过量表达烟酸转磷酸核糖激酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

大肠杆菌NZN111厌氧发酵的主要产物为丁二酸,是发酵生产丁二酸的潜力菌株。但是由于敲除了乳酸脱氢酶的编码基因 (ldhA) 和丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因 (pflB),导致辅酶NADH/NAD+不平衡,厌氧条件下不能利用葡萄糖生长代谢。构建烟酸转磷酸核糖激酶的重组菌Escherichia coli NZN111/pTrc99a-pncB,在厌氧摇瓶发酵过程中通过添加0.5 mmol/L的烟酸、0.3 mmol/L的IPTG诱导后重组菌的烟酸转磷酸核糖激酶 (Nicotinic acid phosphor     

过量表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

大肠杆菌NZN111是敲除了乳酸脱氢酶的编码基因(ldhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因(pflB)的发酵生产丁二酸的潜力菌株。厌氧条件下NADH不能及时再生为NAD+,引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡,最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖生长代谢。nadD为催化NAD(H)合成途径中烟酸单核苷酸(NaMN)生成烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)的烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(Nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase,NAMNAT)的编码基因,通过过量表达nadD基因能够提高NAD(H)总量与维持合适的NADH/NAD+比例。文中构建了重组菌E.coli NZN111/pTrc99a-nadD,在厌氧摇瓶发酵过程中通过添加终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达,重组菌E.coli NZN111/pTrc99a-nadD中NAD+和NADH的浓度分别比宿主菌E.coli NZN111提高了3.21倍和1.67倍,NAD(H)总量提高了2.63倍,NADH/NAD+从0.64降低为0.41,使重组菌株恢复了厌氧条件下生长和代谢葡萄糖的能力。重组菌与对照菌相比,72 h内可以消耗14.0 g/L的葡萄糖产6.23 g/L的丁二酸,丁二酸产量增加了19倍。     

果糖和麦芽糖作为有氧碳源对大肠杆菌NZN111两阶段发酵中厌氧发酵的影响

为了了解磷酸转移酶转运系统 (PTS) 依赖和非PTS依赖代谢的糖类对大肠杆菌生产琥珀酸的影响,进行了两阶段培养,有氧阶段采用PTS依赖型的果糖或非PTS依赖型的麦芽糖作为丙酮酸甲酸裂解酶 (PFL) 和乳酸脱氢酶 (LDH) 双突变株NZN111的碳源,研究其对NZN111厌氧阶段代谢葡萄糖的影响。5 L罐发酵结果表明,以果糖和麦芽糖为碳源有氧培养的细胞恢复了在厌氧条件下快速代谢葡萄糖的能力,琥珀酸和丙酮酸成为主要代谢产物,最终琥珀酸得率分别为0.84和0.75 mol/mol,丙酮酸得率分别达到了0.65和0.83 mol/mol,琥珀酸和丙酮酸终浓度比分别为1.73∶1和1.21∶1。果糖和麦芽糖培养的NZN111与葡萄糖培养的菌体代谢的明显差异推测是cyclic AMP (cAMP) 依赖型和非cAMP依赖型的分解代谢物阻遏调控这两种机制共同作用的结果。     

产丁二酸工程菌的构建及其厌氧发酵

为了考察过量表达苹果酸酶对于E.coli NZN111(ldhA::Kan pfl::Cam)厌氧发酵产丁二酸的影响, 将连接有苹果酸酶基因sfcA的表达载体pTrc99a-sfcA转化进NZN111中, 构建了重组NZN111(pTrc99a-sfcA)。0.5 mmol/L IPTG诱导8 h后, 测定的苹果酸酶比酶活为30.67 u/mg, 比受体菌提高了140倍。采用两阶段发酵模式, 结果表明: 过量表达的苹果酸酶在NZN111体内催化了从丙酮酸到苹果酸的逆向反应, 丁二酸是发酵过程中积累的主要有机酸, 且当加入0.7 mmol/L IPTG诱导, 初始葡萄糖糖浓度为18.5 g/L时, 选择对数生长期后期的菌种以10%的接种量转入厌氧发酵, 发酵结束时发酵液中丁二酸的浓度为12.84 g/L, 对葡萄糖的收率为69.43%, 乙酸为0.58 g/L, 二者浓度比为22:1, 没有检测到甲酸和乳酸。构建的菌种具有高产丁二酸和副产物极少的优点, 在同类菌种中处于先进水平。     

碳源对重组大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的影响

研究了在好氧培养基中分别添加不同碳源对两阶段发酵菌体生长、酶活及代谢产物分布的影响,结果表明添加4mmol/L葡萄糖和12,54,80mmol/L乙酸钠均可以提高好氧阶段的菌体密度和相关酶活。将不同条件下培养的菌体转接厌氧发酵后,厌氧阶段的酶活和代谢产物分布也发生改变。进一步对酶活及代谢产物分析表明：Escherichia coli NZN111(sfcA)厌氧发酵过程中,磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)是产丁二酸的关键酶,丙酮酸激酶(PYK)主要和副产物丙酮酸的积累有关,异柠檬酸裂解酶(ICL)对丁二酸产量也有一定影响。好氧培养基中添加80mmol/L乙酸钠,厌氧发酵结束时丁二酸的质量收率可达89.0%,相比对照提高了16.6%。     

共表达烟酸转磷酸核糖激酶和丙酮酸羧化酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

构建了共表达烟酸转磷酸核糖激酶(NAPRTase)和丙酮酸羧化酶(PYC)的重组质粒pTrc99a-pncB-pyc,并考察了重组菌E.coli NZN111/pTrc99a-pncB-pyc生产丁二酸的能力。结果表明:重组菌NZN111/pTrc99a-pncB-pyc的NAPRTase和PYC的比酶活达到最高,分别为20.75和1.04 U/mg,同时,辅酶NADH、NAD+及NAD(H)总量达到最高。厌氧摇瓶发酵结果:48 h能够消耗17.5 g/L的葡萄糖生成14.08 g/L的丁二酸,而丙酮酸的产量大幅度降低,仅为0.11 g/L。本研究为基因工程菌大肠杆菌厌氧条件下发酵生产丁二酸提供了一定的基础。     

循环利用重组大肠杆菌细胞转化合成丁二酸

研究了回收丁二酸发酵液中的大肠杆菌进行细胞转化的可行性,以转化率和生产效率为指标,考察了不同菌体浓度、底物浓度、pH调节剂对细胞转化的影响。发酵结果表明大肠杆菌可以在仅含有葡萄糖和pH调节剂的水环境中转化生产丁二酸,并确定了最佳的转化条件为:细胞浓度(OD600)50,底物浓度40g/L,缓冲盐为MgCO3。基于优化好的条件,在7L发酵罐中进行重复批次转化,第1次转化的转化率和生产效率分别达到91%和3.22g/(L·h),第2次转化的生产效率和转化率达到了86%和2.04g/(L·h),第3次转化的转化率和生产效率分别达到了83%和1.82g/(L·h)。     

大肠杆菌AFP111菌体回收连续转化生产丁二酸

在利用大肠杆菌AFP111厌氧发酵生产丁二酸过程中,随着产物丁二酸的不断积累,菌体活力和产酸能力逐渐降低,而通过回收菌体在新鲜培养基中重复发酵,可延长厌氧发酵时间,但是丁二酸生产效率较低。为了提高菌体回收丁二酸的转化效率,通过在回收菌体时有氧诱导 3 h,以纯水为培养基,进行丁二酸转化发酵。在连续进行 3 批次的发酵后,丁二酸的总产量和最终收率分别为 56.50 g/L和90%,生产速率达到了 0.81 g/(L·h),比未诱导情况下的生产速率提高了13%。     

产L-苹果酸重组大肠杆菌的构建

基于产琥珀酸重组大肠杆菌E.coli B0013-1050的琥珀酸合成途径,利用Red同源重组技术结合Xer/dif重组系统敲除富马酸酶基因fumB、fumC,苹果酸酶基因maeB,构建L-苹果酸合成途径,最终得到重组大肠杆菌E.coli2030,该菌株在15 L发酵罐中,产L-苹果酸12.5 g/L,葡萄糖-苹果酸转化率为52.1%,同时对发酵产物中主要杂酸丙酮酸和琥珀酸的生产原因进行了初步的探讨与分析。为进一步提高L-苹果酸的转化率,整合表达来源于黄曲霉的苹果酸脱氢酶基因,构建重组菌E.coli 2040,在15 L发酵罐中产L-苹果酸14 g/L,葡萄糖-苹果酸转化率提高到60.3%。     

琥珀酸脱氢酶或琥珀酰辅酶A合成酶缺失促进大肠杆菌积累5-氨基乙酰丙酸

5-氨基乙酰丙酸 (ALA) 是生物体内四吡咯类化合物的合成前体,在农业及医药领域应用广泛,是极具开发价值的高附加值生物基化学品。目前利用外源C4途径的重组大肠杆菌发酵生产ALA的研究主要利用LB培养基并添加葡萄糖和琥珀酸、甘氨酸等合成前体,成本较高。琥珀酸在C4途径中以琥珀酰辅酶A的形式直接参与ALA的合成。文中在以葡萄糖为主要碳源的无机盐培养基中研究了琥珀酰辅酶A下游代谢途径琥珀酸脱氢酶编码基因sdhAB和琥珀酰辅酶A合成酶编码基因sucCD缺失对ALA积累的影响。与仅表达异源ALA合成酶的对照菌株相比,sdhAB和sucCD缺失菌株ALA的产量分别提高了25.59%和12.40%,且ALA的积累不依赖于琥珀酸的添加和LB培养基的使用,从而大幅降低了生产成本,显示出良好的工业应用前景。     

进化代谢选育高渗透压耐受型产琥珀酸大肠杆菌

在以碳酸钠为酸中和剂的大肠杆菌两阶段发酵产琥珀酸的过程中,由于Na+的积累造成发酵体系中渗透压的提高,严重抑制了琥珀酸的产物浓度。为了增强大肠杆菌对渗透压的耐受性,考察了利用进化代谢方法筛选高渗透压耐受型高产琥珀酸大肠杆菌菌株的可行性。进化代谢系统作为一种菌株突变装置,可以使菌体在连续培养条件下以最大的生长速率生长。以NaCl为渗透压调节剂,通过在连续培养装置中逐步提高NaCl浓度使菌体在高渗透压条件下快速生长,最终得到了一株高渗透压耐受型琥珀酸生产菌株Escherichia coli XB4。以碳酸钠为酸中和剂,在7 L发酵罐中利用Escherichia coli XB4进行两阶段发酵,厌氧培养60 h后,琥珀酸产量达到了69.5 g/L,琥珀酸生产速率达到了1.81 g/(L.h),分别比出发菌株提高了18.6%和20%。     

A cost effective fermentative production of succinic acid from cane molasses and corn steep liquor by Escherichia coli

AIM: Development and optimization of an efficient and inexpensive medium for succinic acid production by Escherichia coli under anaerobic conditions. METHODS AND RESULTS: Initially, 0.8 gl(-1) of succinic acid was produced in 60 h in 300-ml medium. On optimization, glucose and peptone were replaced by cane molasses and corn steep liquor. Three hundred ml of this medium was inoculated with 4% (v/v) of seed inoculum, incubated at 39 degrees C for 72 h, resulted in 7.1 gl(-1) of succinic acid in 36 h. Scale up in a 10-l fermentor under conditions of controlled pH and continuous CO2 supply in this medium resulted in 17 gl(-1) of succinic acid in 30 h. CONCLUSIONS: A ninefold increase in succinic acid production was obtained in 500-ml anaerobic bottles with optimized medium having cane molasses and corn steep liquor as against initial medium containing glucose and peptone. However, a subsequent scale up in a 10-l fermentor resulted in a 2.5-fold increase in succinic acid production as against optimized medium used in 500-ml anaerobic bottles. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: Succinic acid production was enhanced in medium consisting of inexpensive carbon and nitrogen sources in a shorter span of time.     

Increased production of succinic acid in Escherichia coli by overexpression of malate dehydrogenase

Escherichia coli NZN111 is a double mutant with inactivated lactate dehydrogenase and pyruvate formate-lyase. It cannot utilize glucose anaerobically because of its unusually high intracellular NADH/NAD(+) ratio. We have now constructed a recombinant strain, E. coli NZN111/pTrc99a-mdh, which, during anaerobic fermentation, produced 4.3 g succinic acid l(-1) from 13.5 g glucose l(-1). The NADH/NAD(+) ratio decreased from 0.64 to 0.26. Furthermore, dual-phase fermentation (aerobic growth followed by anaerobic phase) resulted in enhanced succinic acid production and reduced byproduct formation. The yield of succinic acid from glucose during the anaerobic phase was 0.72 g g(-1), and the productivity was 1.01 g l(-1) h(-1).