柱孢鱼腥藻固氮酶防氧的呼吸保护

柱孢鱼腥藻生长在缺氮情况下,发现其固氮活性增加的同时也减少了对氧的敏感性。缺氮生长细胞的乙炔还原活性给氧抑制一半时的氧分压(pO_2)是0.5atm.,而有氮生长细胞的半抑制浓度为0.35atm.。这表明蓝藻有可能通过增加呼吸耗氧而提高了它的固氮酶活性。呼吸作用与固氮酶活性之间存在着密切的关系。无论在有氮、缺氮还是光诱导固氮酶形成的情况下,其固氮活性均随着呼吸速率的变化而变化。本研究结果,支持了柱孢鱼腥藻固氮酶的主要防氧手段是呼吸保护的观点。     

几种固氮蓝藻的固氮酶活性及其某些特性

对三种固氮蓝藻：固氮鱼腥藻(水生686)、柱孢鱼腥藻和鱼腥藻7120的整细胞及无细胞抽提液的固氮酶活性,进行了比较研究。水生686的整细胞酶活虽然不低(51．9毫米乙烯峰高／光密度／30分),仅次于柱孢鱼腥藻,但其无细胞抽提液的酶活却最低。这可能与它含有大量藻胶有关。研究了Mn^ 、Fe^ 对蓝藻固氮酶的作用,以及测定其在不同酶浓度下的反应动力学表明：柱孢鱼腥藻中不存在象深红螺菌中所看到的那种激活因子。用甲苯-乙醇溶液处理藻细胞,对固氮酶作原位测定,探索了它的氧损伤及氧保护机理。     

几种固氮蓝藻的固氮酶活性及其某些特性

对三种固氮蓝藻:固氮鱼腥藻(水生686)、柱孢鱼腥藻和鱼腥藻7120的整细胞及无细胞抽提液的固氮酶活性,进行了比较研究。水生686的整细胞酶活虽然不低(51.9毫米乙烯峰高/光密度/30分),仅次于柱孢鱼腥藻,但其无细胞抽提液的酶活却最低。这可能与它含有大量藻胶有关。研究了Mn++、Fe++对蓝藻固氮酶的作用,以及测定其在不同酶浓度下的反应动力学表明:柱孢鱼腥藻中不存在象深红螺菌中所看到的那种激活因子。用甲苯-乙醇溶液处理藻细胞,对固氮酶作原位测定,探索了它的氧损伤及氧保护机理。       

鱼腥藻(Anabaena)对氧敏感的固氮突变种

用紫外线和亚硝基胍,诱变筛选出两株具异形胞而不能在空气中固定分子氮的鱼腥藻Anabaena)突变种。突变表型是稳定的。在微氧条件下,能固定分子氮而生长,但固氮酶活很弱。酶活的高低与藻蓝素含量和光照强度成反相关。突变种细胞的固氮酶对氧非常敏感,反应气相中加入1%的氧对乙炔还原活力已有明显抑制,20%的氧完全阻抑固氮作用。除去氧后固氮酶重新合成,其过程受 NH_4~+和氯霉素阻遏。通过氮饥饿使藻蓝素含量降低,或降低光照强度,或加入二氯苯基甲基脲抑制光合放氧时,均可显著地提高突变种的固氮酶活力。突变种细胞还原氯代三苯四氮唑为甲(?)结晶的能力低于野生种。暗示突变种固氮对氧敏感,可能是由于细胞中清除氧的酶系统有缺损,以致营养细胞产生的活性氧对其本身固氮过程有抑制作用。     

四唑（Tetrazolium）对固氮鱼腥藻固氮和氢代谢的影响

固氮鱼腥藻(Anabaena azotica Ley)细胞能还原无色的TTC和NBT分别成为红色或蓝色的甲zan(formazan)沉淀。异形胞还原TTC的速率高于营养细胞。前异形胞及异形胞附近的营养细胞对NBT的还原作用最强。而异形胞对NBT不起还原作用。无论在异形胞形成红色甲zan或在营养细胞形成蓝色甲zan后都抑制固氮酶活性。NBT甲zan对固氮酶活性的抑制作用大于TTC甲zan,因为NBT氧化还原电位低于TTC。TTC和NBT两者都明显地抑制固氮鱼腥藻完整细胞的放氢。因鱼腥藻的放氢是由固氮酶催化的结果。四唑抑制放氢推想是由于它截取了固氮酶催化系统中的电子的缘故。固氮微生物(包括蓝色细菌和根瘤菌)对四唑还原与吸氢酶之间有无相关是一个争论的问题。一些学者认为分离豆科植物体的一些根瘤菌株培养于含有TTC的琼脂培养基,如还原,便可证明这些根瘤菌株能氧化氢;换言之,应用TTC的还原可作为一些根瘤菌的菌落具有吸氢酶的验证。相反,我们发现固氮鱼腥藻还原TTC和NBT之后,都没有影响吸氢的能力。因此,我们推想固氮鱼腥藻对四唑之还原与吸氢酶是没有直接的关系。     

四唑(Tetrazolium)对固氮鱼腥藻固氮和氢代谢的影响

固氮鱼腥藻(Anabaena azotica Ley)细胞能还原无色的TTC和NBT分别成为红色或蓝色的甲(月朁)(formazan)沉淀。异形胞还原TTC的速率高于营养细胞。前异形胞及异形胞附近的营养细胞对NBT的还原作用最强。而异形胞对NBT不起还原作用。无论在异形胞形成红色甲(月朁)或在营养细胞形成蓝色甲(月朁)后都抑制固氮酶活性。NBT甲(月朁)对固氮酶活性的抑制作用大于TTC甲(月朁),因为NBT氧化还原电位低于TTC。 TTC和NBT两者都明显地抑制固氮鱼腥藻完整细胞的放氢。因鱼腥藻的放氢是由固氮酶催化的结果。四唑抑制放氢推想是由于它截取了固氮酶催化系统中的电子的缘故。固氮微生物(包括蓝色细菌和根瘤菌)对四唑还原与吸氢酶之间有无相关是一个争论的问题。一些学者认为分离豆科植物体的一些根瘤菌株培养于含有TTC的琼脂培养基,如还原,便可证明这些根瘤菌株能氧化氢;换言之,应用TTC的还原可作为一些根瘤菌的菌落具有吸氢酶的验证。相反,我们发现固氮鱼腥藻还原TTC和NBT之后,都没有影响吸氢的能力。因此,我们推想固氮鱼腥藻对四唑之还原与吸氢酶是没有直接的关系。     

固定化固氮鱼腥藻细胞的固氮放氢

以2％海藻酸钙包埋鱼腥藻细胞进行固定化培养,鱼腥藻的固氮、放氢和吸氢活性均明显提高。固定化培养的鱼腥藻生长速度减缓,较高固氮活性维持的时间增长,对氧和铵的敏感度降低。以2％GaCl_2固化5min制成的胶珠较为理想。     

回转器模拟微重力刺激对不同品系稻田鱼腥藻代谢特性的影响

以稻田鱼腥藻空间搭载克隆株 (AoSR1 6)、回复再搭载克隆株 (AoSR1 6 1 7)和原始出发株 (AnabeanaoryzaHB2 3)为材料 ,通过回转器模拟微重力刺激实验 ,对不同品系稻田鱼腥藻的微重力生物学效应进行了分析。结果发现 ,模拟微重力刺激对稻田鱼腥藻不同品系均表现出一定的生长刺激效应 ,尤为空间飞行后的克隆株更为明显。比较三个品系在微重力刺激下的光合与呼吸活性 ,原始出发株的光合与呼吸活性明显高于空间搭载株。在回转器培养情况下 ,具有高固氮酶活性的克隆株 (AoSR1 6和AoSR1 6 1 7)所固定的氮 ,除了用于藻细胞正常的生命活动外 ,主要用于其生长增强效应 ,而藻胆蛋白累积量和氨分泌量较之对照培养时要少得多。对回转器培养后的稻田鱼腥藻进行单克隆分离 ,结果没有出现类似于空间搭载实验的性状分离现象。     

盐胁迫对柱胞鱼腥藻细胞结构和固氮作用的影响

在含KCl的条件下培养,柱胞鱼腥藻细胞膨大,球形化,色素质靠向细胞一侧,另一侧变成无色透明区。电镜检查,无色透明区形成液泡。此种结构改变是可逆的,CaCl2可抵消KCl的这种作用。在含KCl的无氮培养基中培养,柱胞鱼腥藻生长迟缓,细胞黄化,乙炔还原法测定固氮活性下降95％。     

盐胁迫对柱胞鱼腥藻细胞结构和固氮作用的影响

在含ＫＣｌ的条件下培养,柱胞鱼腥藻细胞膨大,球形化,色素质靠向细胞一侧,另一侧变成无色透明区。电镜检查,无色透明区形成液泡。此种结构改变是可逆的,ＣａＣｌ２可抵消ＫＣｌ的这种作用。在含ＫＣｌ的无氮培养基中培养,柱胞鱼腥藻生长迟缓,细胞黄化,乙炔还原法测定固氮活性下降９５％。     

镉对满江红（Azolla imbricata）-鱼腥藻（Anabaena azollae）共生体氮代谢的影响

在实验室条件下,研究了不同浓度(0、0.01、0.05、0.1、0.5mg/L)的Cd对满江红-鱼腥藻共生体异型胞频率,固氮酶、谷氨酰氨合成酶活性以及铵态氮、游离氨基酸、可溶性蛋白、总氮含量的影响.结果表明,在整个实验期间,0.01mg/L Cd处理对上述指标均没产生显著影响,说明满江红-鱼腥藻共生体对Cd具有较强的耐性.当培养液中Cd浓度≥0.05mg/L时,随溶液中Cd浓度的增加和处理时间的推移,异型胞频率、固氮酶活性、谷氨酰氨合成酶活性、可溶性蛋白含量和总氮含量逐渐下降,而铵态氮含量在处理初期显著降低,随后迅速增加,游离氨基酸含量则逐渐增加.研究结果表明高浓度的Cd处理导致满江红-鱼腥藻共生体氮代谢的紊乱,最终造成氮素积累量的下降.     

蓝藻球形体的分离,培养及再生

在高渗溶液中,用0.05%溶菌酶和2—5mmol·1~(-1)EDTA 处理蓝藻柱孢鱼腥藻、多变鱼腥藻和组囊藻细胞。5—8h 后,70—90%的细胞转为对渗透压敏感的球形体(Spheroplast),又称原生质球。研究了藻的不同培养条件对球形体形成率的影响。测定了 EDTA 处理藻纽胞后外膜脂多糖的释放量。在高渗溶液中,藻细胞和经酶处理获得的球形体的光合放氧活性明显下降,固氮种类的固氮活性失去。饲养层法、固体混合法和含有0.5mg·1~(-1)BA 的液体悬滴培养的柱孢鱼腥藻的球形体,9天后出现再生藻落;在固体混合法培养中获得了组囊藻球形体的再生藻落。在第4天的悬滴培养物中,可以看到球形体发生第一次细胞分裂。再生藻细胞和酶处理物中残留细胞的抗溶菌酶特性有差异。     

氮、锰、硫缺乏对蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa光合产氢及其生长的影响

本实验通过研究缺氮、缺锰和缺硫对蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa产氢的影响,发现缺氮、缺锰及缺硫条件下该藻均能产氢,但在缺氮条件下产氢量最高,约为88.613μL H2/mgChla,分别是对照组、缺锰和缺硫实验组产氢量的4.61倍、1.92倍和3.63倍。通过对光合、呼吸及生长的比较研究,发现缺锰对该藻光合、呼吸及生长的影响要小于缺氮和缺硫;与正常培养条件相比,缺锰、缺硫抑制藻细胞的光合放氧和生长,对呼吸影响小,而缺氮不仅最大程度抑制光合放氧和生长,同时使呼吸作用增强,这为进一步优化该藻产氢条件及研究其产氢机制提供了线索。     

洱海螺旋鱼腥藻生长生理特性的初步研究

近年来,洱海正处于中营养水平向富营养湖泊的过渡阶段,蓝藻水华也频繁发生。本文作者在洱海大规模水华暴发期间,分离、纯化了水华优势种螺旋鱼腥藻,并对其生长生理特性进行了初步研究,以期为探讨洱海鱼腥藻水华发生的环境影响因素提供基础的参考资料。实验结果表明,氮含量1.5mmol/L、磷含量12µmol/L、光照强度30E/ m·s、pH值8－10及温度25℃时,螺旋鱼腥藻生长状况最好,生物量及相对生长速率较高。不同氮、磷浓度下的氮磷代谢活性表明：氮浓度在0－0.36mmol/L时,硝酸还原酶活性随着氮浓度的增加而增强;氮浓度在0.36－6 mmol/L时,酶活性由其生长状况决定,生长越好,酶活性越高。碱性磷酸酶受磷影响较大,随着磷浓度的增加其活性逐渐减弱,磷充足时,氮对其活性并无显著影响。此外,洱海螺旋鱼腥藻可在低的氮、磷浓度下生长,这与其氮磷代谢活性的调节作用有关。     

氧对固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu 62固氮酶活性的调节作用

本文研究了在好气条件下,在以谷氨酸为氮源的液体培养基中,固氮螺菌(Azospirllumbrasilense)Yu62固氮酶形成的条件及溶氧压对固氮酶活性的影响。厌氧使整体细胞固氮酶迅速失活;而见氧后固氮酶又重新恢复活性。Western blotting实验证实,这种可逆失活的分子基础,是由于固氮酶铁蛋白-亚基被修饰和去修饰。呼吸抑制剂KCN对固氮酶活性的抑制,亦是由于固氮酶铁蛋白被修饰。因此推论细胞内的能量状态可能是启动固氮酶活化酶系统的重要信号。谷氨酰胺合成酶的抑制剂MSX不能去除厌氧和KCN引起的抑制作用。结果表明：固氮酶活性的NH+4和厌氧关闭可能通过不同的机制起作用。     

水稻田中固氮蓝藻固氮活力的昼夜变化

蓝藻的固氮和光合作用密切联系,为了解固氮蓝藻在田间固氮活力的变化,我们对田间的蓝藻在不同生境下的固氮活力和昼夜变化进行现场(in situ)测定发现: 1.在不同生境中生长的各种固氮蓝藻的固氮活力的昼夜变化节律不尽相同,一般为一天出现一个活力高峰,在薄膜复盖培养池中高峰出现在中午(13∶00),而露田则在9∶00—12∶00之间;个别还出现两峰现象。2.不同种类的固氮蓝藻在田间的固氮活力有明显差别,混合藻种的酶活力最高,类颤鱼腥藻次之。3.不同生长期的类颤鱼腥藻的酶活力有明显不同。生长旺盛的活力高,衰老的活力低。4.稻田中不同小生境对蓝藻固氧酶活力有显著的影响,在水底生长的类颤鱼腥藻移至水面,其活力明显降低。根据蓝藻在田间的固氮活力的昼夜交化以及生境改变和生长状态对活力的影响,依估算生长良好的蓝藻在水田的固氮量最高可达285克氮/天/1000斤藓藻,最低51克氮,平均163克氮。假如在田间生长连续10天,即可固定1630克氮,相当于16.3斤的硫酸铵。但和测定的较高固氮活力(=258克氮/天相当于25.8斤硫铵)相比,固氮活力的潜力是相当大的。如能提高固氮蓝藻在田间的产量, 则其固氮量可大大增加。     

蓝藻固氮对人工湿地颗粒物有机氮的贡献

固氮蓝藻能为水生态系统输入新氮,生物固氮对水体氮的贡献观点不一。人工湿地中固氮蓝藻输入的新氮对除氮效率的影响仍不明晰。本研究通过连续监测,比较了北京野生动物救护中心水禽栖息的人工湖和净化其水质的人工湿地中的浮游植物组成、颗粒物有机氮(PON)和水体固氮速率(Rn),分析固氮蓝藻鱼腥藻属(Anabaena)和非固氮蓝藻微囊藻属(Microcystis)藻细胞密度的季节变化,及其与水体PON和Rn相关性。通过IsoSource软件分析15N自然丰度,计算了各个来源(大气N_2、鸟粪、沉积物和水体硝酸盐)对人工湖和人工湿地中PON的贡献率。结果显示,人工湖中鱼腥藻和微囊藻交替爆发,Rn与PON和鱼腥藻细胞密度均呈正相关(P0.05),说明鱼腥藻输入的新氮可能被微囊藻利用转化为PON。大气N_2对生长季人工湖和人工湿地PON贡献率分别为0.5%~82.0%和50.0%~86.0%,9月水体固氮速率达到最高时大气N_2对PON贡献率可达80%以上。本研究表明,人工湖中的鱼腥藻固氮能为微囊藻提供可利用氮,可能是人工湖夏季微囊藻水华的原因之一。由于浮游植物在表流人工湿地较难沉淀和吸附,浮游植物增多使人工湿地去除PON的能力降低,因此鱼腥藻固氮可能间接降低人工湿地除氮能力。     

镇海水库拟柱孢藻的分离鉴定和氮磷对其生长的影响

以分离自广东省镇海水库的拟柱孢藻N8为对象, 探究其在不同磷浓度及氮磷浓度组合下的生长情况。结果表明, 拟柱孢藻N8对磷的适应范围很宽, 在0.025.12 mg/L磷浓度下均能生长, 最适生长磷浓度范围为0.165.12 mg/L, 磷浓度的升高能显著延长拟柱孢藻的对数生长期和提高生物量。动力学分析表明, 拟柱孢藻N8有较低的KSP值, 对磷元素的亲和性较高, 在磷营养贫乏的环境下更容易形成优势。在氮磷组合实验中, 低氮(0.5 mg/L)显著抑制拟柱孢藻的生长, 且这种生长抑制不受磷浓度的影响; 而在低磷(0.04 mg/L)条件下, 水体中氮浓度的增加会显著促进拟柱孢藻的生长, 拟柱孢藻在高氮中磷和高氮高磷下的生长显著优于其他氮磷组合条件。研究表明, 广东省水库拟柱孢藻的生长受磷的限制较弱, 氮是其生长的决定因子。       

满江红鱼腥藻(Anabaena azollae)和柱孢鱼腥藻(A.cylindrica)营养细胞和异形胞色素的种类

满江红鱼腥藻和柱孢鱼腥藻营养细胞和异形胞的液氮低温吸收光谱表明两种细胞含有叶绿素a、藻蓝素和β-胡萝卜素。液氮低温荧光发射光谱表明:柱孢鱼腥藻营养细胞存在藻蓝素、别藻蓝素和两个光系统的叶绿素a,柱孢鱼腥藻异形胞存在藻蓝素和系统Ⅰ叶绿素a。荧光发射光谱的685nm荧光发射仅为微弱突起。满江红鱼腥藻异形胞亦存在藻蓝素和系统Ⅰ叶绿素a,缺少系统Ⅱ叶绿素a。推断满江红鱼腥藻和桩孢鱼腥藻营养细胞分化为异形胞时,伴随光系统Ⅱ的改组。系统Ⅱ叶绿素a消退和藻胆色素含量显著减少。     

单细胞水平解析土壤固氮鱼腥藻的碳氮固存过程研究进展

固氮鱼腥藻作为光能自养型微生物,具备良好的碳氮固存能力。施加固氮鱼腥藻能够提升土壤肥力并减少化肥施用量。然而,解析固氮鱼腥藻在土壤中的碳氮固存机制以及不同菌株固存效率差异仍有待深入研究。因此,从单细胞水平对土壤固氮鱼腥藻菌株进行筛选和碳氮固存过程的研究至关重要。针对固氮鱼腥藻在单细胞水平上发生的复杂而动态的元素变化过程,本研究综述了土壤固氮鱼腥藻碳氮固存过程,并探讨了利用纳米二次离子质谱法与稳定同位素标记结合(nano-secondary ion mass spectrometry-stable isotopic probing, NanoSIMS-SIP)技术和拉曼光谱成像与稳定同位素标记结合(Raman spectroscopy imaging-stable isotopic probing, Raman-SIP)技术解析单细胞水平上的碳氮元素的时空分布的原理、进展与难点。重点关注了单细胞稳定同位素技术定量可视化固氮鱼腥藻碳氮固存的最新技术发展与应用。同时,对该类可视化技术的未来研究进行了展望。本研究对于理解固氮鱼腥藻在土壤中的碳氮固存机制和固氮效率差异具有重要的科学意义,为农业生产中减少化肥使用、提高土壤肥力提供理论依据。