胎儿血红蛋白数量性状相关基因的研究进展

胎儿血红蛋白(HbF)是一种主要在胎儿期间大量存在的血红蛋白, 但成年后含量极少, 然而少量人群及部分镰刀型贫血和地中海贫血患者体内仍保留一定量的HbF, 其存在对缓解贫血临床并发症具有重要益处。以往研究已经确定影响HbF数量性状的基因座定位于6q23和2p15, 而最新的一系列研究表明, 定位于6q23的HBS1L-MYB和2p15的BCL11A与HbF含量关联最高。这些研究一方面有助于理解HbF表达机理, 另一方面也为镰刀型贫血的治疗提供了潜在的药物靶点。文章对HbF表达的数量性状相关基因的研究现状及潜在应用进行了综述     

血红蛋白F乌鲁木齐[~Gγ~I22(B4)Asp→Gly]——在维吾尔族中发现的一种新的胎儿血红蛋白变异体

在乌鲁木齐市进行的一次脐带血普查中,检出一例慢速血红蛋白变异体,携带者为一维吾尔族新生儿。结构分析表明,γ链第22位的天冬氨酸被甘氨酸所替代;变异体的γ75位是异亮氨酸,γ136位是甘氨酸。这种变异[~Gγ~I22(B4)Asp→Gly]迄今在国内外文献中均未见报道,是一种新发现的胎儿血红蛋白变异体,命名为血红蛋白F乌鲁木齐(HbF Urumqi)。热不稳定试验阴性。     

eSNPdb,人类增强子区域单核酸多态性数据库

增强子控制着多能性相关基因的转录,在细胞分化中起重要作用。数以千计的GWAS研究结果表明,一定数量疾病相关的SNP位于增强子区域,且近来的研究发现SNP通过影响增强子的功能引起对疾病的易感性,因此有必要对增强子区域的SNP进行整合和分析。我们建立了e SNPdb数据库,收集了增强子注释、SNP以及相关GWAS数据,将疾病与增强子建立联系。数据库收集了67 268个增强子,在这些区域上有826 350个SNP,其中8 521个与疾病相关。数据库还收集了位于增强子区域的转录因子结合位点信息,以便预测SNP对增强子区域转录因子的结合亲和性的影响。作为目前唯一收集增强子区域SNP信息的数据库,e SNPdb将会是研究增强子在人类疾病中的作用与机制重要的数据资源。     

胎儿血红蛋白的表达调控

胎儿血红蛋白是胎儿体内主要的血红蛋白类型,是由两条α肽链和两条γ肽链组成的四聚体。出生后胎儿血红蛋白在人体中的表达急剧降低至1%,由两条α肽链和两条β肽链组成的成人血红蛋白取而代之成为主要的血红蛋白类型。β地中海贫血和镰刀型细胞贫血发病原因均基于β-珠蛋白基因发生突变,致使β-珠蛋白合成不足或异常,进而引起一系列临床症状。诸多实验结果及临床疗效表明,提高患者体内γ-珠蛋白的表达可部分替代异常β-珠蛋白从而有效缓解患者的临床症状。随着基因治疗的发展,如何安全高效的再激活胎儿血红蛋白的表达成为治疗β型地中海贫血和镰刀型细胞贫血患者的重要科学命题。本文重点回顾近年来γ-珠蛋白表达的调控机制,以期对寻找更加有效激活胎儿血红蛋白的方法提供参考。     

人胎儿γ-珠蛋白基因的再活化及在β血红蛋白病治疗中的

在个体发育过程中,人β类珠蛋白基因的表达存在从胎儿（γ）到成人（β）珠蛋白基因的表达转换（或称开关）.β-地中海贫血和镰刀型贫血症是两种最为常见的严重危害人类健康的单基因遗传病,通过诱导胎儿期血红蛋白（HbF,α2γ2）在成人期表达对该病的治疗是一种有效的策略.一些活化γ珠蛋白基因表达的转录因子和辅助因子已经被鉴定,一些可以增加胎儿血红蛋白在成人红细胞中表达的药物也已被鉴别和实验,它们的作用机制被部分揭示,这些研究为发展通过活化γ-珠蛋白基因治疗镰刀形细胞贫血和重型β-地中海贫血的方法提供了重要线索和实验依据.     

油棕种壳厚度控制基因SHELL的SNP分子标记开发

油棕属棕榈科多年生木本油料作物,果实含油量高达50%,且单位面积产油量高,享有"世界油王"美誉。油棕果实由外果皮、中果皮、内果皮(种壳)、种子四个部分组成,产油部分主要是中果皮和种子,其中种壳厚度是影响果实含油量的重要因素。SHELL基因控制种壳厚度,是一类MADS-box同源基因,SHELL基因在厚壳种和无壳种中的变异主要是第一个外显子上的两个SNP位点。该研究根据两个SNP位点进行特异标记开发,根据已知的油棕SHELL基因的序列,设计了4对SNP引物。4对SNP引物以2个SNP位点设计,每个SNP位点设计2对SNP标记,并均在引物3'端第二位引入强错配碱基。以2份薄壳种油棕材料和2份厚壳种油棕材料DNA为模板,扩增筛选油棕SHELL基因SNP引物。通过PCR扩增发现,设计的SHELL基因特异SNP标记EgSh(N)-f/EgSh(SNP)-2r能够鉴别油棕厚壳种和薄壳种。再用24株油棕树进行特异性验证,发现该标记能较准确地判断油棕的厚薄壳。该研究结果表明SNP标记EgSh(N)-f/EgSh(SNP)-2r可用来进行油棕种质资源早期分子鉴定,为高产油棕品种选育提供了技术支撑。     

与胎儿珠蛋白基因持续表达有关的(A_γδβ)°—地贫纯合子及杂合子的分子鉴别

我们分子鉴别了一个缺失型中国(A_γδβ)°-地贫家系。先证者为这一缺失的纯合子,具有中度贫血症状。家系的另五个成员均为这一缺失的杂合子,其胎儿血红蛋白(HbF)为16—21％,接近或达到HPFH杂合子的HbF水平,并且几乎不表现贫血症状。限制性内切酶图谱分析证明了β-珠蛋白基因簇内的DNA顺序缺失,缺失的5′端点位于Aγ基因IVSⅡ内,3′端点在β-珠蛋白基因下游区远端,距HPFH-2的3′缺失端点上游区约11kb。缺失的总长度约为80kb。本文讨论了这一缺失导致胎儿血红蛋白在成人中持续活跃表达的可能机制。     

羟基脲(Hydroxyurea)对细胞周期与珠蛋白基因表达的影响(简报)

已有许多证据表明羟基脲能增加镰状细胞贫血及β-地贫病人的胎儿型血红蛋白(HbF)的合成。最近,有人报道羟基脲也能使一些患有β-地贫病人的β-珠蛋白基因表达增加。K562细胞是人红白血病细胞株,它只能表达胚胎型(ε-)与胎儿型(γ-)珠蛋白基因,而不能表达成年型(β-)珠蛋白基因。因此,K562     

贵州苗族新生儿HbF中G_λ/A_λ比值测定与~Aγ~T基因频率分析

用含Triton X-100的酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法测定了贵州省108例苗族新生儿脐带血胎儿血红蛋白(HbF)中。~Gγ/~Aγ值。显示107例(占99.07％)新生儿的~Gγ值在55—78％之间,均值与标准差为70.42±3.45;高~Gγ值者1例(占0.925％);低~Gγ值者未发现。用Large-pore Vydac C4柱反相高效液相层析法对108例样本进行了~Aγ~T基因频率(f~4γ~T)分析,f~4γ~T为0.0648。     

植物的血红蛋白

近几年来,植物血红蛋白的研究进展十分迅速,豆科植物中与共生固氮无关的血红蛋白基因和包括禾本科植物在内的许多非豆科植物血红蛋白基因的发现使人们对植物血红蛋白有了新的认识,进而把植物血红蛋白分为共生血红蛋白和非共生血红蛋白两种类型。对这两种血红蛋白的性质、功能、基因结构及表达等方面的研究不仅对共生固氮中植物与微生物的相互关系和固氮工程研究;而且对植物细胞的呼吸代谢和耐涝机理等研究有重要价值。     

文蛤HDAC1基因克隆、时空表达及生长相关SNP位点筛查

为探索HDAC1基因在文蛤生长发育中的作用, 研究通过已构建的文蛤转录组文库, 利用SMARTRACE技术扩增得到文蛤HDAC1 (Mm-HDAC1)基因的cDNA全长序列, 分析了其生物信息学、组织及发育阶段表达特征, 并用直接测序法在外显子中筛查生长相关的SNP位点。结果显示, Mm-HDAC1基因的cDNA全长3065 bp, 开放阅读框1599 bp, 编码532个氨基酸; 氨基酸序列比对发现, 文蛤与其他物种同源性为74.3%78.7%。荧光定量PCR (qRT-PCR)结果表明, Mm-HDAC1基因在文蛤6个组织中均有表达, 其中外套膜中的表达量相对最高, 并与其他组织间有极显著差异(P0.01); 不同发育时期的表达差异结果表明, Mm-HDAC1基因在壳顶幼虫期表达量最高, 显著高于其他发育时期(P0.05)。SNP位点筛查结果表明, 在Mm-HDAC1基因的外显子区域发现了19个SNP位点, 其中有3个SNP位点(627AT、924TC和1266TC)与文蛤生长相关。     

水稻糯性相关基因的全基因组关联分析

利用1 090 071个SNP标记, 对419份广西地方稻种资源核心种质的糯性进行全基因组关联分析。结果表明, 运用混合线性模型, 在P<4.72×10^-8 (4.72E-8)水平下, 检测到45个与糯性显著关联的SNP位点, 均位于第6号染色体上。通过筛选显著关联位点上、下游各150 kb区域内的基因, 共找到305个候选基因, 其中包含2个与淀粉合成酶相关的Wx和SSIIa基因; 同时在第6号染色体5.69-5.89 Mb区域发现4个与糯性显著关联的SNP位点, 该区域可能是影响水稻(Oryza sativa)糯性的重要候选区域。     

拟南芥抗旱转录因子CBF4基因区域的核苷酸多样性及其分子进化分析

以生长于不同气候条件下的17个拟南芥核心生态型为材料,分析了它们的抗旱转录因子CBF4基因区域的序列多态性。结果表明：拟南芥CBF4基因区域具有高密度的单核苷酸多态性(SNP)和插入缺失(Indel),多态性频率为每35．8bp一个SNP,每143bp一个Indel,基因非编码区的多态性是编码区的4倍;在编码区,SNP的频率为每96．4bp一个SNP,其中发现25av、203av和244av 3个生态型CBF4基因区域1034位(以Gen—Bank登录号AB015478序列第19696位的核苷酸为1)碱基变化：G←→T,引起第205位氨基酸变化：gly←→val。核苷酸多样性统计分析显示,该基因内部大范围内存在连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD),5’端非编码区有一个重组。与拟南芥等的研究结果类似,选择压力对不同的区域作用不同。3’端非编码区核苷酸多样性程度最高,是平衡性选择的结果,编码区核苷酸变化符合中性突变假说,而5’端非编码区是自然选择作用的靶位点。     

野生型及启动子区突变的HPFHAγ基因在MEL细胞中的表达

研究了野生型Ａγ珠蛋白基因、中国型胎儿血红蛋白持续存在综合症（ＨＰＦＨ）Ａγ基因（启动子区－１９６Ｃ－Ｔ突变）及希腊型ＨＰＦＨＡγ基因（－１１７Ｇ－Ａ突变）在鼠红白血病（ＭＥＬ）ＧＭ９７９细胞中的表达,比较每个整合的Ａγ基因明显增加的表达水平,而－１１７Ｇ－Ａ１９６Ｃ－Ｔ突变Ａγ基因未显示比野生型Ａγ基因明显增加的表达水平,而－１１７Ｇ－Ａ空变Ａγ基因在未分化的及ＨＭＢＡ或丁酸钠诱导分化的ＭＥＬＧ     

拟南芥血红蛋白1的亚细胞定位

为研究拟南芥的血红蛋白1(AtGLB1)基因的亚细胞定位,该实验构建了拟南芥血红蛋白1基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体pUCGFP/ AtGLB1.利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,通过检测融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布来确定拟南芥血红蛋白1在细胞中的定位.荧光显微镜检测结果表明,AtGLB1基因表达产物主要定位在细胞核中,少量定位在细胞质中.     

水蕨血红蛋白基因的分子克隆和序列分析

植物血红蛋白(Hemoglobin)是一类由珠蛋白(Globin)和血红素(Ferroheme)组成的结合蛋白,在植物中广泛分布,迄今已在苔藓植物、裸子植物和被子植物中克隆到血红蛋白基因序列,但在蕨类植物中相关研究还未见报道。该研究采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法克隆了水蕨血红蛋白基因的全长序列。该基因的序列总长为949 bp,包含4个外显子和3个内含子,编码189个氨基酸。预测的蛋白质(命名为CtHb)的分子量为21.14 kDa,等电点(pI)为7.81。三维结构模拟表明CtHb具有植物血红蛋白典型的三级结构:即含有A、B、C、E、F、G和H螺旋,形成了3-on-3的"三明治"结构。和水稻血红蛋白的三级结构相比,CtHb的大部分结构(包括具有远端和近端组氨酸定位的E螺旋和F螺旋的位置等)同水稻的结构极为相似。两者的不同之处主要表现在:(1)CtHb含有较长的N-端区域;(2)两者CD-loop的折叠方式不同;(3)两者螺旋B和螺旋C的连接方式不同,CtHb是通过卷曲连接的,而水稻中借助的是螺旋。结构进化分析揭示了植物血红蛋白从非共生到共生进化过程中的一些关键改变,这些改变可能有助于非共生血红蛋白向共生血红蛋白结构的转变,特别是有助于豆血红蛋白共生功能的实现。     

应用胎儿特异性抗体HbF（γ链）标记法无创性 产前基因诊断DMD

以孕8~26周孕妇外周血为材料,经过Percoll密度梯度离心初步富集,胎儿细胞特异性抗体—HbF标记、识别胎儿有核红细胞,母体和胎儿有核红细胞的精确区分是以胎儿和成人血红蛋白的组成差异为基础的。胎儿细胞胞浆黄染,而具有成人血红蛋白的母体细胞没有颜色。显微操作法获取全部阳性细胞后,以其全基因组扩增（PEP）的产物为模板,进行性别检测、DMD基因的多重PCR检测和STR连锁分析。结果,20名孕妇外周血中均发现与HbF呈阳性反应的胎儿NRBC。并完成7例DMD的产前基因诊断。HbF抗体标记法能有效识别胎儿有核红细胞,是无创性产前基因诊断中很有应用前景的标记方法。 Abstract： Maternal blood was obtained at 8-26weeks of gestation.After discontinuous density gradient centrifugation with Percoll ,HbF antibody was used to identify fetal NRBC.The precise differentiation between fetal and maternal NRBC is based on the constitutional difference between fetal and adult hemoglobin (Hb).Fetal cells appear yellow cytoplasmic staining,while adult cells colorless. NRBCs were collected by micromanipulation andwhole genome amplification was performed. DMD was prenatally diagnosed by using the combination of sex determination,multiplex PCR and linkage analysis of several STR sites of dystrophin. NRBCs stained with HbF were found in all of 20 maternal blood samples with gestations, and 7 fetuses with risk of DMD were diagnosed. We concluded that HbF antibody could identify fetal NRBC efficaciously,and this is a kind of more prospective application method.     

文蛤Smad1/5基因克隆、时空表达及生长相关SNP位点筛查

为探讨Smad1/5基因在贝类生长发育中的调控作用, 利用RACE技术克隆获得文蛤Smad1/5(Mm-Smad1/5)基因的cDNA全长序列, 对其生物信息学、不同组织和不同发育时期时空表达特征进行分析, 并利用直接测序法分析了外显子区域SNP位点与生长性状的相关性。结果表明: Mm-Smad1/5的cDNA全长序列为1832 bp, 开放阅读框1380 bp, 编码459个氨基酸; 氨基酸多序列比对显示, Mm-Smad1/5蛋白与太平洋牡蛎Smad5、大西洋舟螺Smad1的一致性分别为83.7%和80.2%, 与人、鸡、非洲爪蟾等脊椎动物Smad1、Smad5氨基酸序列的一致性达到70.5%以上, 说明该基因具有较高的保守性; 结构域预测发现, Mm-Smad1/5含有Smads蛋白家族特有MH1、MH2两个高度保守结构域。荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明, Mm-Smad1/5基因在成体6个组织均有表达, 尤其在斧足、外套膜中表达量显著高于其他组织(P<0.05);Mm-Smad1/5基因在各发育时期广泛表达, 从原肠胚期开始大量表达, 一直持续到壳顶幼虫期, 而从眼点幼虫大量下降, 稚贝时期又有所上升。Mm-Smad1/5基因外显子区域SNP位点相关分析表明, 共发现了9个SNP位点, 其中936 G>T位点与文蛤的生长性状显著相关(P<0.05)。Mm-Smad1/5基因在文蛤生长发育中发挥重要调控作用, 可作为高产良种选育的候选基因, 而生长关联SNP位点分析将为文蛤分子标记辅助育种研究奠定重要基础。     

人类珠蛋白相关基因上游开放阅读框的变异分析

β-地中海贫血症是一种珠蛋白生成障碍的常染色体隐性遗传病。而γ珠蛋白基因的开放表达和胎儿血红蛋白的合成,是缓解β地中海贫血病人临床表型的一个重要因素。本研究针对202个血红蛋白相关调控基因或miRNA,对1802个β-地中海贫血症患者进行了目标区域捕获测序。通过生物信息学的分析,检测出了所有捕获区域内的突变。进一步对位于5′端非编码区(5′untranslated region, 5′UTR)的突变进行系统扫描,共计寻找到41个影响uORF(upstream open reading frame, uORF)有或无的功能性突变。从中选取了CHTOP基因(chr1:153606541 C>T)和TGFB1基因(chr19:41859418 G>A)的两个突变,通过定点诱变和双荧光素酶报告实验,在体外证实这两个突变均可显著地改变下游基因的表达。该研究结果为β-地中海贫血症临床表型的精确诊断提供了潜在的筛查靶点。     

Atpif1基因对K562细胞血红蛋白合成的影响*

目的:探讨线粒体三磷酸腺苷酶抑制因子-1(Atpif1)对血红蛋白合成的影响。方法:首先,将K562细胞分为低氧实验组、常氧对照组,低氧实验组采用O₂浓度为2%,分别培养24 h,48 h,72 h后收集两组细胞,通过细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK8)法检测细胞的活性,流式细胞仪检测低氧对细胞凋亡的影响,通过氯化血红素诱导K562细胞,检测低氧对血红蛋白合成的影响,qRT-PCR检测Atpif1,核因子(NF-κB),delta-氨基酮戊酸合成酶2(Alas2)基因的转录表达。然后,将K562细胞置于低氧培养箱培养并分为空白组,阴性对照组和si-Atpif1三组。转染siRNA,沉默Atpif1基因,观察血红蛋白合成和NF-κB、Alas2基因mRNA水平变化。结果:与常氧对照组相比,低氧实验组K562细胞活性降低、凋亡增加,血红蛋白含量增加(P＜0.05)。Atpif1、Alas2、NF-κB的mRNA表达水平上调(P＜0.05)。与空白对照组和阴性对照组相比,si-Atpif1组血红蛋白含量均有减少(P＜0.05),同时NF-κB、Alas2的mRNA水平也出现下调(P＜0.05)。结论:Atpif1基因参与调控血红蛋白合成,探究其在高原红细胞增多症(HAPC)发生中的作用,可以为防治HAPC提供新的思路和治疗靶点。