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1.
体外研究显示,重组PSP94与重组TNFα衍生物11a(rhTNFαDlla)有协同抗前列腺癌的作用。将编码这两种蛋白的基因与真核表达载体pcDNA30重组,构建成pcDNAPSP94TNFαDlla真核表达质粒,两基因中间通过一个编码6个氨基酸的人工接头连接。在体外,对pcDNAPSP94TNFαDlla质粒表达PSP94TNFαDlla蛋白的生物学活性鉴定表明,该蛋白即具有PSP94抑制前列腺癌细胞生长的活性,又具有TNFαDlla对L929细胞的细胞毒作用。肌肉注射该质粒DNA,注射后第9天血液中可检测到目的蛋白的表达,目的蛋白浓度的高峰期约在注射后第14天,第25天仍可检测到目的蛋白的表达。该质粒DNA以50μg只的量给人前列腺癌裸鼠模型骨四头肌内注射,同时设pcDNAPSP94、pcDNATNFαDlla、pcDNA30空载体和生理盐水对照组。注射后第20天处死动物,抑瘤率分别为:pcDNAPSP94TNFαDlla组24%,pcDNAPSP94组19%,pcDNATNFαDlla组瘤体大小与生理盐水组无明显差异。以同样方法给药,pcDNAPSP94TNFαDlla质粒DNA对小鼠Lweis肺癌的抑制率31%,是pcDNAPSP94组抑瘤率的22倍,是pcDNATNFαDlla组抑瘤率的21倍。提示,PSP94与TNF具有协同抗肿瘤的作用 。 相似文献
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构建了表达人 PSP94、TNFα衍生物 ( TNFα D1 1 a)及 PSP94与 TNFα D1 1 a( PSP94- TNFαD1 1 a)双功能蛋白真核表达质粒 pc DNA- TNFα D1 1 a、pc DNA- PSP94和 pc DNA- PSP94- TNFαD1 1 a,与 rh PSP94和 rh TNFα D1 1 a蛋白分别在人前列腺癌裸鼠移植瘤动物模型上进行了 PSP94与 TNFαD1 1 a联合治疗人前列腺癌的实验研究 .当动物肿瘤直径长至约 1 0 mm时 ,将以上 3种真核表达质粒分别以 50 μg/只的量给相应组动物的左右四头肌内注射一次 ,同时设 pc DNA3.0空载体对照组 ;rh PSP9450μg/kg、rh TNFαD1 1 a 1 0 0万单位 /kg、rh PSP94和 rh TNFαD1 1 a以同样剂量联合给药 ,肌肉注射 ,每 d一次 ,连续 1 0 d,同时设环磷酰胺阳性对照组和生理盐水阴性对照组 .基因治疗动物给药后第 1 5d处死 ,蛋白治疗组停药后第 2 d处死 ,观察疗效 ,计算抑瘤率 .结果显示 ,以上述方式给药 ,无论是基因治疗组还是重组蛋白组 ,给 PSP94的动物肿瘤虽然未见明显缩小 ,但肿瘤组织均出现不同程度的坏死和液化现象 ;给 TNFαD1 1 a的未见明显的抑瘤效果 ;PSP94-TNFαD1 1 a融合基因或 rh PSP94+ rh TNFαD1 1 a联合给药 ,不仅肿瘤有所缩小 ,而且也有不同程度的坏死和液化现象出现 .初步认为 :( 1 ) PSP94有一定的抗前列腺 相似文献
3.
将编码人 94个氨基酸的前列腺分泌蛋白 ( PSP94) c DNA与酵母整合载体 p PICZαA重组 ,构建的重组质粒线性化后转染酵母细胞 GS1 1 5,获得了 PSP94在酵母细胞中遗传性稳定表达酵母工程细胞 .诱导后的培养物中 ,rh PSP94表达量约为 0 .9mg/L,分子量约 1 6.5k D.培养上清经离子交换层析纯化后 ,目的蛋白的纯度为 92 % .体外在人前列腺癌细胞上活性分析表明 ,rh PSP94以1 0 0μg/L ,对该细胞的抑制率 2 0 .4% ;单纯新型 TNF,以 1 0 3 U/ml,抑制率 2 9.8% ;rh PSP94和新型 TNF以上述同样剂量联合应用 ,抑制率为 86.3% .提示 PSP94在体外对抗前列腺癌细胞有杀伤作用 ,但不明显 ;PSP94与新型 TNF联合应用 ,可使抑制率明显提高 ,可能 PSP94与新型 TNF有协同抗前列腺癌的作用 . 相似文献
4.
PSP94-TNFαD11a融合基因在NIH3T3细胞中的表达及其产物活性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
为了分析 PSP94- TNFαD1 1 a融合基因的表达和表达产物的生物学活性 ,将含该融合基因的质粒 pc DNA- PSP94- TNFα D1 1 a转染 NIH3T3细胞 ,72 h后收集细胞培养上清 ,并提取细胞总RNA,经 RT- PCR,得到与目的基因长度相符合的 c DNA片段 ;以 PSP94c DNA为探针 ,对 RT-PCR产物进行 Southern印迹分析 .结果表明 :转染 PSP94- TNFαD1 1 a融合基因的 NIH3T3细胞 ,其 RT- PCR产物杂交信号为阳性 .细胞培养上清用 TNF抗体行 Western印迹和 ELISA分析 ,检测结果为阳性 .生物学活性分析表明 ,细胞培养上清不仅具有 PSP94抑制人前列腺癌细胞 PC- 3生长的活性 ,而且显示出 TNFα对 L92 9细胞的细胞毒作用 .以上结果表明 ,pc DNA- PSP94- TNFαD1 1 a质粒能够正确表达目的基因 PSP94- TNFα D1 1 a,且表达的 PSP94- TNFαD1 1 a融合蛋白具有预期的双重生物学活性 . 相似文献
5.
虹鳟肿瘤坏死因子(TNFα)基因体外表达与纯化的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
将虹鳟两种肿瘤坏死因子TNFα和TNFα2基因的成熟肽编码区域,用带有BamHI和HindⅢ酶切位点的基因特异性引物进行:PCR扩增。扩增片段用限制性内切酶消化并连接到pQE30表达载体上,连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细菌中。转化子经PCR筛选,质粒测序,完成了虹鳟两种TNFα基因重组子的构建。重组子经体外培养和诱导后,获得了高效表达的TNFα重组蛋白。高效表达的重组TNFα不受诱导剂IPTG的影响,并且由于重组子高效表达而形成了包涵体;重组蛋白产量约占菌体蛋白总量的25%—30%。应用Ni-NTA和固定金属亲和层析(IM-PC)技术,在变性条件下获得了高度纯化的重组蛋白,纯化重组蛋白的产量约为0.5—1mg/L。 相似文献
6.
目的:构建骆驼蓬脂转移蛋白(lipid transfer protein from Peganum harmala,PhLTP)基因真核表达质粒,并探讨其对黑色素瘤B16细胞在体内外的抗肿瘤作用。方法:将PhLTP基因亚克隆至pcDNA3.1上,获得重组质粒pcDNA3.1-PhLTP;用脂质体转染法将重组质粒及空载体外转染B16细胞,MTT检测其对B16细胞生长的影响。建立B16荷瘤小鼠模型,设重组质粒(pcDNA3.1-PhLTP)、空载(pcDNA3.1)、生理盐水和阳性药物(CTX)组,分别处理小鼠后测量各组肿瘤体积并称瘤重,计算抑瘤率。光镜观察鼠脾、肝等组织变化;免疫组织化学法检测各瘤体中PhLTP、血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达。结果:pcDNA3.1-PhLTP转染B16细胞72 h后,细胞增殖能力明显受到抑制(P0.01)。注射pcDNA3.1-PhLTP组的小鼠肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤体积小于空载和生理盐水组(P0.05)。显微镜下可见重组质粒组肿瘤细胞有不同程度的点、片状坏死,而肝、肺等无明显病理损伤。重组质粒组肿瘤组织中有PhLTP蛋白的表达,且VEGF和bFGF的阳性表达指数都低于空载和生理盐水组(P0.01)。结论:成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1-PhLTP,体内外实验结果显示其能有效地抑制B16细胞的生长,预示了该重组质粒在治疗黑色素瘤中的潜在应用价值。 相似文献
7.
制备脂质体包裹的Ag85A口服DNA疫苗,并观察小鼠口服后所诱生的抗体产生情况。用脂质体包襄重组质粒pcDNA3.1/mye—HisA—Ag85A制备口服DNA疫苗,并用脂质体包裹空质粒pcDNA3.1/myc—HisA作为对照。将C57BL/6小鼠随机分为3组,即生理盐水组、空质粒组和重组质粒DNA疫苗组。分别将生理盐水、空质粒和重组质粒DNA疫苗以灌胃方式投给各组小鼠,共免疫3次,每次间隔14d,末次免疫后14d处死小鼠,ELISA法检测血清中Ag85A特异性抗体水平,放射免疫法测定肠组织中分泌型IgA(sIgA)含量。重组质粒组血清中Ag85A特异性抗体滴度为1:160,空质粒组和生理盐水组血清中均未捡出Ag85A特异性抗体。重组质粒组肠组织中slgA含量(0.3761±0.0456)μg/mL较空质粒组(0.2374±0.0414)μg/mL和生理盐水(0.1993±0.0899)μg/mL组显著增高(P〈0.05),而空质粒组和生理盐水组未见有意义的变化(P〉0.05)。口服脂质体包裹Ag85ADNA疫苗可诱导外周特异性抗体的产生和肠道黏膜局部sIgA的水平的升高。 相似文献
8.
用人工合成的α-肿瘤坏死因子(TNF—α)基因构建了五个不同的表达质粒,它们不同之处是SD序列与起始密码子ATG问距离(D)各异.计算机模拟计算出翻译起始区域(TIR)中二级结构的最小生成自由能.以(D)为6个核苷酸时最小(绝对值)。它的表达效率也最高,产物TNF—α可达菌体总蛋白的60%.密码子的选用对表达效率有很大的影响,故人工合成TNF-α基因(选用大肠杆菌偏爱的密码子)的表达效率高于sc-DNA(对部分密码子改造的半合成eDNA). 相似文献
9.
为了获得人重组 persephin( PSP)并研究其生物学活性 ,从人胎脑组织中提取总 RNA,以RT- PCR方法获取编码人 PSP成熟蛋白 c DNA.将人 PSP c DNA插入含 T7启动子的质粒 p ET-2 8a( + ) ,构建表达质粒 p ET- PSP,转化大肠杆菌 BL 2 1 ( DE3)获得表达菌株 BLPSP,经 IPTG诱导表达的 PSP形成包含体 .凝胶自动扫描分析表明 ,PSP表达量约占菌体总蛋白 2 0 %以上 .用Ni2 + - NTA树脂一步法纯化目的蛋白 ,纯度达 85%以上 .纯化和复性的 PSP蛋白能显著促进脊髓神经元的存活 . 相似文献
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目的:研究细胞增殖相关基因CDADC1在人视网膜色素上皮细胞ARPE19中的表达及对ARPE19细胞增殖的影响。方法:采用基因重组技术构建荧光表达载体pEGFP-C1-CDADC1和真核表达载体pcDNA3.1-myc-CDADC1,用脂质体转染法转染ARPE19细胞,观察GFP—CDADC1融合蛋白在ARPE19细胞的表达定位,流式细胞仪测定CDADC1转染后对ARPE19细胞生长周期、凋亡的影响。结果:FP—CDADC1融合蛋白亚细胞定位显示,CDADC1低表达于ARPE19细胞胞浆,高表达于细胞核;pcD—NA3.1-myc-CDADC1瞬时转染ARPE19细胞显示24小时细胞无明显改变,48小时后重组质粒转染组S期细胞占细胞总数的19.37%,pcDNA3.1-myc空载质粒转染组S期细胞占10.87%,而空白对照组S期细胞占3.33%,重组质粒转染组与两对照组之间的差异有统计学意义(P〈0.01)。结论:CDADC1在增生性玻璃体视网膜病变(PVR)发生和发展过程中可促进DNA的合成,引起细胞增生。 相似文献
12.
探讨了粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)在TNF-α和环己亚胺协同诱导SMMC-7721细胞凋亡中的作用,利用转染FAK反义质粒来特异性降低SMMC-7721细胞的FAK含量,用Western杂交的方法来检测蛋白激酶B(PKB)的蛋白含量,以及用流式细胞仪的方法来检测细胞的凋亡。研究发现TNF-α本身并不能诱导SMMC-7721细胞发生凋亡,而只有当用环己亚胺和TNF-α协同处理时才发生凋亡。在TNF-α和环己亚胺协同诱导的凋亡过程中,PKB蛋白含量的降低,提示PKB的蛋白水平与凋亡的发生密切相关。当用FAK反义质粒降低SMMC-7721细胞的FAK含量(约降低了60%)后,细胞对TNF-α和环己亚胺协同诱导的凋亡的敏感性在用低剂量TNF-α处理的情况下增加,而在高剂量TNF-α和处理的情况下降低,相应地,在低剂量TNF-α和环己亚胺处理的情况下,FAK反义质粒转染株细胞的PKB含量比对照的PKB含量低;而在高剂量TNF-α和环己亚胺处理的情况下,FAK反义质粒转染株细胞的PKB含量比对照的要高。结果提示,FAK对TNF-α和环己亚胺协同诱导SMMC-7721凋亡的过程有一双相作用,并且该过程可能与PKB有关。 相似文献
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目的:在体内,相对分子质量为26×103的跨膜型肿瘤坏死因子α(mTNF-α)可被TNF转化酶(TACE)酶解成相对分子质量为17×103的游离型TNF-α(sTNF-α)。为评价新研发的TNF-α全人源单克隆抗体与mTNF-α的结合能力,以及该单抗的ADCC作用,须构建只能稳定表达mTNF-α而不受TACE影响的Sp2/0细胞株。方法:PCR扩增缺失了TACE酶切位点的人TNF-α野生型基因序列,构建pcDNA3.1(+)-dTNF-α重组质粒并测序鉴定;重组质粒转染Sp2/0细胞,构建只能稳定表达mTNF-α的细胞株,用流式细胞仪检测其表达情况。结果:pcDNA3.1(+)-dTNF-α重组质粒测序结果与设计缺失基因的碱基序列完全一致,重组质粒构建成功;转染的阳性细胞株经流式细胞仪检测有表达,其中Clone11、15、16的表达量最高。结论:跨膜型TNF-α稳定表达细胞株构建成功,可用于TNF-α全人源单克隆抗体体外药效的评价。 相似文献
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人跨模型和跨膜稳定型肿瘤坏死因子—α的基因表达产物对体外培养的脑胶质瘤细胞的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
为了探讨人跨膜型和跨膜稳定型肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对脑恶性质瘤基因治疗的有效方法,研究应用了基因重组、细胞培养以及免疫组化等技术。通过真核表达pcDNA3转染NIH3T3细胞,并在体外观察了THF-α对脑胶质瘤生长的影响。结果显示:与对照组相比,TM-TNF-α组和TM-TNF-αm组中GFAP和S-100免疫反应阳性肿瘤细胞的数量、胞体截面积、周长、平均光密度皆明显减少。统计学分析提示差异有显性意义。这表明TNF-α基因的表达可明显抑制胶质细胞的生长和分化。而且,还发现跨膜稳定型TNF-α的杀瘤效果较跨膜型TNF-α强。这为TNF-α基因用于胶质瘤的基因治疗提供了一定的实验依据,提示大剂量的TNF-α在临床治疗可能产生毒副作用。 相似文献
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制备CVB3结构蛋白和非结构蛋白重组质粒DNA疫苗时 ,采用RT PCR从CVB3感染的HeLa细胞中扩增VP1、VP2、2A和 3D基因 ,重组入真核表达质粒 pcDNA3中 ,构建pcDNA3/VP2、pcDNA3/VP1、pcDNA3/ 2A和pcDNA3/ 3D重组质粒 ,经酶切和测序证实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞COS 7,用RT PCR检测mRNA的转录 ,用Western blot检测表达产物。结果 4种重组质粒酶切出相应大小的目的片段 ,经测序证实为CVB3相应序列 ,Western blot证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建CVB3结构与非结构蛋白的重组质粒DNA疫苗 ,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。 相似文献
16.
将含有人白细胞介素-3基因(hIL-3)cD-NA的真核表达质粒直接注射小鼠骨骼肌,观察hIL-3基因在小鼠肌肉及体内的分泌表达情况。原位分子杂交及免疫组化结果显示注射重组质粒后,第14大重组质粒全部进入到骨骼肌细胞内并有IL-3的表达。ELISA结果显示,注射重组质粒DNA后,第21天小鼠血液中IL-3的含量最高,约有67ng/ml,第14天次之,约51ng/ml,第28天和第7天相近,约34ng/ml。生物学活性检测结果表明,实验组小鼠血清有维持IL-3依赖的TF-1细胞株生长的作用。表明重组质粒DNA直接注射骨骼肌后进入到肌细胞内并表达IL-3,进入血液,而且表达产物有生物学活性。 相似文献
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目的:构建两个高表达人TNFα和IL-1β细胞系,建立抗炎药物筛选细胞模型。方法:运用PCR的方法从载体pCMVSport-TNFα和p CMVSport-IL1β上扩增目的基因,以亚克隆方法将目的基因分别插入真核表达载体pcDNA3.1和pFLAG-CMV中,用单酶切、PCR扩增和基因测序的方法鉴定重组效果,然后将重组成功的质粒转入HEK293细胞系内,挑选能够稳定表达并遗传的单克隆细胞株,用蛋白免疫印迹(Western blot)法分析其表达效果。结果:三种鉴定方法均显示重组质粒构建成功。Western blot结果显示,细胞株T3、T4均能较高表达炎症因子TNF-α;细胞株I2、I3、I5均能较高表达炎症因子IL-1β。结论:成功构建了TNFα和IL-1β靶标的药物筛选细胞模型,为筛选具有抗炎作用的中药提供了一个新平台。 相似文献
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将表达野生型缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1 α, HIF-1α)的重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α,表达抑制型HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-dominant negative HIF-1α和空质粒pcDNA3.1稳定转染人宫颈癌SiHa细胞,研究HIF-1α对人宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响.采用免疫细胞化学法和Western 印迹检测HIF-1α与VEGF蛋白的表达;CoCl2化学缺氧法处理细胞,采用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡情况.结果显示,显性失活HIF-1α能下调VEGF蛋白的表达,促进细胞缺氧条件下的凋亡,这提示HIF-1α可能在宫颈癌的发生发展中起作用,利用显性失活HIF-1α转染抑制HIF-1α可望成为宫颈癌治疗基因治疗的又一新途径. 相似文献
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本实验将含有人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因cDNA的重组真核表达质粒直接注射小鼠骨骼肌,观察了hGM-CSF基因在小鼠体内的分泌表达情况。ELISA结果显示注射重组质粒DNA后,第15天左右小鼠血液hGM-CSF的表达量最高,约有97 ng/ml,第20天次之,第25天和第10天的表达量相近,约有49 ng/ml。生物学活性检测结果表明,实验组小鼠血液有维持TF-1依赖株细胞的生长作用。表明重组质粒DNA直接注射骨骼肌不仅能表达hGM-CSF,而且表达产物有生物学恬性。 相似文献