昆虫细胞的大规模培养

昆虫细胞的大规模培养李文青,肖成祖（北京军事医学科学院生物工程研究所,）昆虫细胞培养的鼻祖是德国人ｆｏｒｈａｒｄＢｅｎｄｉｃｔ（１８７８—１９５８）［１］,他在１９１５年发表了有关昆虫细胞培养的第一篇文章［２］。早期,昆虫细胞的培养是为了进行昆虫的生...     

人参培养细胞单细胞克隆的条件培养

来自细胞悬浮培养物的条件培养基能显著地促进人参培养细胞的单细胞在较低细胞植板密度培养时的克隆形成。每毫升含3×10³个细胞时,条件培养的植板率是普通平板培养的4倍。细胞悬浮培养12－16天时所制备的条件培养基活性最大,在一定浓度范围内随条件培养基浓度增加。细胞克隆植板率随之增加。条件培养基具有一定的生理作用专一性。看护培养和条件培养的比较,表明前者在细胞密度较低时能更有效地促进细胞克隆的形成和生长。条件培养基在4℃条件下贮存两周仍保持活性稳定,并且能耐受高温处理。当受到强酸或强碱处理其活性失去．但在弱酸或弱碱条件下稳定。     

鱼类的胚胎干细胞

胚胎干细胞(ES)是未分化的细胞培养物，来自动物的早期胚胎。它们能成为稳定的细胞系和长期冻存。在适当的条件下，ES细胞能分化成各种细胞类型，包括生殖细胞。这样，ES细胞就提供了一个有效的纽带，将动物基因组的体外和体内遗传操作连系起来。ES细胞的魅力就由其在产生和分析基因敲除老鼠中显现出来。目前，ES细胞技术仅见之老鼠，因其它脊椎动物的ES细胞的培养和建系难获成功。在鱼类，人们已做了大量的尝试。我们以青鳉(Oryzias latipes)作为建立鱼类ES细胞技术的模式，通过建立并应用无滋养层细胞的培养条件，获得了来自中期囊胚的ES细胞系。青鳉的ES细胞和老鼠的ES细胞有很多共同特征，如二倍体核型、分化潜力和形成嵌合体。因此，在鱼类建立和应用ES细胞技术是可能的。青鳉ES细胞的培养条件已成功地应用到其它鱼类如斑马鱼甚至海水鱼。本文旨在以青鳉为模式，综述获得和应用模式鱼和经济鱼ES细胞的主要进展和前景。     

红花细胞克隆的平板培养

在红花(Cathamus unctorrus)细胞克隆的平板培养中很多因素都能影响其植板率,如培养基的 pH 值,无机盐中的 NH_4NO_3、ZnSO_4、MnSO_4;有机酸中的柠檬酸、琥珀酸、苹果酸及延胡索酸,谷氨酰胺和精氨酸,葡萄糖,椰乳和水解乳蛋白等。向培养基中加入10mg/l 柠檬酸或3mg/l 琥珀酸能显著提高植板率。适量的人参寡糖及黑节草寡糖应用对促进红花细胞克隆生长取得很好效果。常规的高压灭菌最不利于细胞生长,在15磅/cm~2灭菌5分钟效果较好,过滤灭菌效果最好。     

杂交瘤116株细胞无血清培养基的研制

经逐步降低培液中血清含量,结合增添促细胞生长因子,已经建立了适宜116株杂交瘤细胞长期生长和传代的无血清培液配方。配方成分比较简单,蛋白含量为350μg/ml。在无血清培液巾培养的116株细胞,其抗体分泌水平低于用5％血消培液培养的约33％,其原因可能与细咆生长密度有关。改进培液配方或其他培养条件,如添加一定量的硫代甘油,有可能提高分泌抗体的水平。     

红豆杉细胞两相培养生产紫杉醇的研究

研究了两相培养系统中红豆杉细胞的生长与代谢规律,经４０天培养,细胞生物量为１７．８５ｇ／Ｌ（干重）,紫杉醇产量为３０．１９ｍｇ／Ｌ。     

植物细胞的两相培养技术

介绍了两相培养技术的原理,促进产物释放的方法以及该技术应用于植物次生代谢物生产的研究进展。     

人脐带血中内皮克隆形成细胞的分离和培养

目的:脐带血来源的内皮克隆形成细胞具有高度增殖、自我更新和血管生成的能力,是再生医学和母胎医学领域研究的热点。本研究旨在提出一种有效的、可靠的人脐带血中内皮克隆形成细胞分离和培养方法。方法:取抗凝脐血,采用密度梯度离心法分离单核细胞并进行贴壁培养,在细胞克隆形成但未融合成片时,进行单克隆的挑取再培养,最后对所得细胞进行表型和功能的鉴定。结果:所获细胞增殖能力强,形态单一,呈鹅卵石样,连续传代8次,未见细胞性状改变。接种到基质胶上,细胞可连接为管状、网状结构。能摄取培养液中的低密度脂蛋白并结合荆豆凝集素,细胞免疫荧光显示其表达典型的内皮细胞标志性分子CD31、e NOS、VE-Cadherin、v WF。结论:通过本研究的方法,我们从脐带血中获得足够数量和高纯度的内皮克隆形成细胞,这为进一步的实验研究提供了可靠的基础。     

人参培养细胞的单细胞克隆

培养基组成成分能影响人参培养细胞单细胞克隆的植板率。Ms培养基中2,4－D和KT需要一个适合的浓度比才能有效地促进细胞克隆的形成,其最佳浓度组合是2,4－D1．5mg／L和KT O．5mg／L。适合人参细胞克隆形成的NH₄N0₃浓度是400mg／L,CaCl₂.2H₂O浓度是750mg／L。向培养基中补加适量的琥珀酸、精氨酸和维生素等都能明显提高植板率。通过优化培养基的组成成分,细胞克隆的植板率可增加到2.34倍。悬浮培养两周左右的细胞平板培养最有利克隆形成,当细胞植板密度低于4×10³个细胞／ml时,几乎没有克隆形成。     

新疆紫草细胞生产阶段培养中细胞生长及产物合成的研究I：悬浮培养

新疆紫草细胞生产阶段培养时生物产量随接种量的增加而增大,但生物量的倍增数并不增大。色素产量只在一定范围内与接种量成正相关关系,超过一定范围反而下降。当选定适当接种量时,加大培养基的浓度可提高色素产率。扩大培养规模,色素产量下降。     

鱼类细胞克隆培养的研究

在哺乳类细胞中,细胞克隆培养已获得了广泛的应用,而在鱼类细胞中,尚未见到有关克隆化培养的报道。建立适合鱼类细胞的克隆培养技术,对于鱼类的细胞生物学、生物化学、病毒学、体细胞遗传学和细胞工程的研究,具有广泛的实用价值。我们成功地进行了鱼类细胞克隆的培养。现将主要试验结果作一简要报道。       

Vero细胞无血清培养技术的研究与应用

Vero细胞是世界卫生组织和我国生物制品规程认可的疫苗生产细胞系。随着对疫苗质量和安全性要求的不断提高,用无血清培养基取代含血清培养基培养Vero细胞已成为病毒疫苗生产的一个重要发展趋势。Vero细胞无血清培养的技术关键是研发或选择能支持细胞以贴附培养方式生长的无血清培养基。微载体培养是贴附依赖性细胞系规模化培养和病毒疫苗生产的有效技术途径。我们对Vero细胞无血清培养基的研发、Vero细胞无血清培养及病毒疫苗生产工艺做了讨论,对该领域存在的问题和发展策略进行了展望。     

鱼类细胞电融合的初步研究

电融合是一种细胞生物学新技术,它的融合率高、操作简便、无毒性、可在显微镜下直接观察融合过程,是细胞杂交与基因转移的有效手段之一。近几年来,这一技术已广泛用于动物、植物、微生物细胞和原生质体的融合1～4。但是,至今未见有电场诱导鱼类细胞融合的研究报道。我们采用国产元、器件,研制出一套供试验用的电融合装置,研究了电场诱导鱼类细胞的融合效应。       

鱼类培养细胞干扰素的诱导

对紫外线灭活的草鱼出血病病毒（ＧＣＨＶ）－Ｆ９株,在几种鲤科鱼类培养细胞中诱导产生干扰素的能力及影响干扰素产量的各因素进行了研究。纯化的ＧＣＨＶ在紫外线照射５分丧失感染性,但获得了在ＣＡＢ等５种鲤科鱼类培养细胞中高铲诱导产生干扰素的能力。干扰素的诱导需要病毒高复数感染细胞。干扰素主要在诱导后１４小时时内产生。培养上清中的新生牛血清对干扰素的产量有抑制作用。而在ＰＨ６．２－７．８范围内对干扰素产量无     

高产人参寡糖素培养细胞克隆系的筛选

人参（ＰａｎａｘｇｉｎｓｅｎｇＣ．Ａ．Ｍｅｙ．）培养细胞经细胞平板克隆,获得近３００个克隆系。克隆系在细胞生长速率和寡糖素含量及产率上均存在显著差异,且寡糖素产率和细胞生长之间有明显的相关性。经１１代连续继代培养观察及过氧化物酶同工酶谱特征分析,筛选到一株寡糖素产率高且稳定的克隆系ＰＧ－１８０,其平均生长速率是０．４９５ｇ于重／Ｌ·天,为原始株系的１．３９倍,平均寡糖素含量为１４．６９％干重,是亲本的１．６５倍,平均寡糖素产率是２．１８３ｇ／Ｌ,为原始株系的２．３２倍。比较克隆系ＰＧ－１８０和原始株系细胞悬浮培养时间进程发现,由人参培养细胞生产寡糖素的最佳细胞收获期为３周左右。     

Vero细胞微载体培养的化学成分明确无血清培养基的设计

目的：设计适用于Vero细胞微载体培养的化学成分明确无血清培养基。方法：以商品化的DMEM／F12合成培养基为基础培养基,应用Plackett—Burman实验设计和响应面分析法设计支持Vero细胞微载体培养的化学成分明确无血清培养基。结果：以细胞密度为评价指标,在单因素实验的基础上采用Plackett-Burman实验设计考察10种培养基添加成分对Vero细胞生长的影响,确定了3种对Vero细胞生长起明显促进作用的培养基添加成分,为胰岛素、血清素和腐胺。继而利用响应面法分析了这3种添加成分的最佳水平范围,设计了一种支持Vero细胞贴附培养的无血清培养基（VERO—SFM—A）。在Bellco搅拌式培养瓶中采用VERO-SFM．A和Cytodex1微载体培养Vero细胞,细胞密度由接种时的4×10^5cells／ml增加到培养6d后的22．3×10^cells／ml,细胞活力保持在96％以上。结论：VERO—SFM—A能够有效地支持Vero细胞在微载体表面固定化生长并达到较高的细胞密度,具有实际应用于Vero细胞微载体规模化培养的应用潜力。