牙鲆甲状腺激素受体TRαA的原核表达和多克隆抗体的制备及应用

为研究牙鲆甲状腺激素受体TRαA在牙鲆变态发育过程中的调控作用,将TRαA基因克隆插入融合表达栽体pET30a,并在大肠杆菌Escherichia coli DE3(BL21)中进行诱导表达.表达菌株经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h后,重组蛋白TRaA表达并形成包涵体.SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物.包涵体经变性后在His-Bind树脂进行亲和层析纯化,柱上复性法对重组蛋白复性,获得纯度较高的目的蛋白,蛋白复性的效果良好.用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔制备多克隆抗体.Dot blotting检测抗体效价达1:200 000,检测证明抗体特异性良好.此外,通过染色质免疫沉淀技术鉴定了在活体细胞中多克隆抗体与TRαA的特异性结合.表明了甲状腺激素通过其受体在体内参与碱性磷酸酶(ALP)基因的转录调控.     

牙鲆甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的靶基因鉴定

为了鉴定牙鲆甲状腺激素受体TRs介导甲状腺激素调控的靶基因, 研究采用RT-PCR克隆了TRαA基因的CDS区, 并构建了p3×Flag-TRαA重组真核表达载体;该重组质粒转染HEK293T细胞后, RT-PCR、实时定量PCR与Western blot检测均表明牙鲆TRαA在哺乳动物蛋白表达系统中成功转录并翻译;且重组质粒转染的细胞裂解液通过G1亲和层析柱纯化、过滤除菌可得到纯的融合蛋白3×Flag-TRαA, 然后双荧光素酶报告实验通过在HEK293T细胞中共转染p3×Flag-TRαA和含候选靶启动子的报告基因表达载体pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708, 表明TRαA受体结合在atoh8基因启动子区–1497— –688特异的2个TRE识别序列来调控该基因的转录, 即atoh8是TRαA介导甲状腺激素直接调控的靶基因。研究为深入探究甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的信号通路提供了基础依据。     

抑菌蛋白Reg3A的表达纯化与功能

利用原核表达系统表达人源抑菌蛋白Reg3A,经包涵体的复性和纯化获得有体外抑菌功能的活性抑菌蛋白,并对其体外抑菌功能进行初步研究。构建Reg3A原核表达载体PET-32a-Reg3A转化补充稀缺tRNA基因的表达菌株大肠杆菌BL21-Codonplus,阳性重组子采用诱导培养基诱导5h后,采用超声破碎的方法提取包涵体蛋白,经包涵体蛋白的纯化和透析复性后通过Ni-NTA亲和层析交换柱,获得纯度达95%的蛋白质。Western blot鉴定显示在15 kD处有特异性条带。使用纯化后的蛋白进一步进行抑菌圈实验和抑菌活性实验,对获得蛋白的体外抑菌活性进行评估,从而为进一步进行Reg3A蛋白功能的评估及应用奠定基础。     

破骨细胞形成抑制因子TNFR结构区在大肠杆菌中表达、抗体制备及活性测定

破骨细胞形成抑制因子(OPG)对骨的重建与再吸收有重要调节作用,其TNFR结构区行使抑制破骨细胞形成与活性的功能。通过PCR将该区基因片段克隆出来,插入表达载体PET-28a质粒多克隆位点,重组质粒转入大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物以包涵体形式存在,包涵体经变性复性后,亲合层析获得重组蛋白。纯化的产物作为抗原免疫兔,得到较高特异性的兔源多克隆抗体。利用小鼠降血钙实验检测变性复性后产物的活性,结果表明该重组蛋白有一定的生物活性。     

人源核受体hLRH-1 的表达纯化及多克隆抗体制备

目的：制备抗人源核受体hLRH-1 的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础。方法：构建含有hLRH-1基因全长克隆的 原核表达载体pET507a-hLRH-1 并用IPTG 诱导其在Rosseta2 菌株中表达重组蛋白His-hLRH-1,经亲和层析纯化后按常规方法 免疫新西兰兔制备多克隆抗体,并用Western Blot 对其特异性进行鉴定。结果：原核表达载体pET507a-hLRH-1经测序证实构建 成功,将其转化大肠杆菌Rosseta2菌株后成功诱导表达重组蛋白His-hLRH-1,经纯化免疫新西兰兔后得到抗hLRH-1 多克隆抗 体,Western blot 证实抗体具有高度特异性。结论：成功表达His-hLRH-1 重组蛋白并制备出多克隆抗体,为进一步用于hLRH-1 的 免疫学检测及其功能研究奠定了基础。     

大鼠sFcγRIIb基因原核表达及活性鉴定

旨在克隆大鼠FcγRIIb基因,构建s FcγRIIb原核表达体系,制备重组大鼠s FcγRIIb蛋白。采用RT-PCR技术从RBL-2H3细胞中克隆FcγRIIb胞外区基因,构建重组表达质粒转化大肠杆菌诱导表达,镍柱亲和层析纯化重组蛋白,复性后利用Western blotting、ELISA进行鉴定。结果显示,成功克隆大鼠s FcγRIIb基因,构建原核表达载体s FcγRIIb-p ET17b,转化大肠杆菌BL21(DE3)。通过对表达体系进行优化,确定IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导时间为4 h时蛋白表达效率最高,重组蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体经8 mol/L尿素溶解,利用Ni-NTA柱亲和层析获得了较高纯度的重组蛋白。采用梯度透析复性法对s FcγRIIb进行复性后,经Western blotting、ELISA与竞争性ELISA鉴定,重组蛋白s FcγRIIb可被特异性抗体所识别且与Ig G具有结合能力。成功建立了大鼠FcγRIIb基因原核表达体系,制备了具有生物学功能的重组蛋白。     

小鼠RMND5A的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

RMNDSA通过MAPK信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程.通过PCR扩增RMND5A基因,并将其克隆至表达载体pGEX-4T-1上,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,再通过IPTG进行诱导表达GST-RMND5A融合蛋白.通过尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,Western blot检测抗体活性.结果说明,获得了RMND5A原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗RMND5A多克隆抗体,为RMND5A进一步的功能研究奠定了基础.     

羊口疮病毒蛋白ORFV035的表达、纯化和多克隆抗体的制备

克隆表达羊口疮病毒蛋白ORFV035,并制备其多克隆抗体,为后续对病毒复制、装配、形态发生和成熟过程的研究奠定基础。PCR扩增羊口疮病毒ORFV035基因,将其与质粒pET-30a(+)经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后连接,构建重组质粒pET30a-035。重组质粒经双酶切和测序鉴定,转化感受态大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。表达产物进行超声破碎和Ni柱纯化,纯化后目的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体并对其进行鉴定。成功构建了重组质粒pET30a-035,在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达。包涵体洗涤、溶解后进行Ni柱纯化,得到纯度较高的ORFV035-his融合蛋白。以纯化蛋白免疫小鼠获得多克隆抗体。Western blot检测显示该多抗可以识别天然ORFV035蛋白。成功诱导表达、纯化ORFV035蛋白并制备ORFV035多克隆抗体。     

解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆与表达

[目的]实现解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的高效表达,建立有效的透析复性方法,获得有活性的重组淀粉酶。[方法]以解淀粉芽孢杆菌DSM 7基因组DNA为模板,PCR扩增获得无信号肽的α-淀粉酶结构基因,克隆至p ET-22b(+),转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况,采用透析法进行包涵体复性并检测酶活。[结果]成功表达重组蛋白,相对分子量约为54.8k Da,成功复性包涵体,复性效率为22.78%,重组α-淀粉酶酶活力为102.4 U/m L。[结论]实现了解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的高效表达,包涵体经透析法成功复性,获得具有催化活性的重组淀粉酶。     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.     

杆状病毒出芽病毒粒子膜融合蛋白的研究进展

杆状病毒是一类感染节肢动物的病原微生物,其基因组为双链环状DNA,大小为80～180kb.     

Inception of the Modern Public Health System in China and Perspectives for Effective Control of Emerging Infectious Diseases: In Commemoration of the 140th Anniversary of the Birth of the Plague Fighter Dr. Wu Lien-Teh

In this article, we systematically review Dr. Wu Lien-Teh's academic achievements and outstanding contributions in the prevention and control of the plague epidemic in northeast China and introduce the development of the earliest public health epidemic prevention system in China in order to commemorate the 140th anniversary of Dr. Wu Lien-Teh's birth. We hope that this article will provide insights into the effective prevention and control of emerging infectious diseases as well as the current worldwide pandemic of COVID-19, facilitating the improvement and development of public health systems in China and around the globe.