BE3型胞嘧啶碱基编辑器在谷氨酸棒杆菌中的开发及应用

碱基编辑技术结合了CRISPR/Cas系统的靶向特异性与碱基脱氨酶的催化活性,因其不产生双链DNA断裂、不需要外源DNA模板、不依赖同源重组修复,自开发以来,便受到研究者的追捧,在哺乳动物细胞、植物、微生物等领域相继得到开发与应用。为了进一步丰富碱基编辑系统在谷氨酸棒杆菌中的应用,将鼠源胞嘧啶脱氨酶(rAPOBEC1)与nCas9蛋白融合,实现了在谷氨酸棒杆菌中C到T的编辑,编辑比例较低(0-20%);在上述融合蛋白C端添加UGI蛋白,构建BE3型胞嘧啶碱基编辑器,抑制体内的DNA碱基切除修复机制,显著的提高了碱基编辑效率,使得C到T的碱基编辑效率高达90%;为了简化操作,将双质粒碱基编辑系统优化为单质粒碱基编辑系统,并显著提高转化效率;最后通过单质粒碱基编辑系统对基因组中其他位点的编辑测试,进一步证明了BE3型碱基编辑器在谷氨酸棒杆菌中的高效性,同时发现该碱基编辑器具有较宽的编辑窗口(PAM上游-11到-19位),有助于覆盖更多的基因组靶标位点,为谷氨酸棒杆菌的基因组改造提供了更多的工具选择。     

中国科学家发现胞嘧啶单碱基编辑工具存在 基因组范围的脱靶

基于CRISPR-Cas的单碱基编辑工具是近2年基因组编辑技术的重大突破之一, 已经在人类(Homo sapiens)细胞和动植物中得到了验证与应用。最近, 中国科学家分析了胞嘧啶编辑器(CBE) BE3和HF1-BE3, 以及腺嘌呤编辑器(ABE)等单碱基编辑工具在水稻(Oryza sativa)中的脱靶现象, 发现BE3和HF1-BE3两个CBE在全基因组范围内存在脱靶编辑, 而ABE则没有脱靶现象。这一发现对单碱基编辑工具的应用和进一步改进具有重要意义。     

中国科学家发现胞嘧啶单碱基编辑工具存在 基因组范围的脱靶

基于CRISPR-Cas的单碱基编辑工具是近2年基因组编辑技术的重大突破之一, 已经在人类(Homo sapiens)细胞和动植物中得到了验证与应用。最近, 中国科学家分析了胞嘧啶编辑器(CBE) BE3和HF1-BE3, 以及腺嘌呤编辑器(ABE)等单碱基编辑工具在水稻(Oryza sativa)中的脱靶现象, 发现BE3和HF1-BE3两个CBE在全基因组范围内存在脱靶编辑, 而ABE则没有脱靶现象。这一发现对单碱基编辑工具的应用和进一步改进具有重要意义。     

碱基编辑技术的发展与应用

碱基编辑技术,以CRISPR/Cas系统为平台,引导胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶至特定的基因组靶点,产生靶向性的C至T或者A至G的碱基转换。自碱基编辑技术问世以来,全球多个科研团队通过优化改进得到了一系列高精准性、广靶向性、小编辑框、普适性的碱基编辑器。在应用方面,碱基编辑器能够在人体细胞、动植物细胞以及胚胎中进行高效的碱基转换,在治疗人类遗传病、构建动物疾病模型、植物育种等方面具有巨大的应用潜能。本文就碱基编辑技术的发展、优化和应用等方面进行综述和展望。     

碱基编辑器的开发及其在细菌基因组编辑中的应用

碱基编辑器是近两年发展起来的新型基因组编辑工具,它将碱基脱氨酶的催化活性和CRISPR/Cas系统的靶向特异性进行结合,催化DNA或RNA链上特定位点的碱基发生脱氨基反应,进而完成碱基的替换。碱基编辑器分为DNA和RNA碱基编辑器两大类,其中DNA碱基编辑器分为两种:胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器;前者可以实现胞嘧啶到胸腺嘧啶的转换,而后者则可以将腺嘌呤突变为鸟嘌呤。由于DNA碱基编辑器不会造成DNA的双链断裂(DSB),也不依赖于宿主的非同源末端修复和同源重组途径,因此,大大减少了DSB相关的编辑副产物,如小片段插入或缺失等。基于CRISPR/Cas系统的RNA碱基编辑器,可以实现RNA链上腺嘌呤核苷到次黄苷的转换。本文对不同类型碱基编辑器的开发过程、适用范围和编辑特点等进行梳理,并对其在细菌基因组编辑中的应用进行了介绍;最后简要探讨了细菌中碱基编辑器的缺点以及将来可能的研究方向。     

BEguider:一个单碱基编辑器sgRNA设计与编辑效率预测工具

单碱基编辑器是实用且高效的基因编辑工具,其编辑效率与单向导RNA(single guide RNA, sgRNA)序列的设计密切相关。目前单碱基编辑器sgRNA序列的设计缺少特定的法则,主要依靠经验和大量尝试完成。本研究基于卷积神经网络,开发了一个单碱基编辑器sgRNA序列设计工具BEguider。BEguider利用TensorFlow 2深度学习框架建立编辑效率预测模型,能够在人基因组范围内针对NGG PAM序列依赖的单碱基编辑器ABE7.10-NGG和BE4-NGG批量设计sgRNA序列,预测编辑效率。此外,通过整合Cas-OFFinder, BEguider能够提供对sgRNA脱靶情况的评估。利用BEguider设计sgRNA序列,有助于研究人员提高实验效率,节约实验成本。     

RNA碱基编辑及其在疾病治疗中的研究进展

基于CRISPR的碱基编辑器是生物学研究的强大工具,并为遗传病的治疗带来新的希望.然而, DNA碱基编辑器的潜在脱靶效应却带来了治疗上的风险.相比之下, RNA水平的碱基编辑具有相对灵活、可逆且风险较低的特点,并在纠正疾病相关点突变方面取得了重大进展,对生物学基础研究和治疗学的发展产生了深远的影响.本文总结了新兴的基于A-to-I、C-to-U、假尿嘧啶修饰等的RNA碱基编辑器,全面概述了其设计、效率和在疾病治疗中的应用.最后,本文深入讨论了RNA碱基编辑在疾病治疗上的局限性和可能的发展方向,以期对RNA基因编辑实践提供理论参考.     

碱基编辑系统研究进展

碱基编辑技术(base editing)是基于CRISPR/Cas系统发展起来的新型靶基因修饰技术,目前依据碱基修饰酶的不同可分为胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor, CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor, ABE)。这两类碱基编辑系统利用胞嘧啶脱氨酶或人工进化的腺嘌呤脱氨酶对靶位点进行精准的碱基编辑,最终可以分别实现C-T (G-A)或A-G (T-C)的碱基替换。碱基编辑技术自2016年被开发以来,因其高效、不依赖DNA双链断裂产生、无需供体DNA参与等优势,已经成功应用在各种动物、植物及其他生物中,为基因治疗及精准作物育种等领域提供了重要技术支撑。本文从碱基编辑技术的特点、开发过程、优化、应用、脱靶效应及改善策略等方面进行了系统介绍,最后对未来需要迫切解决的一些问题进行了分析和展望,以期为相关领域的科研人员进一步了解、使用及优化碱基编辑系统提供参考。     

碱基编辑系统研究最新进展及应用

CRISPR系统能够在基因组DNA中完成精准编辑,但依赖于细胞内的同源重组(Homologydirected recombination,HDR)修复途径,且效率极低。基于CRISPR/Cas9系统开发的碱基编辑技术(Base editing)通过将失去切割活性的核酸酶与不同碱基脱氨基酶融合,构建了两套碱基编辑系统(Baseeditors,BE):胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)。这两类编辑器分别能够在不产生DNA双链断裂的前提下在基因靶位点完成CT (GA)或AG (TC)的替换,最终实现精准的碱基编辑。目前碱基编辑技术已经广泛应用于基因治疗、动物模型构建、精准动物育种和基因功能分析等领域,为基础和应用研究提供了强大的技术工具。文中概括了碱基编辑技术的研发过程、技术优势、应用现状、存在问题及改进策略,以期为相关领域的科研人员了解和使用碱基编辑系统提供参考。     

基因编辑人多能干细胞用于心脏疾病研究

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是导致人类死亡的主要原因之一。体外的细胞模型有助于提高对这些疾病的研究能力。人多能干细胞(human pluripotent stem cell,hPSC)的多向分化潜能,为建立各种细胞或组织模型提供了可能。同时,近年来开发的几种新型基因组编辑工具,包括CRISPR/Cas系统、碱基编辑器(base editor,BE)以及引导编辑器(prime editor,PE)大大提高了构建和测试细胞疾病模型的速度和有效性。人多能干细胞和基因组编辑技术的结合为理解和治疗疾病提供了新的方法。在这篇综述中,讨论了几种最流行的基因组编辑技术的优缺点,以及其在心血管疾病中潜在的应用。     

基因编辑之“新宠”—单碱基基因组编辑系统

近年发展起来的人工核酸酶可通过引起特定位点的DNA双链断裂实现对目的片段的有效编辑。为进一步提高碱基修改的效率和精确度,2016年研究者们利用CRISPR/Cas9识别特定DNA序列的功能,结合胞嘧啶脱氨酶的生化活性发明了将胞嘧啶高效转换为胸腺嘧啶(C>T)的嘧啶单碱基编辑系统(base editor)。这一系统虽然能精准实现嘧啶直接转换,大大提高精确基因编辑效率,但美中不足的是无法对嘌呤进行修改。近期,Nature报道了将细菌中的tRNA腺嘌呤脱氨酶定向进化形成具有催化DNA腺嘌呤底物的脱氨酶,将其与Cas9系统融合发明了具有高效催化腺嘌呤转换为鸟嘌呤的新工具—腺嘌呤单碱基编辑系统(ABEs, adenine base editors)。本文总结了单碱基编辑工具的发展历程和最新研究进展,着重介绍ABEs的研发过程,并对单碱基编辑工具今后的应用方向和研发方向进行展望。     

基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术研究进展*

基于CRISPR/Cas系统出现的单碱基编辑技术可以实现高效且简便的单个碱基的替换编辑,其原理是将胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)或腺苷脱氨酶(adenosine deaminase)与Cas9n(D10A)形成融合蛋白,通过CRISPR/Cas精准识别和定位DNA上的靶位点后,利用胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶将靶点距离sgRNA位点基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列端的4~7位的单个碱基发生单碱基转换或颠换。对基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术发现的历史、组成和分类、工作原理进行了概述,并总结了该系统最新进展及应用。     

基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术研究进展*

基于CRISPR/Cas系统出现的单碱基编辑技术可以实现高效且简便的单个碱基的替换编辑,其原理是将胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)或腺苷脱氨酶(adenosine deaminase)与Cas9n(D10A)形成融合蛋白,通过CRISPR/Cas精准识别和定位DNA上的靶位点后,利用胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶将靶点距离sgRNA位点基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列端的4~7位的单个碱基发生单碱基转换或颠换。对基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术发现的历史、组成和分类、工作原理进行了概述,并总结了该系统最新进展及应用。     

基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑技术及其在生物医学和农业中的应用

近年来,基于成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas)的基因编辑技术飞速发展,该系统可以利用同源定向重组(Homology directed repair,HDR)来完成其介导的精准编辑,但效率极低,限制了其在农业和生物医学等领域上的推广应用。基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑技术作为一种新兴的基因组编辑技术,能在不产生双链断裂的情况下实现碱基的定向突变,相对于CRISPR/Cas介导的HDR编辑具有更高的编辑效率和特异性。目前,已开发出了可将C碱基突变为T碱基的胞嘧啶碱基编辑器(Cytidine base editors,CBE),将A碱基突变为G碱基的腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editors,ABE),以及可实现碱基任意变换和小片段精准插入和缺失的Prime编辑器(Prime editors,PE)。另外,能实现C到G颠换的糖基化酶碱基编辑器(Glycosylase base editors,GBE)以及能同时编辑A和C两种底物的双碱基编辑器也已被开发出来。文中主要综述了几种DNA碱基编辑器的开发历程、研究进展及各自优点和局限性;介绍了DNA碱基编辑技术在生物医学以及农业中的成功应用案例,以期为DNA碱基编辑器的进一步优化和选择应用提供借鉴。     

基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑研究进展

基于CRISPR/Cas的基因编辑是近年发展起来的一项变革性生物技术。其过程包括在目标DNA位点引入双链断裂(double strand break,DSB)以及其后续的细胞修复。细胞修复DSB主要有两种方式：非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)以及同源重组介导的修复(homology-directed repair,HDR)。前者是大多数细胞修复DSB的主要方式,其特点在于修复简单、效率高但极易出错,往往会引发难以预测的核苷酸插入或删除。点突变是自然界中最常见的遗传突变类型,引起了超过半数的人类遗传疾病以及许多重要农艺性状变异。碱基编辑能够实现单个碱基的替换,既不需要引入DSB,又无需修复模板参与,具有高效、编辑结果可控等优点,在基因治疗、作物育种及生物技术研究等方面具有重大的应用潜能。自首个碱基编辑工具开发以来,碱基编辑相关技术得到快速发展及广泛应用。本文综述了目前DNA碱基编辑研究进展,重点阐述了碱基编辑器及其在编辑效率、精度以及特异性提高和编辑范围扩展等方面的最新进展以及仍存在的瓶颈,并展望其研究和应用前景。     

谷氨酸棒杆菌中基于CRISPR/Cas9的多位点碱基编辑系统的优化

作为新型的基因组编辑工具,碱基编辑技术结合了CRISPR/Cas系统的定位功能和碱基脱氨酶的编辑功能,可实现特定位点的碱基突变,具有不产生双链DNA断裂,无需外源模板且不依赖染色体DNA同源重组的优势.目前,研究者们已在重要的工业生产菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中开发了多种碱...     

核酸脱氨酶的研究进展

核酸脱氨酶是一类以DNA或RNA为底物,催化其胞嘧啶或腺嘌呤脱氨基的锌离子依赖酶,可引起碱基的改变,在生物体的免疫防御、神经调控等多种生理过程中扮演重要角色,并且已有多种脱氨酶被开发为精准高效的碱基编辑器。该文就核酸脱氨酶的结构与功能特征进行系统概述,并探讨了该类酶的起源与演化,为后续有关研究与应用提供参考。     

单碱基编辑技术的原理、发展及其在家畜育种中的应用

基因编辑技术CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)在家畜育种领域得到广泛应用,但其效率低下,且存在非靶向切割、安全性较低等问题,极大地限制了家畜育种中单碱基突变的引入。单碱基编辑(single base editing)作为一种最新的基因编辑工具,能够在不导入双链断裂的情况下直接进行碱基的替换,具有编辑效率高和特异性强的特性,为家畜育种的精确基因修饰提供了一种更简单、更有效的方法。本文主要介绍了单碱基编辑系统的原理及发展进程和碱基编辑技术在家畜育种中的应用,以期为单碱基编辑器在家畜育种中进一步优化和选择应用提供参考。     

基于基因编辑技术的非人灵长类动物模型构建

非人灵长类疾病模型在生命科学和生物医药领域具有非常重要的地位。近年来,随着经典的靶向核酸酶(ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9)基因编辑技术的出现,科学家已经成功获得了多种人类疾病相关的非人灵长类模型。该文首先介绍了经典基因编辑技术和以此为基础开发的单碱基编辑(base editing, BE)以及先导编辑(prime editing, PE)技术的研究进展,随后对近年来通过不同基因编辑技术获得的非人灵长类疾病模型进行了综述,最后对目前已获得的和正在构建的非人灵长类模型的管理、保种以及动物伦理和福利等方面进行了展望。     

CRISPR/Cas9:基因编辑的新时代

基因编辑技术是通过核酸内切酶对基因组DNA进行定向改造的技术,可以实现对特定DNA碱基的缺失、替换等,常用的四种基因编辑工具分别是:巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶以及CRISPR/Cas9系统。其中CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术具有组成简单、特异性好、切割效率高的优点。该文对CRISPR/Cas9系统的结构组成和功能机制,动植物基因靶向编辑和人类在遗传性疾病、病毒感染性疾病以及肿瘤方面进行综述,旨在对CRISPR/Cas9系统的现状和发展进行总结和展望。