矮牵牛编码F3′5′H的蓝色基因表达载体构建及转化

类黄酮3',5'羟基化酶(Flavonoid-3',5'hydroxylase,F3'5'H)是花色苷代谢途径中的一个关键酶,能使花色素合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素,从而使花色向蓝紫色偏移.本研究从蓝紫色矮牵牛(Petunia hybrida)花瓣中克隆了编码F3'5,H的蓝色基因Hf1,并通过PCR技术获得百合花特异表达启动子(PchsA),将百合PchsA与Hf1基因融合,构建了百合花特异表达启动子调控的Hf1基因植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化粉红色矮牵牛.抗性筛选和PCR检测鉴定转基因植株,结果表明,成功地获得了转基因阳性植株.     

矮牵牛编码 F3'5'H的蓝色基因表达载体构建及转化

类黄酮3',5'羟基化酶(Flavonoid-3',5'hydroxylase,F3'5'H)是花色苷代谢途径中的一个关键酶,能使花色素合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素,从而使花色向蓝紫色偏移.本研究从蓝紫色矮牵牛(Petunia hybrida)花瓣中克隆了编码F3'5,H的蓝色基因Hf1,并通过PCR技术获得百合花特异表达启动子(PchsA),将百合PchsA与Hf1基因融合,构建了百合花特异表达启动子调控的Hf1基因植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化粉红色矮牵牛.抗性筛选和PCR检测鉴定转基因植株,结果表明,成功地获得了转基因阳性植株.     

毛白杨PtSEP3-1基因启动子的克隆分析及其表达载体构建

SEP(SEPALLATA)类基因属于花器官发育ABCDE模型中的E类基因,拟南芥中的研究表明该类基因可能具有控制花器官形态发育以及激活其它类型基因的功能,是一类花发育过程中的关键基因。因此,研究杨树SEP类基因启动子表达特性对于杨树的开花调控研究具有重要意义。本文根据毛白杨SEP3基因和毛果杨基因组序列设计引物,通过PCR获得了PtSEP3-1基因上游2000bp的序列。序列分析结果表明该序列具有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量光响应元件ACE、Box I和Box4等,此外还有脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件GARE-motif以及胁迫响应元件HSE、TC-richrepeats等。进一步构建了一个以PtSEP3-1启动子驱动GUS基因的植物表达载体pPtSEP3-1protest,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。     

油菜种子特异表达napin基因启动子的克隆及序列分析

通过PCR扩增,从油菜（Brassica napus cv.XY15)中克隆了种子特异表达napin基因启动子,序列分析表明,该启动子有1147个核苷酸,与已报道的序列比较,其核苷酸的同源性为99.9%和99.4%,这是一个新的napin基因启动子,已将其登录到GenBank,登录号为AF420598.     

骨骼肌特异表达载体的构建与验证

目的:构建肌肉特异性表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶的肌肉特异性载体,证明其表达的有效性.方法:化学合成292bp的带有肌肉特异性转录因子结合位点的DNA序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1 - SF,4w龄C57BL/6小鼠肌肉注射该重组载体,RT - PCR检测证明其表达有效性.结果:DNA测序结果证明合成的292 bp片段带有肌肉特异性表达元件;PCR鉴定显示启动子片段正确地插入到目的基因上游;RT - PCR鉴定显示肌肉内ω-3脂肪酸去饱和酶基因得到有效转录.结论:该试验为在转基因动物的肌肉中表达外源基因奠定了基础.     

大豆球蛋白G1启动子的克隆及植物表达载体构建

从大豆冀nf37和冀豆15中克隆了大豆球蛋白G1基因的启动子片段。序列分析表明,两种启动子片段均为688bp,与GenBank现有的3种启动子序列(四川大豆(DQ250808)、南农87-c38(AY649096)和Dare(X15121))间的同源性在96.4%～99.6%之间。其中来自冀nf37的启动子片段除Legumin盒上有一个碱基差异外,其它元件与DQ250808完全相同,据此推测该启动子片段具有种子特异性启动子活性。将其与已有γ-生育酚甲基转移酶基因连接,构建了种子特异性表达载体pBG1TMT,为通过代谢工程手段调控油料作物种子维生素E组成、提高其营养品质奠定了基础。     

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3 (AP3)在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育.研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子.因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用.本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥(Arabido-psis thaliana) AP3基因启动子序列(U30729)设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plus DNA聚合酶扩增了长度为1 767 bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其GenBank登录号为FJ619533.Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18 (AL132971) 9 264～11 030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白(CAB81799),说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子.PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等.本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3::GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础.     

拟南芥AtNHX5基因的cDNA克隆及其正义、反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法从拟南芥品种Landsberg的实生苗叶片中克隆AtNHX5基因的cDNA,核酸序列表明该基因编码区为1 554 bp,编码538个氨基酸.与GenBank发表的序列(AF490589)相比,有三处碱基不同,分别为850 bp处的G(GenBank的为A)、904 bp处的T(A)、985处的G(A).将该基因分别正向或反向置于CaMV35S启动子之后,可构建正义、反义表达载体.     

种子特异性启动子(napinB promoter)分离、表达载体构建及转基因植物获得

利用PCR技术从油菜Brassica napus H165基因组DNA中分离了napinB启动子。序列分析表明,扩增片段(nap300)与文献报道的napinB启动子相应区域的同源性为97%。将其与gus连接构建种子特异性表达载体,农杆菌介导转化烟草。PCR、Southern结果显示,nap300已整合到烟草基因组DNA中,获得了转基因植株。     

嗜热脂肪芽孢杆菌启动子克隆载体pFDC4和表达型载体pFDC11的构建

以pPL703的衍生质粒pPGV5为载体,从嗜热脂肪芽孢杆菌CU21总DNA的Sau 3A酶切产物中得到1个0.54kb的启动子片段,它能促进载体上的无启动子的cat-86基因在嗜热脂肪芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌中表达。这一片段以正、反向插入pPGV5载体,都能使重组质粒转化CU21原生质体的效率提高10~(?)至10(?)倍。Southern杂交实验表明,这一启动子片段与Imanaka等报道的来自CU21中的隐蔽性质粒pBS02的能提高转化效率的1.6kb Eco RI片段是同源的。利用所得到的0.54kb Sau 3A片段构建了新的启动子克隆载体pFDC4和表达型载体pFDC11,二者都能以很高的效率转化CU21原生质体。     

Promoter analysis of the chalcone synthase (chsA) gene of Petunia hybrida: a 67 bp promoter region directs flower-specific expression

In order to scan the 5 flanking region of the chalcone synthase (chs A) gene for regulatory sequences involved in directing flower-specific and UV-inducible expression, a chimaeric gene was constructed containing the chs A promoter of Petunia hybrida (V30), the chloramphenicol acetyl transferase (cat) structural sequence as a reporter gene and the chs A terminator region of Petunia hybrida (V30). This chimaeric gene and 5 end deletions thereof were introduced into Petunia plants with the help of Ti plasmid-derived plant vectors and CAT activity was measured. A 220 bp chs A promoter fragment contains cis-acting elements conferring flower-specific and UV-inducible expression. A promoter fragment from –67 to +1, although at a low level, was still able to direct flower-specific expression but could not drive UV-inducible expression in transgenic Petunia seedlings. Molecular analysis of binding of flower nuclear proteins to chs A promoter fragments by gel retardation assays showed strong specific binding to the sequences from –142 to +81. Promoter sequence comparison of chs genes from other plant species, combined with the deletion analysis and gel retardation assays, strongly suggests the involvement of the TACPyAT repeats (–59 and –52) in the regulation of organ-specificity of the chs A gene in Petunia hybrida. We also describe an in vitro organ-specific transient expression system, in which flower or purple callus protoplasts are used, that enables us to pre-screen organ-specific expression of a chimaeric reporter gene.     

矮牵牛花同源异型基因fbp2的克隆及其对烟草花形态的影响

以矮牵牛（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ　Ｌ．）栽培品种为材料,取开放前的花蕾分离ｍＲＮＡ,反转录合成ｃＤＮＡ,以ｃＤＮＡ为模板,通过ＰＣＲ扩增,对获得的目的片段进行序列分析。结果表明,分离的目的片段含有６８６个核苷酸（含有起始密码和终止密码）。核苷酸序列与文献报道相比,同源率为９９．６％,只有３个碱基发生改变,５’端的ＭＡＤＳ盒区域完全相同。将得到的矮牵牛花同源异型基因ｆｂｐ２的ｃＤＮＡ（ｙｆｂｐ２）与ＣａＭＶ３５５启动子和ＮＯＳ３’终止子融合,构建了表达载体ｐＢＢＰ２。表达载体通过农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４）介导转化烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）叶片,在含有１００ｍｇ／Ｌ卡那霉素的抗性培养基上再生成株。对抗性株进行总ＤＮＡＳｏｕｔｈｅｒｎ杂交和总ＲＮＡ的点杂交,证明目的基因已导入烟草细胞中,整合到烟草基因组上,并且在烟草细胞中转录。同源异型基因ｆｂｐ２导入烟草后导致烟草花型改变,在雄蕊上产生了花瓣。     

徐州医学院病原生物学与免疫学教研室

目的:建立高活性的PSA启动子荧光素酶报告载体。方法:提取前列腺癌细胞PC-3总DNA,PCR扩增出PSA启动子片段,建立PSA启动子荧光素酶重组载体PGL3-psap,通过脂质体介导将重组载体转染到前列腺癌细胞PC-3中,使用荧光素酶检测系统检测其活性。结果:DNA测序结果表明成功构建荧光素酶重组载体PGL3-psap,荧光素酶检测显示重组载体在前列腺癌细胞PC-3中有较强活性。结论:本研究成功构建了具有高度活性的PSA启动子荧光素酶报告载体,为进一步研究前列腺癌的诊断和治疗提供了实验基础。     

Promoter activity of a putative pollen monosaccharide transporter in Petunia hybrida and characterisation of a transposon insertion mutant

Summary. For the growth of the male reproductive cells of plants, the pollen, the presence of sufficient sucrose or monosaccharides is of vital importance. From Petunia hybrida a pollen-specific putative monosaccharide transporter designated PMT1 (for petunia monosaccharide transporter) has been identified previously. The present work provides an in-depth analysis and characterisation of PMT1 in the context of pollen development with the GUS reporter gene and an insertion mutant. The promoter of the pollen-specific putative PMT1 gene has been isolated by inverse PCR and sequenced. Analysis of plants transformed with the promoter-GUS fusion confirmed the specificity of this gene, belonging to the late pollen-specific expressed genes. GUS activity was detected even after 24 h of in vitro pollen germination, at the pollen tube tip. To elucidate the importance of PMT1 for gametophyte development and fertilisation, we isolated a mutant plant containing a transposon insertion in the PMT1 gene by the dTph1 transposon-tagging PCR-based assay. The PMT1 mutant contained a dTph1 insertion in position 1474 bp of the transcribing part of the gene, before the last two transmembrane-spanning domains. Analysis of the progeny of the heterozygous mutant after selfing revealed no alterations in pollen viability and fertility. Mature pollen grains of a plant homozygous for the transposon insertion were able to germinate in vitro in a medium containing sucrose, glucose, or fructose, which indicates that PMT1 is not essential for pollen survival. Several explanations for these results are discussed in the present work. Correspondence and reprints (present address): Department of Plant Biology, University of Granada. Fuentenueva s/n, 18001 Granada, Spain. Present address: Swammerdam Institute for Life Sciences, Amsterdam, the Netherlands.     

拟南芥干旱诱导型启动子RD29A驱动花生AhNCED1基因双元表达载体的构建

从拟南芥基因组中克隆RD29A基因5'-侧翼520bp启动子区域序列,生物信息学分析表明,该启动子片段中存在脱水胁迫响应元件(DRE)、ABA响应元件(ABRE)、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件。构建了干旱诱导型启动子AtRD29Ap驱动花生AhNCED1基因的植物双元表达载体pAtRD29Ap::AhNCED1。     

大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在神经元中的表达。方法采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的片段（-298～＋283）,双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制。将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL—CMV（表达海肾荧光素酶）共转染原代培养皮质神经元,24h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶。结论成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在神经元中的特异性表达。     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

含p27启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p27基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p27启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果显示扩增的p27启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p27报告基因的转录。结论:克隆了p27启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

含p21启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p21基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p21启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果表明扩增的p21启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p21报告基因的转录。结论:克隆了p21启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

人p53启动子萤光素酶报告基因的构建及其活性测定

目的：克隆p53基因的启动子,插入萤光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增人p53启动子,插入萤光素酶报告基因载体pGL4．0-empty,将重组质粒转染293T、ZR75-1、HepG2、A549细胞,测定p53启动子的转录活性。结果：构建了p53启动子的萤光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的p53启动子正确;活性实验表明,报告基因在多种细胞中显示构建的p53启动子活性,并呈现一定的剂量效应;转录因子USF能以剂量效应方式提高p53报告基因的转录活性。结论：克隆了人p53启动子,为进一步研究调控p53的转录因子奠定了基础。