用于灵芝属10个物种快速鉴定的DNA条形码筛选与验证

灵芝栽培品种常出现同名异物或同物异名的现象,依赖于灵芝的形态学特征鉴定物种的传统分类方法不足以鉴定物种的种间和种内差异。为开发简便而准确的分子水平灵芝属物种鉴定方法,以常用于种属鉴定的核糖体内转录间隔区（ITS）、微管蛋白基因（β-tubulin）片段、大亚基核糖体DNA(LSU)片段和基因编码RNA聚合酶Ⅱ第二大亚基（RPB2）片段4个DNA条形码,对灵芝属10个物种的44份菌株进行PCR扩增和测序,比较4个条形码的扩增成功率和变异率,根据种内、种间遗传距离差异分析筛选特异性的DNA条形码间隔（DBG）,并利用单独及联合条形码构建系统发育树验证筛选的DBG鉴定灵芝属物种的准确性。研究结果表明：β-tubulin和LSU片段的PCR扩增成功率均达100%,ITS和RPB2片段分别为95.35%和90.91%;对比ITS和LSU片段,β-tubulin和RPB2片段的种内最大遗传距离分别小于各自的种间最小遗传距离,存在明显的DBG,有利于准确对物种进行种间鉴定;利用ITS、β-tubulin和RPB2片段分别构建的系统发育树均能使灵芝属10个物种的所有个体聚为1个单系分支,而LSU片段不...     

木霉属补充DNA条形码筛选

木霉属真菌是一类重要的生物资源,在工农业、环境保护等方面具有较高经济价值,对其进行快速、准确的物种鉴定兼具理论意义和应用前景。以木霉属35个概念清晰的种为材料,选择ITS、rpb2和 tef1作为候选基因序列,利用TaxonGap对231个序列片段进行分析,将种内与种间序列差异以及序列获取难易程度作为评价指标,筛选该属的补充条形码片段。结果表明,rpb2具有适宜的种内与种间序列差异,其最小的种间差异（2.48%）,大于最大种内差异（1.8%）,种内、种间遗传距离存在明显的间隔区,并且该基因序列具有较高的PCR扩增与测序成功率（94.4%）;ITS和tef1基因序列的种内与种间序列差异之间存在交叉重叠。因此建议rpb2作为木霉属的补充DNA条形码序列。     

从文献情报分析看iFlora 的发展趋势

在网络化、信息化逐渐改变人们学习、认知和生活的背景下,本文检索并分析了与iFlora研究相关的DNA条形码、生物多样性信息库、基因测序技术、移动鉴定设备等研究论文和情报,取得下列结果：（1） 植物DNA条形码的研究对象以及研究领域在不断延伸和扩展,但寻找高分辨率的DNA条码和组合片段仍是研究热点,相关的植物分类学、系统发育与演化、生态学、植物多样性等研究也在快速发展;（2） 生物多样性信息数据库建设爆发式增长,为iFlora的知识积累和扩展奠定了基础;（3） 第三代DNA测序技术的发展,快速测序设备的小型化将成为可能;（4） 物种认知和识别的初级移动设备已经出现;（5） 信息技术与植物科学等研究的结合,促进跨领域的研究合作和产品开发。本文讨论了iFlora研究计划,表明其是未来植物多样性研究的发展趋势。     

大型经济真菌的DNA条形码研究——以我国剧毒鹅膏为例

鹅膏属（Amanita）部分物种为重要食用真菌,而另外部分物种则是剧毒的,在我国及其他许多国家,每年都有因误食剧毒鹅膏而导致中毒甚至死亡的事件发生。DNA条形码是用一段或几段短的DNA序列来对物种进行快速、准确鉴定的方法。本研究选取三个候选片段,即核糖体大亚基（nLSU）、内转录间隔区（ITS）和翻译延长因子1-α（tef1-α）,使用真核生物通用引物,测试我国已知的7种剧毒鹅膏及2种易混的可食鹅膏,并将欧美分布的但与黄盖鹅膏（A.subjunquillea）亲缘关系密切的绿盖鹅膏（A.phalloides）纳入分析中。nLSU的PCR扩增和测序成功率均为100%,但种内和种间遗传变异偶有重叠。ITS的PCR扩增和测序成功率分别达到100%和85.7%,且具有高的种间变异和低的种内变异。tef1-α的PCR扩增和测序成功率分别达到85.7%和100%,种间和种内遗传分化均高于ITS和nLSU。三个片段的物种分辨率均较高,但与nLSU相比,ITS和tef1-α具有更为明显的barcode gap。鉴于ITS可能会成为真菌界的通用条码,故建议将ITS作为鹅膏属的核心条形码,tef1 α和nLSU作为该属的辅助条形码。     

亚热带森林乔木树种DNA条形码研究——以哀牢山自然保护区为例

作为新一代植物志iFlora的重要组成部分,DNA条形码已经成为物种鉴定中重要且有效的方法。本研究以亚热带森林的乔木树种为研究对象,开展了DNA条形码的尝试性工作。为评估DNA条形码对鉴定亚热带森林树种的有效性,收集并研究了来自哀牢山自然保护区内5l科111属中204个树种的525个乔木个体。结果显示,所选4个DNA片段（rbcL,matK,trnH-psbA和ITS）的PCR扩增成功率都超过90％;测序成功率rbcL和matK最高,分别为90．7％和90．5％,trnH-psbA次之（83．6％）,ITS最低（73．5％）,表明4个片段在亚热带森林乔木中都具有较好的通用性。应用BLAST与NJ Tree两种方法,对物种和属水平的鉴别成功率进行统计,发现单片段中ITS最高,分别为68．4％-81．3％和99．0％～100％,核心条码rkL和matK组合的成功率是52．8％～60．2％和86．7％～90．5％,再与补充条码trnH-psbA和ITS联合,可以成功鉴别74．7％～79．6％哀牢山自然保护区亚热带森林中的乔木物种。由于ITS片段在亚热带森林部分重要树种类群（樟科和壳斗科等）中的测序成功率较差,所以对这些植物类群采用trnH-psbA作为DNA条形码是一个更好的选择。     

关于iFlora核心数据建设中的一些思考

物种是iFlora数据采集的基本对象,但我们面临的植物是一个庞大、复杂的体系,没有正确的分类认识和物种鉴定方法,就不能保证iFlora的准确构建。目前植物中存在着不少数量的疑难种、争议种．已定种分类界限的准确性以及复杂的种下分类单位,都给iFlora的构建带来了较大的问题。本文以作者近年来研究的薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（DioscoreaL．）、蓼科（Polygonaceae）何首乌（PolygonummM虹orumThuna．）、唇形科（Lamiaceae）夏枯草属（PrunellaL．）等为主要例子．对iFlora核心数据中的DNA条形码信息及基础数据中形态学分类信息的建设提出几点思考。重点提出,关注物种尤其是广布种。由于其分布范围广泛,在不同分布区个体常表现出连续变化特征,而实际工作中往往会出现忽略连续变化特征而把1个种在分布区端点的居群鉴定为不同种的问题;因此应关注种的居群DNA条形码的变异幅度。     

竹亚科叶绿体DNA条形码筛选

竹亚科是一个形态上鉴定困难且易于混淆的类群。DNA条形码技术为这一类群的鉴定提供了一个辅助手段。核心条形码（rbcL＋matK）在竹亚科中的鉴别率很低,因此．有必要针对竹亚科筛选有效的DNA条形码片段。本研究根据已发表的竹亚科叶绿体基因组序列,筛选出16个片段,包括1个基因片段和15个基因间隔区,选取青篱竹族和莉竹族的10属22种30个个体,进行引物通用性、测序成功率和变异位点分析。研究结果表明：（1）引物具有较高的扩增成功率,但部分片段中由于存在poly结构造成测序失败;（2）片段中的插入／缺失可以编码,作为信息位点;（3）trnG—trnT（t）具有最多变异位点,建议可作为竹亚科优先选择的DNA条形码;（4）在开展不同类群的DNA条形码和分子系统学研究时,可以按照“trnG—trnT（t）＋x”的方式选择合适的叶绿体DNA片段。     

南方灵芝ITS、EF1-α和RPB2序列多态性研究

内转录间隔区（ITS）、延伸因子1-α（EF1-α）与RNA聚合酶II第二大亚基（RPB2）是真菌系统学研究中常用的基因片段。已有研究发现,在同一个体内ITS也可能存在差异,但EF1-α和RPB2是否也存在同样的现象却鲜有报道。本研究通过克隆测序,分析了南方灵芝Ganoderma australe的ITS、EF1-α和RPB2在同一个体中的序列差异,并探讨这种序列差异是否会影响分子鉴定的准确性。结果表明,在南方灵芝供试样品中,ITS、EF1-α和RPB2序列都有可能存在个体内变异,但个体内变异程度不尽相同。基于供试样品和克隆测序结果发现,ITS序列在同一个体内的变异最高可达2.3%,而RPB2序列在同一个体内的差异仅0.5%,EF1-α序列在同一个体内序列差异也可高达1.8%。ITS和EF1-α序列在同一个体内的差异可能超过了灵芝属部分物种间的差异,对于部分灵芝属物种来说直接利用克隆序列进行分子鉴定或系统发育分析可能存在一些问题。     

植物物种的快速鉴定与iFlora：DNA条形码在马先蒿属中的应用

DNA条形码技术就是利用一段较短的标准DNA序列对物种进行快速鉴定。与基于植物外部形态特征的传统分类鉴定方法相比,DNA条形码具有高效、准确,且易于实现自动化和标准化的特点。马先蒿属（PedicularisL．）植物具对生（轮生）叶的种类70％以上分布在中国．近缘种间形态上非常相似,鉴定较为困难。研究选取马先蒿属具对生（轮生）叶类群43种164份样品,利用叶绿体基因（rbcL、matK、trnH-psbA）和核基因（ITS）条形码片段,采用建树法和距离法检验4个条形码对这些物种的鉴定效果。结果表明,ITS片段用于建树法和距离法的鉴别率分别为81．40％和89．57％,其鉴别率高于3个叶绿体基因片段和任一基因片段的组合条码。另外,利用ITS成功解决了一些疑难种的分类问题。DNA条形码在马先蒿属研究中的实用性为新一代植物志（iFlora）实现物种的快速和准确鉴定提供了有力支持,并能为分类学、生态学、进化生物学、居群遗传学和保护遗传学等分支学科的研究提供重要信息。     

植物物种的快速鉴定与iFlora: DNA条形码在马先蒿属中的应用

DNA条形码技术就是利用一段较短的标准DNA序列对物种进行快速鉴定。与基于植物外部形态特征的传统分类鉴定方法相比, DNA条形码具有高效、准确,且易于实现自动化和标准化的特点。马先蒿属（Pedicularis L.）植物具对生（轮生）叶的种类70%以上分布在中国,近缘种间形态上非常相似,鉴定较为困难。研究选取马先蒿属具对生（轮生）叶类群43种164份样品,利用叶绿体基因（rbcL、matK、trnH psbA）和核基因（ITS）条形码片段,采用建树法和距离法检验4个条形码对这些物种的鉴定效果。结果表明,ITS片段用于建树法和距离法的鉴别率分别为81.40%和89.57%,其鉴别率高于3个叶绿体基因片段和任一基因片段的组合条码。另外,利用ITS成功解决了一些疑难种的分类问题。DNA条形码在马先蒿属研究中的实用性为新一代植物志（iFlora）实现物种的快速和准确鉴定提供了有力支持,并能为分类学、生态学、进化生物学、居群遗传学和保护遗传学等分支学科的研究提供重要信息。     

中国秋海棠属 (秋海棠科) 植物的DNA条形码评价

秋海棠属植物种类繁多,形态变异多样,导致种类的系统放置混乱,近缘种类鉴定困难。利用DNA条形码实现物种快速准确的鉴定技术具有不受形态特征约束的优势,为秋海棠属植物的分类鉴定提供了新的方法。本研究选择4个DNA条形码候选片段（rbcL,matK,trnH psbA,ITS）对中国秋海棠属26种136个个体进行了分析。结果显示：叶绿体基因rbcL,matK和trnH psbA种内和种间变异小,对秋海棠属植物的鉴别能力有限;ITS/ITS2种内和种间变异大,在本研究中物种正确鉴定率达到100%/96%,可考虑作为秋海棠属DNA条形码鉴定的候选片段。研究结果支持中国植物条形码研究组建议将核基因ITS/ITS2纳入种子植物DNA条形码核心片段中的观点。     

DNA条形码技术在植物中的研究现状

DNA条形码技术（DNA barcoding）是用短的DNA片段对物种进行识别和鉴定的分子生物学技术。在动物研究中该技术已经成功应用于利用线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）进行物种鉴定和发现隐种或新物种。相对于动物, COI基因在高等植物中进化速率较慢, 因此植物条形码研究以叶绿体基因组作为重点, 但目前还处于寻找合适的基因片段阶段。许多学者对此进行了积极的探索, 报道了多种植物条形码的候选片段或组合, 但还没有获得满足所有标准的特征位点片段。该文介绍了DNA条形码的标准、优点、工作流程及数据分析方法, 总结了DNA条形码在植物中的研究现状。     

Metabarcoding技术在植物鉴定和多样性研究中的应用

目前植物学研究已进入后植物志时代,iFlora的实现需要以传统植物分类学及相关研究为基础,整合基于高通量测序的DNA条形码（DNAbareoding）技术并开发便携式快速鉴定仪器及构建信息平台。传统植物鉴定多基于形态学分类,而近年来快速发展的DNA条形码快速鉴定技术被各界分类学家认可,在植物鉴定中也被广泛应用。但DNA条形码技术仍存在一些问题亟待解决,如种的鉴定需要多个条形码的解析、Sanger测序平台无法处理混合样品。本文介绍了传统植物分类技术和DNA条形码技术在植物研究中的应用和遇到的瓶颈;并重点介绍了基于高通量测序的metabarcoding技术在植物鉴定及多样性研究中的应用及前景,及其与iFlora的关系。     

构建基于磁珠微流控芯片的iFlora遗传信息高效获取系统

磁珠以其比表面积大、易与生物分子耦联、操控方便等优点,在生命科学中得到了广泛应用。随着微机电系统（MicroElectroMechanicalSystems,MEMS）技术的发展,将磁珠应用到微流控芯片中构建磁珠微流控分析系统,为生物样品分离、检测提供了一种全新方法。新一代植物志iFlora融入现代DNA测序技术．应用高速发展的信息、网络技术及云计算分析平台,收集、整合和管理植物物种相关信息,以实现物种智能鉴定和数据提取,而包括DNA条形码在内的遗传信息及其获取技术在iFlora中的作用至关重要。本文重点概述了基于纳米磁珠的微流控芯片技术及其在分子生物学领域中的应用,提出构建基于纳米磁珠微流控芯片的iFlora遗传信息采集系统,在微芯片上完成从DNA提取到测序全过程,实现物种遗传信息的快速、高效获取。     

关于植物DNA条形码研究技术规范

DNA条形码是利用标准的基因片段对物种进行快速鉴定的技术,已经成功用于生物物种分类和鉴定、生态学调查和生物多样性评估等研究领域。尽管生命条形码数据（BOLD）系统提供了主要针对动物类群DNA条形码研究的技术规范,但由于植物本身的生物学特性与所使用的条形码不同,因此已有技术规范并不完全适用于植物DNA条形码的研究。本文根据植物DNA条形码研究的特点与我国的实际情况,编写了植物DNA条形码研究技术标准和规范指南,具体包括十个方面的内容,即植物DNA条形码研究的样品采集策略;植物标本和野外数据的采集规范;植物标本图像信息的采集规范;植物DNA材料的采集规范;植物DNA材料的干燥与保存规范;植物总DNA的质量标准及保存规范;植物标准DNA条形码的选择与通用引物;DNA条形码的扩增与测序;DNA条形码数据的命名、编辑和提交规范;以及DNA条形码数据分析。我们期望通过这些标准规范的实施和在实践中的不断修订和完善,能为我国学者开展植物DNA条形码和iFlora研究提供参考和借鉴。
关键词：植物DNA条形码;技术规范;物种鉴定;标准;新一代植物志     

ITS作为粒毛盘菌属DNA条形码的探索

以种内与种间差异以及PCR扩增和测序成功率为评价DNA条形码的重要指标,探索ITS序列作为粒毛盘菌属DNA条形码的可行性。结果表明,ITS成功区分了研究涉及的22个种,其PCR扩增和测序成功率为100%,该片段有望成为该属区分物种的DNA条形码。     

COI基因作为丛赤壳科真菌DNA条形码的测试

以丛赤壳科33种76个菌株为材料,探讨COI基因作为该科DNA条形码的可能性。结果表明,该DNA片段存在较多内含子,为了获取某些种的短片段,需设计许多引物,PCR扩增与测序成功率低,难以达到便捷、快速的物种鉴定的目的。因此,COI不宜作为丛赤壳科的DNA条形码。对已获得的少数片段进行分析表明,该基因对丛赤壳科部分种具有较强的物种鉴别力。     

真菌DNA条形码研究进展

DNA条形码（DNA barcode）是通过一段短的标准DNA片段实现物种的快速、准确和标准化鉴定。线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（COI）基因作为动物的DNA条形码已广泛应用于物种鉴定中,在植物上已选定叶绿体rbcL和matK基因作为基本的DNA条形码。目前世界各国真菌学家正对不同的真菌类群进行不同基因片段的筛选与评价,并在第四届国际生命条形码大会上正式推荐了ITS作为真菌的首选DNA条形码。对国内外真菌DNA条形码的研究进展进行总结与分析,并展望真菌DNA条形码的应用前景。     

裸子植物DNA条形码ITS2高通用性引物的筛选

DNA条形码技术是利用标准DNA片段进行准确快速鉴定物种的一种方法,理想的DNA条形码片段应具有高通用性。虽然核糖体DNA内部转录间隔区II（ITS2）被建议作为种子植物有效的DNA条形码,但目前裸子植物还没有通用性高的引物可用。为获得高通用性的ITS2引物,本研究基于裸子植物55个属的5．8S基因的保守序列区设计了3个正向引物,与已有的ITS反向引物组合,组成了7对ITS2引物进行通用性的评价。选取了裸子植物8目、12科和40属的56个种用于本文的研究。引物组合5．8SR／ITS4、5．8SRa／ITS4和5．8SF2／S3R因为在科水平评价中通用性低或者产生的PCR产物有双带,因而排除在全部物种水平上进一步评价。其余4对引物（GYM-5．8SF1／ITS4、GYM-5．8SFl／S3R、GYM-5．8SF2／ITS4和S2F／S3R）在56个物种的PCR检测中,均有100％的扩增率。基于PCR产物的亮度、序列质量和正反向引物覆盖率的综合评价,建议引物GYM_5．8SF2／ITS4作为裸子植物条形码片段ITS2最好的通用引物。     

猪FSH β亚基基因结构区Alu序列插入突变的研究

通过聚合酶链式反应（PCR）对中国华北型优良地方猪种莱芜猪及杜里猪,长白猪的卵泡刺激素（FSH）β亚基基因结构区插入片段进行扩增,并对0．5kb扩增产物进行克隆和测序,序列分析表明,在已发表的猪FSHβ亚基基因全序列的＋809和＋810碱基之间,莱芜猪,杜里猪和长白猪分别存在一个长度为275,277和274bp的插入片段,插入片段末端的poly(A)分别为17,19和16个腺苷酸,均显著短于高产猪种太湖猪（292bp和32个腺苷酸）,对FSHβ亚基基因插入片段进行BamHI多态性分析,发现本研究所检测样品中不存在BamHI 多态性,插入片段中存在一个RNA聚合酶Ⅲ启动子及AluI内切酶识别位点,所以该睡段可能为Alu成分,因RNA聚合酶Ⅲ这种有功能的内部启动子能够转录相邻的染色体序列,该插入片段可能影响FSHβ亚基基因或其他基因的表达调控,把FSHβ亚基基因作为控制猪产仔数主效基因的候选基因与产仔数进行连锁分析,证明FSHβ基因因座在莱芜猪种中与控制猪产仔数的主效基因紧密连锁,优质基因AA纯合子比BB纯合子母猪平均每胎产仔1．2头,因不同品种猪插入序列的主要差异是末端的poly(A)长短不同,推测该插入片段末端的pol(A)结构亦可能影响猪的产仔数。