应用SELEX技术筛选人类血型IgG适体的实验研究

目的:建立Rh(D)血型的IgG类抗体适体的筛选方法,为后续合成适体并进行新生儿溶血病的防治研究奠定基础。方法:利用SELEX技术,构建含有52个随机序列的单链DNA文库,利用硝酸纤维素膜法筛选与IgG类抗体分子高亲和力结合的核酸分子,同时探索并优化将其扩增为双链DNA核酸库的PCR反应条件;通过膜结合实验检测核酸分子的富集效果并用凝胶阻滞实验初步测定所得核酸适体与Rh(D)血型IgG类抗体的亲和力。结果:随着筛选的进行,核酸分子的富集库向着与靶分子亲和性增强的方向进化,经过了11个循环,筛选出与Rh(D)血型IgG抗体结合力较强的核酸分子,与核酸结合的IgG分子在凝胶阻滞实验中显示出阻滞带。结论:初步建立了利用SELEX技术筛选人类Rh(D)血型IgG抗体适体的方法。     

连接肽长度对单链抗体与小分子半抗原结合力的影响

为了分析单链抗体的连接肽长度对其与小分子半抗原结合力的影响,本研究以含(G_4S)_3连接肽的伏马菌素特异单链抗体基因H2为模板,PCR扩增获得含G_4S和(G_4S)_2连接肽的单链抗体编码基因,分别命名为H2-5和H2-10,通过基因工程操作构建到p HENHi载体中,转化大肠杆菌XL1-Blue进行原核表达,纯化后利用ELISA检测单链抗体的亲和力。结果显示含不同长度连接肽的单链抗体均能在大肠杆菌中可溶性表达,单链抗体结合力与连接肽长度的关系为(G_4S)_3G_4S(G_4S)_2,即单链抗体H2与其抗原伏马菌素的亲和力最高,其次为H2-5和H2-10抗体。因此,含有较长连接肽的单链抗体能够自身折叠形成有活性的蛋白,并表现出与小分子半抗原更强的结合能力。     

单链抗体的制备及其在肿瘤诊疗中的应用

单链抗体(single-chain fragment variable, scFv)是由可变重链(VH)和可变轻链(VL)通过柔性肽接头连接在一起的小分子重组抗体。从杂交瘤中分离单链抗体的mRNA,逆转录成cDNA作为单链抗体基因扩增的模板,可得到包含大量不同VH和VL片段的单链抗体的基因文库。利用展示技术完成单链抗体亲和力和特异性筛选及鉴定,得到的单链抗体可通过各种表达系统成功表达单链抗体的蛋白质。虽然单链抗体分子量小,但已包含了完整抗体的抗原结合域,对抗原具有高特异性、高亲和力及低免疫原性,还具有较好的肿瘤组织穿透和扩散能力。因此,单链抗体已成为肿瘤诊疗方法开发中的研究热点。详细介绍了单链抗体的制备方法和问题,重点阐述了单链抗体在肿瘤诊断和治疗中的研究进展,以期为单链抗体制备及其治疗和诊断肿瘤提供理论依据。     

7肽和12肽两种M13噬菌体展示库筛选肿瘤坏死因子alpha拮抗肽的比较

肿瘤坏死因子alpha的拮抗剂是治疗多种炎症性自身免疫疾病的首选,但抗体类拮抗物因副作用明显而使用受限,尤其是机体内抗抗体的产生,严重影响治疗效果和药物代谢。而肽类物除免疫原性低之外,和小分子相比也有更低的毒性和更强的靶标特异性。使用7肽和12肽两种M13噬菌体展示库筛选TNFα拮抗肽,以分析7肽和12肽分别作为TNFα拮抗肽的亲和性与功能性。经过3~4轮的筛选和验证,得到2条7肽序列和2条12肽序列。利用ELISA方法检测合成肽与TNFα结合的亲和性,编号632的7肽亲和性最强,Kd=138nmol/L;编号636的12肽亲和性稍差,Kd=8.59μmol/L。InsightⅡ软件分别分析632肽和636肽与TNFα二聚体结合,发现632肽与TNFα二聚体结合更加稳定,并且在细胞水平上632肽拮抗TNFα活性功能比636肽更强,有632肽存在的条件下TNFα诱导的L929细胞生存率上升了3倍,而636肽的作用只有2倍。7肽比12肽更适合作为TNFα拮抗肽。     

胰岛素B链N端和C端缩短对其与胰岛素抗体结合力的影响

本文研究了B链N端和C端缩短的若干胰岛素类似物与胰岛素抗体的结合能力。结果表明:去B链C端五肽胰岛素(DPI)分子中B_1-Phe去除后其与胰岛素抗体结合力明显下降,这与去B_1-Phe胰岛素与胰岛素抗体结合力下降的趋势相似;去B链C端六肽胰岛素(DHI)与胰岛素抗体结合力与DPI非常接近,都为胰岛素的70%左右。而去B链C端七肽胰岛素(DHPI)与胰岛素抗体结合力与去B链C端六肽胰岛素(DHI)相比,其结合力下降了一个数量级。说明胰岛素B_1-和B_(24)-Phe残基对组成和维持胰岛素分子的抗原决定簇起着重要作用。去B链九肽胰岛素(DNI)与胰岛素抗体的结合力与去B链C端八肽胰岛索(DOI)及DHPI相似。本文对上述结果进行了讨论。     

基于TAP分子亲和力模型预测MHCⅠ类分子提呈短肽的免疫原性

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子亲和力模型有助于筛选出候选短肽,为实验确定可以与MHCⅠ类分子形成复合物从而激活细胞毒性T细胞的短肽提供帮助;抗原处理相关转运体(transporter associated with antigen processing,TAP)分子亲和力模型也可用于筛选候选短肽;如何更好利用两类亲和力模型筛选出候选短肽、这两类亲和力模型对短肽选择性的异同以及这种选择性异同的生物学机制尚不清楚.本文重新整理了TAP亲和力测试集,使训练样本达到699个;使用核函数平衡矩阵算法建立的TAP亲和力模型预测精度高于同类算法,5折交叉检验Pearson相关系数0.89;结合HLA A3分子亲和力模型、TAP亲和力模型显著提高免疫原性短肽预测精度,AUC值从～0.82上升到0.87.提高的原因是两个亲和力模型对第2、9位置"最佳"氨基酸不同偏好性和这种不同偏好的互补性造成的.TAP分子与短肽模拟对接结果反映了这个结论.TAP亲和力可在线预测(http://www.bilologymaths.top/mbtwo...     

甲型副伤寒结合疫苗人免疫血清破伤风类毒素抗体亲和力的检测与分析

目的 建立甲型副伤寒结合疫苗人免疫血清中破伤风类毒素(tetanus toxoid, TT)抗体亲和力的检测方法,探究甲型副伤寒结合疫苗免疫人体后,免疫系统对载体蛋白质TT的亲和力成熟情况,并分析与免疫后抗体含量增长情况的关系。方法 采用间接ELISA检测甲型副伤寒结合疫苗免疫前后血清中TT抗体含量,利用硫氰酸钾(potassium thiocyanate, KSCN)洗脱测定抗体亲和力。检测免疫后抗体含量高增长倍数组(免疫后相比免疫前抗体含量增长>10倍)和低增长倍数组(免疫后相比免疫前抗体含量增长<2倍)血清,计算相对亲和力指数。结果 KSCN洗脱对TT与酶标板之间的物理性吸附没有影响(P>0.05)。KSCN的最适洗脱浓度为3.1 mol/L。对于高抗体含量增长倍数组,免疫后相比免疫前抗体亲和力明显成熟,免疫前与免疫后抗体亲和力差异有统计学意义(P=0.005 0,P<0.05),对于低抗体含量增长倍数组免疫后抗体亲和力成熟不明显,免疫前与免疫后抗体亲和力差异无统计学意义(P=0.852 2,P>0.05)。结论 KSCN可用于甲型副伤寒结合疫苗人免...     

白细胞介素2亲和性配体的筛选

白细胞介素2(IL-2)及其受体拮抗剂的研究对免疫抑制药物的研制具有重要作用.抗白细胞介素2受体α链中和性单克隆抗体5G1(抗Tac型抗体)能够特异性地阻断IL-2与其受体的结合.因此,5G1可作为目标分子被用来在噬菌体展示肽库中筛选白细胞介素2的亲和性配体.经过4轮亲和性筛选以及5G1亲和活性的测定,6个具有明显5G1亲和活性的噬菌体克隆被发现.DNA序列分析结果显示出,所得到的肽序列具有明显的保守性,即SSFT(L/P)I.该序列与IL-2受体α链没有同源性.因此,SSFT(L/P)I可能模拟了IL-2受体α链上的一个不连续表位(mimotope),为白细胞介素2亲和性配体片段.     

血管内皮生长因子人单链抗体--基因克隆、高效表达、亲和力成熟及生物活性鉴定

利用抗体噬菌体展示技术, 克隆了血管内皮生长因子人基因工程单链抗体, 抗体表达量达菌体总蛋白的45%. 用层析柱复性技术同步完成抗体的纯化和复性. 生物活性实验表明, 该抗体不仅特异结合人VEGF165, 而且竞争抑制VEGF165与其受体的结合. 为了提高单链抗体的亲和力, 采用错配PCR法, 随机突变抗体重链可变区基因, 建立次级抗体突变库, 并从中筛选出高亲和力突变株. 研究了抗体突变株蛋白质三维结构特点及其与亲和力的关系, 这些结果不仅为肿瘤血管靶向治疗奠定了基础, 而且为抗体的高效表达及其亲和力体外成熟提供了参考模型.     

重组单链抗体-低分子质量尿激酶融合蛋白在 CHO 细胞中的抗降解研究

抗人纤维蛋白单链抗体-低分子质量尿激酶(Ⅱn-UK)融合蛋白,兼有单链抗体对纤维蛋白的亲和性和尿激酶的溶栓活性,有望开发成为新型导向溶栓药物.但基于通用连接肽(G4S)3的Ⅱn-linker-UK融合蛋白在CHO细胞中表达时出现明显的降解.为了解决此问题,利用分子生物学方法,对Hn-UK融合蛋白进行了分子改造,包括置换连接肽,改变两个半分子(moiety)的相对位置,以及对连接肽附近明确的蛋白酶位点进行突变等方法,并分别研究了改造后的11种Ⅱn-1inker-UK或UK-linker-Ⅱn突变体在CHO细胞中分泌性表达时的稳定性,最终筛选到一种抗降解的突变体.     

人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体-尿激酶融合蛋白在大肠杆菌中的功能性表达

尿激酶是目前临床上广泛使用的一种有效的溶栓制剂 ,但由于尿激酶缺乏对血栓的特异亲和性 ,导致临床上尿激酶的使用剂量较大 ,容易出现全身性出血等副作用。因而开发对血栓特异的导向溶栓制剂是目前溶栓药研制的一个重要方向。本实验室在以前的工作中 ,利用噬菌体表面呈现技术 ,筛选到一种对人纤维蛋白特异的鼠单链抗体[1 ] ,在对该鼠抗体可变区进行结构模建的基础上[2 ] ,对其进行了人源化改造和体外亲和力成熟 ,得到亲和力和特异性较鼠抗体更好的人源化单链抗体[3 ] 。为研制导向溶栓制剂 ,本实验室构建了人源化单链抗体 低分子量尿激酶的…     

噬菌体抗体库技术筛选抗VEGF165单克隆抗体

目的:获得抗血管内皮生长因子165(VEGF165)单克隆抗体,并对其功能进行初步验证。方法:利用噬菌体抗体库展示技术筛选与VEGF165结合的噬菌体克隆并测序,以测序正确的阳性克隆质粒为模板,PCR扩增抗体的轻重链可变区基因,并克隆至哺乳动物细胞表达载体中,构建全抗体表达载体;将全抗体表达载体转染293E细胞,收取培养细胞上清,利用ProteinA亲和纯化抗体;通过结合ELISA、表面等离子共振检测抗体的亲和力,以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为模型验证抗体功能。结果:经过噬菌体抗体库展示技术筛出1个与VEGF165特异性结合的抗体序列VG2;293E细胞表达了VG2全抗体蛋白,SDS-PAGE显示VG2抗体纯度较高;BIAcore检测结果表明该抗体具有较高亲和力(KD=0.56nmol/L),竞争抑制ELISA结果表明VG2抗体能抑制VEGF与VEGF受体(VEGFR)的结合(IC50为1.470μg/mL),进一步实验结果表明VG2能够抑制VEGF引起的HUVEC增殖。结论:制备了靶向VEGF165的全人源单克隆抗体VG2,该抗体具有较高的亲和力,能阻断VEGF165/VEGFR2的结合,并抑制HUVEC的增殖,可以作为潜在药物应用于肿瘤治疗。     

细胞间粘附分子1特异结合肽的筛选及其生物功能

采用两种方法对噬菌体展示随机十五肽库进行亲和淘选 .ELISA法筛选特异结合高亲和力的阳性噬菌体单克隆 ,测序 ,得到 6个与人细胞间粘附分子 1(ICAM 1)高亲和力的噬菌体展示十五肽单克隆 .再经ELISA法从这 6个噬菌体单克隆中选择与ICAM 1亲和力最高的单克隆 ,同时利用蛋白空间结构位象模拟技术对小肽与ICAM 1的亲和力进行模拟研究 .最终获取目的小肽的氨基酸序列为GRGEFRGRDNSVSVV .目的单克隆噬菌体与ICAM - 1的亲和常数Ka 为 7 87× 10 7L mol .体外合成、纯化并标记目的小肽 .ELISA法验证目的小肽与人ICAM 1的结合呈浓度依赖性 ,抗ICAM 1多抗不能拮抗目的小肽与ICAM 1的结合 .采用免疫组化方法证实 ,此目的小肽具有与炎症组织中高表达的ICAM 1特异性结合的功能 .在动物体内 ,荧光标记的目的小肽具有向高表达ICAM 1的炎症部位特异性聚集的功能 .说明此目的肽可尝试作为以ICAM 1为靶的“肽导向药物”的前导肽 .     

核受体PPARγ结合小肽的筛选及其功能

为筛选与核受体过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)结合的功能短肽,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达PPARγ配体结合域(LBD)的融合蛋白,并利用Ni2+-NTA离子交换树脂对表达蛋白进行纯化.以此纯化蛋白为靶,采用固体包被法对噬菌体展示随机十二肽库及环七肽库进行亲和筛选.经ELISA法鉴定特异结合的高亲和力阳性噬菌体单克隆并测序.同时利用PPARγ的配体rosiglitazone与噬菌体小肽进行竞争性结合抑制实验.最终获得与PPARγ-LBD高亲和力的十二肽3个,环七肽5个,分别含LXXLL和DXXRW(其中X为非特异氨基酸残基)保守序列.Rosiglitazone不影响噬菌体小肽与靶蛋白的结合,说明获得与配体rosiglitazone结合位点不同的目的肽.     

从噬菌体抗体库中淘选血纤维蛋白特异的单链抗体

为构建小鼠噬菌体抗体库 ,以获得对人血纤维蛋白特异的抗体 ,由小鼠脾脏提取 m RNA,经反转录 PCR扩增出抗体重链、轻链可变区基因片段 ,将二者和一段编码十五肽 (Gly4 Ser) 3的 DNA接头借助重组 PCR组装成为单链抗体 (single- chain antibody,Sc Ab)基因 .将单链抗体基因插入噬菌体展示载体 p CANTAB- 5E,通过电击法转化大肠杆菌 TG1细胞 ,用辅助噬菌体 M1 3K0 7超感染 ,构建了库容量在 1 0 8以上的噬菌体单链抗体库 .利用亲和选择方法 (淘选 ) ,从噬菌体抗体库中选得血纤维蛋白特异的单链抗体 .模拟抗体成熟过程 ,用 DNA改组 (DNA shuffling)技术使抗体基因重新组合 ,构建新的改组抗体库 ,并从中选择到提高了亲和力的噬菌体单链抗体 .抗体基因在大肠杆菌中表达 ,表达蛋白经 Sephadex G- 75柱层析分离 ,得到初步纯化的单链抗体蛋白 .     

肽适体的筛选及其应用

近年来,生物传感器得到了长足发展,其中适配体的研究起到了重要推动作用.肽适体是可与靶标物质特异性结合的短肽.受制于筛选、合成以及纯化方法,肽适体的发展目前落后于核酸适配体,但是肽适体的高亲和力、强特异性、良好的生物亲和性等系列优越性,让肽适体具有巨大应用前景.肽适体的筛选获得可通过多种方式完成,除了传统的酵母双杂交、噬菌体展示、核糖体展示等技术,新兴的基于生物信息学的分子对接预测等技术更是加速了肽适体的发展.肽适体不仅可直接应用于临床医疗,还可设计成生物传感器广泛应用于精准营养、环境监测以及新型材料识别等领域.本文旨在对肽适体筛选及其应用做全面的梳理.     

高亲和力抗乙型肝炎病毒PreS1的人源单链抗体的获得:天然及免疫抗体库的对比研究( 英文)

以健康人的外周血淋巴细胞为来源 ,以偶联BSA的乙型肝炎病毒PreS1肽体外免疫 .分别从免疫和未经免疫的淋巴细胞提取RNA ,扩增抗体基因 ,构建大容量天然单链抗体 (scFv)噬菌体展示文库和体外免疫scFv抗体库 .以PreS1肽进行 3轮淘选后 ,抗原抗体反应结果显示 ,从免疫库中获得了亲和力 10 -7～ 10 -8M的抗乙型肝炎病毒PreS1的单链抗体 ,高于天然库的结果 (10 -6～ 10 -7M ) .测序结果表明两株抗体均为人抗体 .为基因工程抗体用于临床治疗乙型肝炎奠定基础 .同时证明淋巴细胞体外免疫方法构建的免疫抗体库优于大容量天然抗体库 .     

噬菌体展示文库的筛选技术

噬菌体展示技术(PhageDisplayTechniques,PDT)是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术。该技术作为筛选与多种靶分子(如抗体、酶类、细胞表面受体等)具有特异性亲和力或活性的肽的一个有效方法,自问世以来,已取得了很大的发展,并被广泛地应用于基因治疗、基因疫苗研究、抗原表位研究、药物设计、研究细胞信号传导等领域[1]。但该技术在两方面仍需进一步完善:(1)寻求更为有效的表达载体;(2)进一步完善筛选方法。     

高亲和力抗乙型肝炎病毒PreS1的人源单链抗体的获得:天然及免疫抗体库的对比研究

以健康人的外周血淋巴细胞为来源,以偶联BSA的乙型肝炎病毒PreS1肽体外免疫.分别从免疫和未经免疫的淋巴细胞提取RNA,扩增抗体基因,构建大容量天然单链抗体(scFv)噬菌体展示文库和体外免疫scFv抗体库.以PreS1肽进行3轮淘选后,抗原抗体反应结果显示,从免疫库中获得了亲和力10-7～10-8 M的抗乙型肝炎病毒PreS1的单链抗体,高于天然库的结果(10-6～10-7 M).测序结果表明两株抗体均为人抗体.为基因工程抗体用于临床治疗乙型肝炎奠定基础.同时证明淋巴细胞体外免疫方法构建的免疫抗体库优于大容量天然抗体库.     

丙型肝炎病毒核壳蛋白抗原的化学合成及其在血清学诊断中的应用

选取丙型肝炎病毒(HCV)核壳蛋白区两个可能含有优势抗原表位的19和16氨基酸的肽殴(C-19肽和C-16肽),利用固相多肽合成技术进行了化学合成。经用反相高压液相层析(HPLC)及脉冲液相多肽测序技术检定合成肽产品的纯度及序列后,以C-19和C-16肽作为包被抗原组装成检测HCV血清抗体的ELISA诊断试剂。用所组装的合成肽试剂检测中国药品生物制品检定所提供的HCV标准参比血清,并比较利用该试剂和美国Abbott实验室生产的HCV第二代EIA诊断试剂平行检测109份献血员血清的结果,表明C-19肽能够特异、重复、灵敏地检出HCV血清抗体,可以作为我国第一代HCV诊断试剂的合成肽抗原。