乙酰胆碱酯酶基因工程技术研究进展

乙酰胆碱酯酶（AChE）是一种催化乙酰胆碱分解的水解酶。它与有机磷农药有特异反应。利用AchE基因工程技术进行有机磷农药的快速检测、人类疾病防治、生态环境保护和昆虫的抗药性等方面的研究具有非常重要的意义。该文综述了当前国内外有关AchE的基因克隆技术与表达系统的研究进展,并对AchE转基因技术的现状和问题进行了分析讨论。展望了AChE基因工程技术在农药快速检测、环境保护、人类疾病防治等领域中的应用前景。     

乙酰胆碱酯酶作为水体中杀虫剂污染生物标志物的评价与展望

随着"污染控制与治理为主的治理时代"运渐向"预防为主的环境管理时代"迈进,乙酰胆碱酯酶用于水体中杀虫剂污染的早期预警研究已成为生态毒理学的热门领域之一.本文以近年来该领域的研究成果为基础,指出了乙酰胆碱酯酶作为监测水体中杀虫剂污染生物标志物的特异敏感性优势,并针对该生物标志物应用过程中尚未解决的难题提出了今后的发展方向.     

抗性小菜蛾的乙酰胆碱酯酶敏感性

用FAO推荐的点滴法测定了小菜蛾Plutella xylostella(Linn.)对马拉硫磷和西维因的抗药性,并对抗性?和敏感(S)小菜蛾幼虫的胆碱酯酶(ChE)的性质、活性、动力学和抑制作用进行了研究.广州天河、上海梅陇的小菜蛾对马拉硫磷的抗性分别是江西南昌种群的113.8和27.4倍;它们对西维因的抗性是》3.1倍.R幼虫ChE对乙酰胆碱(ATCh)、丙酰胆碱(PrTCh)和丁酰胆碱(BuTCh)的活性分别是S幼虫的0.3、0.7和9.9倍;它们的V_max分别是0.4、1.4和7.0倍;K_m分别是209.1,87和37.8倍.毒扁豆碱、西维因、对氧磷、敌敌畏和残杀威对R幼虫AChE的抑制中浓度I₅₀,分别是S幼虫的333.3,66.7,17.2,12.5和10.0倍.对氧磷、敌敌畏、残杀威和西维因对R幼虫的双分子速率常数K₁,分别是S幼虫的126.4,86.5,32.9和12.3倍.由此可见,AChE敏感度降低是小菜蛾对有机磷和氨基甲酸酯产生抗性的主要机理之一.本文中还讨论了防治抗性小菜蛾的策略.     

羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶在褐飞虱对马拉硫磷抗性发展中的作用

对室内筛选褐飞虱Nilaparvata lugens Stal对马拉硫磷抗性及羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶的连续变化进行了研究。结果表明,抗性发展在不同世代之间存在一定的变化。LD₅₀的最大变化发生在第3代和第5代之间。在筛选的前5代,羧酸酯酶活性上升与马拉硫磷抗性变化存在很好的相关性,而乙酰胆碱酯酶敏感性在第6代和第8代间的变化与抗性发展存在很好的相关性。可见,羧酸酯酶活性的上升在抗性发展的早期阶段起重要作用,而乙酰胆碱酯酶不敏感在抗性发展的后期阶段起更重要作用。     

重组乙酰胆碱酯酶的表达及其分子进化研究进展

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是酶抑制法检测农药残留的核心试剂。但天然提取的AChE存在含量低、纯化困难、稳定性差等不足,因此,高性能的重组AChE制备成为研究学者关注的热点。文中综述了重组AChE的表达、和分子进化等方面的研究成果,并指出酶定向进化策略与表面展示技术结合是重组AChE活性改造的未来趋势。     

繁殖寄主对赤眼蜂羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的影响

通过测定赤眼蜂Trichogramma羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活性、对底物的亲和力以及对抑制剂的敏感度研究了繁殖寄主对松毛虫赤眼蜂T.dendrolimi和螟黄赤眼蜂T.chilonis的影响。柞蚕卵和米蛾卵繁殖的赤眼蜂羧酸酯酶对底物的亲和力有不同程度的影响,柞蚕卵繁殖的赤眼蜂羧酸酯酶对α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯的亲和力最高是米蛾卵的2倍以上。繁殖寄主对乙酰胆碱酯酶对底物亲和力没有明显的影响。米蛾卵繁殖的松毛虫赤眼蜂羧酸酯酶活性明显高于柞蚕卵繁殖的种群,而米蛾卵繁殖的螟黄赤眼蜂种群羧酸酯酶的活性明显低于柞蚕卵繁殖的种群。用柞蚕卵繁殖的松毛虫赤眼蜂种群对对氧磷的敏感度明显低于米蛾卵繁殖的种群,而增效磷则正好相反。繁殖寄主对松毛虫赤眼蜂吉林种群乙酰胆碱酯酶对DDVP和毒扁豆碱的敏感度没有明显的影响,而在松毛虫赤眼蜂广东种群和螟黄赤眼蜂中,柞蚕卵繁殖的种群乙酰胆碱酯酶对DDVP和毒扁豆碱的敏感度明显低于米蛾卵繁殖的种群。     

甲基毒死蜱对红细胞乙酰胆碱酯酶的抑制作用及其与膜脂相互关系

以人红细胞膜为材料,研究了甲基毒死蜱与膜上乙酰胆碱酯酶的相互作用及其与膜脂的关系。结果显示,甲基毒死埤对人红细胞ＡＣｈＥ有明显的抑制作用,与膜温育３０ｍｉｎ,其半数抑制浓度约为０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ。动力学分析表明,其抑制作用为非竞争性。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００并不改变ＡＣｈＥ对甲基毒死蜱的敏感性,亦即ＡＣｈＥ上甲基毒死蜱的作用部位与其所处的脂质微环境无关。     

寄主植物对斜纹夜蛾酯酶和乙酰胆碱酯酶活性的影响

利用生物测定与生物化学的方法,就取食不同寄主植物的2个斜纹夜蛾[Spodoptera litura(Fab.)]品系对丙溴磷和灭多威的敏感性及其体内的酯酶与乙酰胆碱酯酶的活性变化进行了研究。结果表明,取食不同寄主植物的斜纹夜蛾对丙溴磷和灭多威的敏感性不同。在敏感品系中,取食不同食料的斜纹夜蛾后代对灭多威的敏感性顺序为:烟草<棉花<大豆<人工饲料;对丙溴磷而言,敏感性顺序则为:棉花<烟草<大豆<人工饲料。而在田间抗性品系中,对丙溴磷的敏感性顺序为:棉花<烟草<人工饲料<大豆;对灭多威的敏感性顺序为:棉花<烟草<大豆<人工饲料。此外,在田间抗性和敏感品系中,取食不同食料的斜纹夜蛾体内的酯酶活性之间均存在显著差异,对其乙酰胆碱酯酶的活性也有程度不同的诱导效应,但并不会引起乙酰胆碱酯酶的质变。     

乙酰胆碱酯酶在蚕豆保卫细胞中集中分布

动物细胞中,乙酰胆碱酯酶负责把乙酰胆碱水解为胆碱和乙酸以起到终止信号的作用。蚕豆（ＶｉｃｉａｆａｂａＬ．）保卫细胞原生质体表面具有特异的水解乙酰胆碱的酯酶,光可以激活该酶的活性。组织学定位的结果显示,酶反应产物主要分布于气孔保卫细胞内壁和腹壁的外侧及内壁和腹壁中,表明一种类似于动物突触传递的机制可能存在于气孔保卫细胞和周围细胞之间,即乙酰胆碱发挥作用后由乙酰胆碱酯酶分解以终止其作用;此外开放的气孔周围具有更高的酶活性,说明乙酰胆碱酯酶可通过水解气孔周围的乙酰胆碱而调控气孔运动     

大鼠食管胸段，腹段乙酰胆碱酯酶阳性神经的配布

大鼠食管胸段和腹段壁内乙酰胆碱酯酶（ＡＣｈＥ）阳性神经存在于神经束和分支的粗细神经纤维内,也见于外膜丛,肌间丛,粘膜下丛和粘膜肌内。食管肌层内ＡＣｈＥ阳性神经纤维多而密集,而食管腹段肌内尤为丰富,肌间神经纤维末梢分布于肌束表面,可能与控制肌纤维活动有关;分布于肌内,粘膜下层和上皮基部的ＡＣｈＥ阳性神经中,尚含有内脏感觉神经纤维。食管壁的肌间丛和粘膜下丛内散在有多极形和卵园形的ＡＣｈＥ阳性神经元,在食管腹段内数多,而以中小型神经元为主。     

Site-directed mutagenesis using positive antibiotic selection

Various mutsgenesis protocols have been established that use the hybridization of a mismatched oligonucleotide to prime DNA synthesis on an M13 phagemid template. For efficient mutagenesis, all of these methods require a means to select for the mutant strand before or during amplification in anEscherichia coli host. In the Altered Sites II protocol, the mismatched oligonucleotide and an oligonucleotide that restores antibiotic resistance to the phagemid are simultaneously hybridized to the template and coupled by DNA synthesis and ligation. The restored antibiotic resistance is then used to select only those phagemids which incorporate the antibiotic repair oligonucleotide. Generally, between 60 and 90% of the phagemids recovered will incorporate both oligonucleotides. This method provides a simple an efficient technique for introducing specific mutations into DNA.     

基于重叠延伸PCR法的定点突变技术

目的:建立一种高效而经济的定点突变方法。方法:采用重叠延伸PCR定点突变技术,引物设计时引入目的突变,以前两次PCR产物为模板,进行第三次PCR,即可获得突变后的目的DNA片段。将此片段连入pMDTM18-T载体后测序验证突变结果。结果:DNA测序表明,待突变位点已由ATTGG突变为ATTTT。结论:成功实现了目的位点的定点突变,重叠延伸PCR法是一种高效且经济的定点突变方法。     

一种改进的快速PCR定点突变技术

在基因工程与蛋白质工程研究中常常用到基因突变技术制备突变体,用于研究基因调控、蛋白质的结构与功能。本项研究在快速PCR定点突变技术的基础上,改进实验方法,简化实验步骤,以适用蛋白质结构改造研究的需要。建立的突变技术仅需一次PCR反应即可完成基因的定点突变,突变效率为79.6%左右。该法对1～3个连续碱基的突变和对间隔4个甚至多达15个碱基的数个密码子突变效果都很好。     

用定位突变探讨胰蛋白酶的稳定性

应用定位突变的方法,对鼠胰蛋白酶分子中易自溶位点的氨基酸残基进行改造,以探索提高胰蛋白酶稳定性的可能。将鼠胰蛋白酶原cDNA从质粒pTRAP上切下,插入载体M13mp8,在E.coli JM 101菌株中转化、复制后用以转染RZ1032缺陷型菌株,利用含U模板,进行按实验目的设计寡聚核苷酸引物引导的定位突变,将易自溶位点Ary105改造为Leu或Gly。经酶切和序列测定,证明在设计位点发生了预期的碱基突变。为了检查活性方便,又将含突变型胰蛋白酶cDNA从pTRAP上切下,插入另一个表达载体pTN中,转化入E.coli SM 138宿主中进行表达,表达产物分泌到围膜间隙,作专一性底物TAME活性胶方法检测,证明改造后的表达产物具有胰蛋白酶活性。对突变与野生型胰蛋白酶进行了初步比较。     

一种简便快速的单引物PCR定点突变方法

为了解决在一些特殊位点上利用Quick Change方法进行定点突变时会在突变位点处额外插入引物序列导致突变失败的问题,对Quick Change法进行了改良。改良方法为:合成在突变位点处点突变的一对反向互补引物,分别进行单引物PCR扩增,将两种扩增产物混合,变性复性后加入Dpn I进行酶切,酶切产物转化大肠杆菌DH5α,抗性筛选阳性克隆进行测序验证。利用此法成功突变紫穗槐二烯合酶(amorpha-4,11-diene synthase,ADS)基因中多个利用常规方法突变均因引入额外引物而无法成功的特殊位点,证明此方法实践上可行,而且也可以避免插入额外引物序列,这也从侧面证明额外引物插入的原因是双引物同时反应。     

定点突变提高D-氨甲酰水解酶的可溶性表达

采用定点突变的方法对皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)来源的D-氨甲酰水解酶(D-carbamoylase,DCase)编码基因的3个位点A18、Y30、K34进行突变,并将获得的突变体基因片段构建入高表达载体pET-28b中,转化E coli BL21( DE3),获得带有组合三突变(A18E/Y30D/K34E)的DCase-SM表达菌株BL21/pET-DCSM.当以IPTG诱导目的蛋白表达时,发现突变菌株(DCase-SM)与出发菌株(DCase)菌株相比,目的蛋白的可溶性表达显著提高,其可溶蛋白比例约为64％;与出发菌株相比,其单位菌体酶活增加427％;另外,与本实验室前期构建的高可溶性三叠加突变体菌株DCase-M3相比,单位菌体酶活亦增加7.9％.     

青霉素G酰化酶基因Ser177的定点突变

本研究用缺口以链法对肠杆菌青霉素Ｇ酰化酶（ＰＧＡ）基因Ｓｅｒ１７７进行寡核苷酸定点突变。通过ＮＩＰＡＢ（２－硝基－５－苯乙酰胺苯甲酸）试纸法筛选和测序鉴定,获得突变体Ｃｙｓ１７７,Ｇｌｙ１７７,Ａｒｇ１７７和Ａｓｎ１７７。它们的ＰＧＡ活性均已丧失。酶蛋白电泳分析表明突变体蛋白在体内正常表达。推测ＰＧＡ Ｓｅｒ１７７秀可能位于酶底物结合中心,是酶活性所必需,不能被置换。     

定点突变三种方法的比较研究

目的：通过使用优化后的定点突变三种方法分别对一个新基因重组载体进行定点突变研究,比较这几种定点突变方法的优缺点。方法：重叠延伸PCR法使用Stratagene在线定点突变引物设计程序从而使引物设计简化而可靠;MutaBEST定点突变试剂盒采用胶纯化试剂盒代替说明书推荐的酚-氯仿抽提质粒的方法以提高回收率;使用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶和超级感受态试剂盒代替Quikchange定点突变试剂盒的相应组分可使产物不受影响同时降低试验费用。结果：三种方法都能够获得单碱基突变重组载体。结论：QuikChange突变策略通过改进是一种高效、简洁、经济和可靠的定点突变方法。     

偶氮还原酶AZR的结构及其K109的定点突变研究

利用同源建模构建了Rhodobacter sphaeroides的偶氮还原酶AZR的三级结构模型,AZR为一种α/β型结构的黄素氧化还原蛋白.两类依赖黄素的偶氮还原酶的三级结构对比表明它们具有高度的相似性.在序列和结构对齐分析的基础上,选择保守位点K109进行K109A和K109H的定点突变研究.突变后K109H的最适Ph=6,而K109A的最适Ph=9.突变未改变AZR的最适温度(30℃).第109位正电荷残基对甲基红的结合有重要影响;而K109H对NADPH的结合并非保守突变.K109可能只参与对NADPH的2'-磷酸基团的结合,而对NADH的结合无影响.     

偶氮还原酶AZR的结构及其K109的定点突变研究

利用同源建模构建了Rhodobacter sphaeroides的偶氮还原酶AZR的三级结构模型, AZR为一种a/b型结构的黄素氧化还原蛋白。两类依赖黄素的偶氮还原酶的三级结构对比表明它们具有高度的相似性。在序列和结构对齐分析的基础上, 选择保守位点K109进行K109A和K109H的定点突变研究。突变后K109H的最适pH=6, 而K109A的最适pH=9。突变未改变AZR的最适温度(30℃)。第109位正电荷残基对甲基红的结合有重要影响; 而K109H对NADPH的结合并非保守突变。K109可能只参与对NADPH的2’-磷酸基团的结合, 而对NADH的结合无影响。