理并计算AUC、T1/2和MRT等相关药代动力学参数。结果表明,随着脂质体表面多肽密度的增加,即多肽密度大于1.298%的靶向脂质体,其肿瘤部位的荧光AUC、T1/2和MRT都较未修饰的隐形脂质体有所提高,显示其在肿瘤组织中的聚集量增多、停留时间延长,针对肿瘤细胞的特异性作用机制得以彰显。     

杨梅苷脂质体的制备研究

目的：制备杨梅苷脂质体。方法：采用逆相蒸发法制备杨梅苷脂质体。用冷冻离心法分离脂质体和游离药物,用高效液相色谱法测定药物含量并计算包封率。采用激光粒度仪测定平均粒径。结果：杨梅苷脂质体制备的最佳处方和工艺为：卵磷脂：杨梅6：1,卵磷脂：胆固醇2：1,有机相：水相4：1,磷酸盐缓冲溶液的pH值为6.86,浓度为0.005 mol.L-1;超声时间为5分钟。结论：最佳条件下制备的杨梅苷脂质体包封率较高,粒径分布好,质量稳定。     

乙型肝炎表面抗原疑难判定血清的研究

用中国药品生物制品检定所检定合格的国内外HBsAgEIA试剂及ABBOTT抗 HBs、抗 HBcEIA试剂 ,对所收集的 13份HBsAg疑难判定血清进行检测 ,并用PCR方法检测血清中HBVDNA ,结果显示国内外HBsAg试剂对部分HBVDNA阳性样品的检出率差异较大 ,提示这些样品可能为S基因突变株或HBsAg含量较低 ,因此 ,HBsAgEIA试剂的敏感度仍有待进一步提高 ,并应进一步研制检测S基因突变株的HBsAg诊断试剂。     

乙型肝炎表面抗原疑难判定血清的研究

用中国药品生物制品检定所检定合格的国内外HBsAg EIA试剂及ABBOTT抗-HBs、抗-HBc EIA试剂,对所收集的13份HBsAg疑难判定血清进行检测,并用PCR方法检测血清中HBV DNA,结果显示国内外HBsAg试剂对部分HBV DNA阳性样品的检出率差异较大,提示这些样品可能为S基因突变株或HBsAg含量较低,因此,HBsAg EIA试剂的敏感度仍有待进一步提高,并应进一步研制检测S基因突变株的HBsAg诊断试剂。