利用昆虫-杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16/18/33/58亚型L1蛋白

目的:通过昆虫-杆状病毒表达系统获得人乳头瘤病毒(HPV)16/18/33/58亚型的主要衣壳蛋白L1。方法:克隆了HPV16/18/33/58亚型的L1蛋白基因,并采用密码子优化策略进行改造(记为HPV16/18/33/58亚型mL1),将优化基因片段插入pFastBac Dual载体获得重组载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后得到重组Bacmid,转染昆虫Sf9细胞,Western印迹和SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。结果:获得了表达HPV16/18/33/58亚型mL1蛋白的重组杆状病毒;Western印迹和SDS-PAGE分析表明该重组杆状病毒感染昆虫Sf9细胞后表达mL1蛋白,且mL1蛋白主要分布在细胞中;优化了蛋白表达时间和感染复数,获得目的蛋白mL1的高效表达。结论:多个亚型HPV L1蛋白的克隆表达,为中国优势血清型疫苗的研制奠定了基础。     

16型人乳头瘤病毒衣壳蛋白在真核细胞中的表达

为了构建HPV16型晚期蛋白重组杆状病毒,并使其在昆虫细胞中获得高效表达.首先构建2株重组杆状病毒转移质粒,分别携带人乳头瘤病毒晚期基因L1及L1和L2,再用线性化的杆状病毒DNA与该重组杆状病毒转移质粒共转染sf9昆虫细胞进行同源重组,获得2株重组杆状病毒.经鉴定该重组病毒中有目的基因存在且可表达所编码的L1或L2晚期蛋白.结果表明HPV16型晚期蛋白在昆虫细胞中获得成功表达,为HPV16型预防性基因工程亚单位疫苗的研制和诊断试剂的研究开发奠定了基础.     

甲型H1N1流感病毒HA基因在昆虫细胞中的截短表达

目的:利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System表达重组HA蛋白,Western blot及IFA方法鉴定其表达。方法:采用PCR方法扩增A/California/04/2009(H1N1)HA基因,将其克隆到pFastBacHT A载体上,重组质粒pFastBacHT-HA经双酶切及测序鉴定正确后,转化阳性重组载体进入E.coli DH10Bac感受态细胞中,通过Bluo-gal蓝白斑筛选、PCR鉴定获得重组转座子rBacmid-HA。从重组转座子中提取rBacmid-HA质粒DNA转染sf 9昆虫细胞,制备重组杆状病毒。重组杆状病毒感染sf 9细胞表达重组蛋白,Western blot及IFA鉴定重组蛋白表达情况。结论:成功构建了甲型H1N1流感病毒HA基因的昆虫杆状病毒表达载体,该表达载体转染昆虫细胞后制备的重组杆状病毒病毒滴度较高,重组杆状病毒表达的重组蛋白经Western blot 及IFA 鉴定后具有良好的免疫反应原性。     

截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白的表达及其体外生物活性研究

利用PCR技术克隆截短型HPV58 L1基因并重组入杆状病毒表达系统穿梭质粒pFastBac-Htb,通过转座反应,将目的基因片段重组入杆状病毒基因组,分离重组的Bacmid DNA, 并转染Sf-9昆虫细胞,收集被转染的Sf-9细胞,提取细胞蛋白,SDS-PAGE检测可见在大约58Kda处出现一新生蛋白条带,Western blot 证实为HPV58L1蛋白。用ProBondTM纯化系统纯化所表达的蛋白。小鼠红细胞凝集试验证实纯化的蛋白可介导小鼠红细胞凝集,透射电镜观察证实纯化蛋白可自组装成VLP。结果表明昆虫杆状病毒表达系统可高效表达截短型HPV58L1蛋白,纯化后的截短型HPV58L1蛋白在体外可自组装VLP,并具有介导小鼠红细胞凝集的生物学活性。     

汉坦病毒H8205株G1P基因片段重组杆状病毒表达载体的构建及表达

将汉坦病毒H8205株G1P基因的保守序列(约1000bp)作为目的基因插入到BactoBac杆状病毒表达系统的pFastBacHTb供体质粒中,利用Tn7转座子同BacmidDNA同源重组,获得了含目的基因片段的重组杆状病毒DNA,并利用其转染Sf9昆虫细胞,72h后收集细胞悬液,再用该悬液侵染Sf9昆虫细胞,48h后收获病毒.采用IFA分析收获的产物,观察到了特异性的荧光,并且采用SDSPAGE和Western印迹也获得了与预期一致的结果.证明感染后的Sf9昆虫细胞所表达的蛋白中含有能与抗汉坦病毒H8205株多克隆抗体特异性结合目的蛋白.研究表明,采用杆状病毒表达系统可以成功表达出汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G1基因片段,为开发适合的以G1P为抗原的汉坦病毒诊断试剂进行了前期的探索.     

重组人可溶性CD14在昆虫细胞表达系统中的表达

BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统是一种快速、高效、便捷的表达系统.将人可溶性CD14(sCD14)基因克隆入pFASTBAC1转移质粒中,重组质粒转化DH10BAC感受态细胞,目的基因通过同源重组插入BacmidDNA中,后者转染sf21昆虫细胞获得重组杆状病毒.利用重组蛋白C-末端的6×His@Tag,经TALON金属螯合色谱将重组病毒感染昆虫细胞获得的无血清培养上清--步纯化得到重组蛋白,计算表明从1L培养基中可纯化到约8mg纯度大于95%的重组sCD14蛋白,免疫印迹结果表明重组蛋白具有与抗6×His单抗和抗CD14单抗结合的抗原性.疑胶迁移实验和细胞活性实验表明重组sCD14蛋白能在体外与LPS结合,并能增强LPS诱导THP-1细胞产生细胞毒性因子.     

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达

目的:利用昆虫杆状病毒系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白。方法:将L1基因与p Fast Bac1(p FB1)载体连接,构建转移载体p FB1-L1,转化含Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒r Bacmid-L1;r Bacmid-L1转染Sf9细胞,获得重组病毒r Bac-L1;PCR法检测重组杆状病毒基因组L1基因,间接免疫荧光法和Western印迹检测L1蛋白的表达。结果:穿梭质粒r Bacmid-L1经PCR鉴定构建正确;感染r Bac-L1的Sf9细胞经PCR扩增可见1629 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western印迹鉴定与小鼠抗L1单克隆抗体发生特异性反应,在相对分子质量约60 000处可见特异性条带。结论:利用昆虫杆状病毒表达系统表达了HPV18 L1蛋白。     

鸡白细胞介素18成熟蛋白在昆虫细胞/杆状病毒系统中的表达

将编码鸡的白细胞介素 1 8(chickeninterleukine 1 8,ChIL 1 8)成熟蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB上 ,构建真核转移载体pMelBacBChIL 1 8,经限制性内切酶消化、ChIL 1 8特异引物PCR鉴定和确证性序列测定 ,证明目的基因正确克隆到载体的预期位点。将纯化的pMelBacBChIL 1 8质粒与杆状病毒DNA(Bac N BlueTM DNA)共转染sf9昆虫细胞 ,经四轮蓝斑筛选纯化 ,获得了重组杆状病毒 ,命名为rBaculovirusChIL 1 8。提取病毒染色体DNA ,经ChIL 1 8特异引物和重组杆状病毒特异引物PCR鉴定 ,证明获得了纯化的重组杆状病毒。用该重组病毒接种sf9昆虫细胞 ,收获接种后不同时间的细胞进行SDS PAGE电泳。结果表明ChIL 1 8基因在昆虫细胞中获得了表达 ,表达的重组蛋白分子量约为 2 3kDa。应用在大肠杆菌原核表达系统中表达的重组蛋白制备的兔抗ChIL 1 8多克隆抗体进行Westernblot分析 ,表明本研究真核系统表达的ChIL 1 8成熟蛋白和前期原核系统表达的ChIL 1 8成熟蛋白均具有生物学活性。     

重组人可溶性PDGFRβ/Fc在昆虫细胞Sf9中的表达

【目的】利用昆虫细胞Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达血小板源性生长因子受体β (PDGFRβ)链膜外区与人IgG Fc片段的可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc,并检测重组蛋白的特异性和生物活性。【方法】采用Bac-to-Bac系统,构建重组转移质粒pFastbac-sPDGFRβ/Fc,转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,使目的基因与杆状病毒基因组DNA发生位点特异性重组,获得重组病毒DNA,将其通过脂质体转染昆虫细胞Sf9获得重组病毒。将该重组病毒感染Sf9无血清细胞系,在Sf9细胞中表达sPDGFRβ/Fc,对表达产物进行Western blotting检测和Protein A亲合层析纯化,并进一步通过MTT法检测获得的重组蛋白生物学活性。【结果】重组病毒感染Sf9细胞后,经Western blotting分析,能检测到一条分子量约为97 kDa的特异性条带,与目的蛋白大小相符。通过Protein A亲和层析,获得了纯度达75％以上,表达量为1 μg/mL细胞培养上清的重组融合蛋白,MTT结果显示该重组融合蛋白sPDGFRβ/Fc具有抑制PDGF刺激的Balb/c 3T3细胞增殖的能力。【结论】具有生物活性的重组可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc可在昆虫细胞中成功地得到表达。     

人类细小病毒B19壳蛋白VP2在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用BAC-TO-BAC系统获得了人类细小病毒B19壳蛋白VP2的重组昆虫杆状病毒,并在sf9细胞中表达出VP2。用蚀斑法纯化病毒,终末稀释法测定病毒滴度为3.6×108。Western印迹检测证实了表达蛋白的特异性,间接免疫荧光法可观察到细胞胞浆中的表达蛋白颗粒。     

人视黄醇结合蛋白4在杆状病毒系统中的表达及其多克隆抗体制备

旨在利用杆状病毒系统表达、制备人视黄醇结合蛋白(RBP4)并检测其免疫原性。将人RBP4基因片段及信号肽SS64片段亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-dual(pFBd)中,获得相应的重组转移质粒;转化大肠杆菌菌株DH10bac,转座后经筛选获得重组穿梭质粒rbacmid,将重组穿梭质粒转染孔板培养的Sf9细胞,获得含人RBP4表达框的重组杆状病毒,经过扩增获得毒种。毒种感染对数生长期的Sf9细胞并表达人RBP4蛋白(I-RBP4),通过SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行检测和鉴定。用毒种感染悬浮培养的Sf9细胞制备一批RBP4蛋白,完成SDS、Western blotting的检测及少量的多抗制备。纯化重组蛋白并与E.coli重组人RBP4(E-RBP4)分别免疫家兔。实验结果,酶切鉴定及测序证实重组转移质粒构建正确;成功构建重组RBP4-bacmid;人RBP4蛋白在昆虫细胞获得高效表达。表达的RBP4蛋白可以分泌到培养基中,分子量约为23 kDa,经过计算表达量为100 mg/L;纯化蛋白免疫兔子制备了多抗血清,血清滴度为1∶100 000,高于原核表达的抗体滴度(1∶10 000),与人体提纯蛋白制备的抗体滴度相近。杆状病毒系统高效表达了人的RBP4蛋白,具有较好的抗原性,并获得高亲和力的抗血清,为下一步的人血RBP4检测试剂盒的制备打下了坚实的基础。     

Characterization and functional properties of the A and B forms of human progesterone receptors synthesized in a baculovirus system.

Human progesterone receptors (PR) were overexpressed in Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells using a recombinant baculovirus system. Recombinant viruses were constructed that produced either full-length A (94K) or B (120K) forms of human PR, and each was expressed as a functional protein. Steroid and DNA binding activities were found to be indistinguishable from that of endogenous human PR in T47D breast cancer cells. Moreover, as analyzed by gel-mobility shift, recombinant PR-A and PR-B each bound to specific progesterone response elements in a strictly hormone-dependent manner. Native receptors expressed in Sf9 cells also exhibited structural properties similar to that of endogenous PR. Cytosolic PR (PR-A or PR-B), prepared in low salt buffer, sedimented on density gradients as an 8S oligomeric complex that was converted largely to 4S by treatment with 0.4 M NaCl. Immune isolation of the 8S cytosol PR complex and analysis of protein composition revealed the presence of two specific copurifying proteins of approximately 90K and 70K. The 90-K component was identified immunologically as heat shock protein 90. The 70-K component was not identified but is likely to be the insect equivalent of heat shock protein 70. Immune isolation of PR from Sf9 cells metabolically labeled with [32Pi], revealed that expressed PR was capable of being phosphorylated in insect cells. Hormone addition to Sf9 cells, however, did not stimulate the same increase in PR phosphorylation or upshift in mobility on sodium dodecyl sulfate gels that occurs with endogenous receptors in T47D cells. Thus some, but not all, phosphorylations occur with human PR expressed in Sf9 cells. These phosphorylation data, together with the fact that expressed PR required hormone for DNA binding, indicate that the hormone-dependent phosphorylation step responsible for PR upshifts on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is not required for receptor binding to DNA. The baculovirus expression system, therefore, may prove valuable in dissecting the functional role(s) for both hormone-dependent and hormone-independent PR phosphorylation.     

HIV—1核蛋白p24在昆虫细胞中的表达

将完整的ＨＩＶ－１ ｐ２４基因克隆到杆状病毒转移质粒中,使用重组转移质粒与野生型杆状病毒ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞,经筛选获得带有编码ｐ２４基因的重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Ｓｆ９细胞后在细胞中表达了ＨＩＶ核蛋白ｐ２４。其重组蛋白的分子量为２４ｋＤ。此重组糖蛋白在免疫荧光,免疫印染和酶联免疫实验中都能被人ＨＩＶ－１阳性血清和单克隆抗体所识别。     

汉滩病毒包膜糖蛋白G1和G2重组杆状病毒表达载体的构建与表达及其免疫原性

将汉滩病毒（ＨＴＮＶ）Ｍ基因插入杆状病毒转移质粒ｐＡｃＹＭＩＢ多角体启动子下游附近,与Ｂｓｕ３６１酶切线性化的杆状病毒（ＡｃＶＥＰＡ）ＤＮＡ共同转染Ｓｆ９细胞,经空斑筛选获得了表达包膜糖蛋白（Ｇ１、Ｇ２）的重组杆状病毒（ＡｃｖＨａｎＭ）。经纯化ＡｃＶＨａｎＭＤＮＡ的Ｓｏｕｔｈｅｍｂｌｏｔ证实,Ｍ基因正确插入了杆状病毒基因组中。用抗糖蛋白混合单克隆抗体和病人血清做免疫荧光染色,观察到细小的特异性荧光颗粒,呈典型的核周分布。免疫荧光检测还证实,重组糖蛋白与９株抗糖蛋白单抗均起反应,提示重组糖蛋白的抗原位点分布与病毒毒粒糖蛋白相同或相似,用放射免疫沉淀（ＲＩＰ）分析仅显示Ｇ２带,且表达的Ｇ２分子量略小于病毒Ｇ２,这可能与两者的糖基化程度不同有关。研究还表明,重组糖蛋白具有细胞融合活性。     

Human rotavirus K8 strain represents a new VP4 serotype.

The complete VP4 gene of the human rotavirus (HRV) K8 strain (G1 serotype) was cloned and inserted into the baculovirus transfer vector pVL941 under the control of the polyhedrin promoter. A K8VP4 recombinant baculovirus was obtained by cotransfection of Spodoptera frugiperda (Sf9) cells with transfer vector DNA containing the K8VP4 gene and wild-type baculovirus DNA. Infection of Sf9 cells with this VP4 recombinant baculovirus resulted in the production of a protein that is similar in size and antigenic activity to the authentic VP4 of the K8 strain. Guinea pigs immunized with the expressed VP4 developed antibodies that neutralized the infectivity of the K8 strain. This antiserum neutralized HRV strains belonging to VP4 serotypes 1A, 1B, and 2 with efficiency eightfold or lower than that of the homologous virus, indicating that the human rotavirus K8 strain represents a distinct VP4 serotype (P3). In addition, low levels of cross-immunoprecipitation of the K8VP4 and its VP5 and VP8 subunits with hyperimmune antisera to HRV strains representing different VP4 serotype specificities also suggested that the K8 strain possesses a unique VP4 with few epitopes in common with other P-serotype strains.     

禽白血病病毒J亚群囊膜蛋白env基因的克隆和表达

禽白血病病毒J亚群（ALV－J）是90年代鉴定出的ALV的新亚群,其囊膜蛋白env基因序列别与ALV A－E亚群的有相当大的差别。为ALV－J env基因及春表达产物的特点,用PCR方法扩增出ADOL－4817毒株的env基因,并克隆进TA载体,经电泳鉴定大小为1.7kb。将克隆出的env基因与杆状病毒pBlue-Bac4表达质粒DNA连接,构建成转移性载体pBac4817env,通过与Bac-N-Blue杆状病毒DNA共转染,区得了重组病毒rBac4817env-2。该重组杆状病毒感染Sf9细胞,能高效表达env基因产物,免疫荧光分析结果证明,单克隆抗体G2或多价兔抗env gp37血清能识别Sf9细胞,能高效表达env基因表达的特异性抗原;Western blotting分析结果表明,表达的重组基因产物的分子量大小约为90kD-94kD。用这些重组基因产物免疫鸡可以诱导鸡导鸡产生出高滴度的抗ALV－J特异性抗体。这一结果提示,这种杆状病毒表达的重组基因产物有助于ALV－J env基因生物学特性的深入研究。     

HCV核心蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫学特性的初步评价

通过逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从丙肝患者的血清中分离出编码完整ＨＣＶ核心蛋白（Ｃ区）的ｃＤＮＡ片段,并将其克隆到杆状病毒转移质粒中。重组转移质粒ＤＮＡ与线性的杆状病毒ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞,经蚀斑筛选获得了带编码全部核心蛋白基因的重组杆状病毒。重组病毒感染细胞后表达ＨＣＶ核心蛋白,其分子量的为２０ｋＤ。免疫印染和酶联免疫实验表明,此重组蛋白能被人ＨＣＶ阳性血清所识别。动物实验表明此重组蛋白能诱导小鼠产生特异性抗体。     

用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达人生长激素

利用Bac to Bac杆状病毒载体表达系统将人生长激素 (humangrowthhormone ,hGH)基因cDNA克隆至转移载体pFastBac1中 ,得到pFastBac hGH ,再将其转化进入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中 ,发生转座作用 ,得到含hGH基因的重组穿梭载体rBacmid hGH .纯化DNA ,直接转染培养的昆虫细胞Sf9,得到重组病毒rAcV Bac hGH .经酶切PCR及Southern杂交鉴定 ,hGH基因正确地插入病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下 ,SDS PAGE测得产物蛋白分子量为 2 2kD左右 .用免疫化学发光法测得转染上清中hGH表达水平可达 18μg ml ,与用传统的BEVS表达hGH相比 ,转染上清中hGH表达水平提高 4 0 0倍以上