5’端非翻译区对LT—B基因表达的影响

ｍＲＮＡ５＇端非翻译区的不同结构可影响基因表达,为了改善编码人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素Ｂ亚单位的ＬＴ－Ｂ基因的表达水平,我们把该基因置于ｐＢＶ２２０载体的ＰＲＰ１串联启动子游,构建了带有不同核苷酸组成的５＇端非翻译区重组体。这些重组体。这些重组体分别在大肠杆菌ＨＢ１０１和ＤＨ５ａ中表达。结果表明,起始密码前有两个连续串联ＳＢ序列的ＬＴ－Ｂ基因的表达水平低于只有单个ＳＤ序列下的表达水平,而翻译偶     

5′端非翻译区对LT-B基因表达的影响

mRNA5＇端非翻译区的不同结构可影响基因表达,为了改善编码人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素B亚单位的LT-B基因的表达水平,我们把该基因置于pBV220载体的P_RP_L串联启动子下游,构建了带有不同核苷酸组成的5＇端非翻译区的重组体。这些重组体分别在大肠杆菌HB101和DH5α中表达。结果表明,起始密码前有两个连续串联SD序列的LT-B基因的表达水平低于只有单个SD序列下的表达水平,而翻译偶联可使表达改善;用不同的SD序列LT-B基因的表达水平也有所不同,用基因本身SD序列可能要比用pBV220P_L启动子下游的SD序列好;在只含单个LT-B基因SD序列的重组体中,5＇端非翻译区序列的长短对LT-B基因表达没有什么影响;重组体在HB101中的表达水平高于在DH5α中的表达水平。     

3′端非翻译区影响TNFα cDNA在大肠杆菌中的表达

采用PCR方法改变了表达构建物pRL-rhTNF中的结构,即去掉rhTNFαcDNA3＇端非翻译区序列110bp(命名为pRL-rhTNFα2),转入大肠杆菌后,观察数个阳性转化子的表达情况,并与原型pRL-rhTNFα的表达进行比较。结果表明,去掉3＇端非翻译区的pRL-rhTNFα2能稳定表达rhTNFα,其发酵及纯化产品的生物学特征均等同于原型的,且其表达量比原型的有提高,提示3＇端非翻译区序列对表达有影响。3＇端非翻译区内存在一个相似于TA的重复序列——TTTA TTA七聚体。这可能是本研究中影响TNFα表达量的原因之一。     

3’端非翻译区影响TNFαcDNA在大肠杆菌中的表达

采用PCR方法改变了表达构建物pRL－rhTNF中的结构,即去掉rhTNFα cDNA 3’端非翻译区序列110bp(命名为pRL—rhTNα2),转人大肠杆菌后,观察数个阳性转化子的表达情况,并与原型pRL—rhTNFα的表达进行比较。结果表明,去掉3’端非翻译区的pRL—rhTNFα能稳定表达rhTNFα,其发酵及纯化产品的生物学特征均等同于原型的,且其表达量比原型的有提高．提示3＇端非翻译区序列对表达有影响。3＇端非翻译区内存在一个相似于 TA的重复序列——TTTA TTA七聚体。这可能是本研究中影响TNFα表达量的原因之一。     

丙型肝炎病毒5’非翻译区不同结构域对其启动子活性的影响

在前期工作已证实HCV基因组5’UTRDNA序列具有启动子活性的基础上,分别构建5’UTR不同结构域的DNA序列驱动虫荧光素酶基因表达的质粒pGL3-5’UTR,转染HepG2细胞以及用全长的5’UTRcDNA构建质粒分别转染HepG2、Hela、HEK293、L02细胞,用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平,逆转录聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因mRNA水平,并与相应对照作比较。结果显示当四个结构域都具备时,荧光素酶相对活性为5.91±0.65,为SV40启动子的18.7%;失去结构域I以后,荧光素酶相对活性为9.52±0.32;失去结构域I和II以后,荧光素酶相对活性为2.64±0.25;失去结构域III和IV以后,荧光素酶相对活性为0.32±0.09;失去结构域IV以后,荧光素酶相对活性为2.72±0.45,逆转录聚合酶链反应结果与之相符;全长5’UTRcDNA在L02、hepG2、HEK293、Hela细胞中荧光素酶相对活性分别为0.75,0.49,0.23,0.14。结果提示结构域III是HCV5’UTRDNA序列具备启动子活性的核心结构,结构域I对其5’UTRDNA序列的启动子活性具有抑制效应,而结构域II和IV可增强5’UTRDNA序列的启动子活性;HCV5’UTRcDNA的启动子功能无组织特异性,但在正常的肝细胞(L02)中表达最高。     

森林脑炎病毒森张株5′端非编码区序列测定

为了解森林脑炎病毒森张株5′端非编码区序列与生物特性的关系,从而为疫苗研制打下基础,对其核苷酸序列进行测定。采用RACE法进行RT-PCR扩增,克隆法测序。结果表明：森张株5′-UTR长129nt,与Sofjin-HO、Oshima5-10、Vasilchenko、Neudoerfl、263、Hypr的同源性分别为92％、91％、89％、87％、87％、87％。森张株存在三处特异性变异C18→T、T30→C及49、50连续两个核苷酸缺失。本实验建立了一套相似5′端非编码区序列测定方法;三处特异性变异可能影响到森林脑炎病毒森张株的转录、翻译及核衣壳的形成。     

基于支持向量机的人类5’非翻译区剪接位点识别

基因非编码区域剪接位点的识别是基因识别中一个非常具有挑战性的问题,尤其是5’非翻译区中剪接位点的识别。与一般剪接位点不同,5’非翻译区剪接位点的两侧不存在由编码到非编码的状态转移,所以通常的剪接位点识别算法在非翻译区的性能不太理想。文章采用了基于支持向量机的方法对5’非翻译区中的剪接位点进行识别。为了提高识别精度,采用了基于矩阵相似性度量的核函数参数选取方法,它能够简单快速地确定合适的核函数参数,进而提高核函数的识别性能。通过实验验证,经过参数选择后的支持向量机能够较好地识别5＇非翻译区剪接位点。     

3‘端非翻译区影响TNFa cDNA在大肠杆菌中的表达

采用ＰＣＲ方法改变了表达构建物ｐＲＬ－ｒｈＴＮＦ中的结构,即去掉ｒｈ ＴＮＦａ ｃＤＮＡ ３’端非翻译区序列１１０ｂｐ（命名为ｐＲＬ－ｒｈ ＴＮＦａ２）,转入大肠杆菌后,观察数个阳性转化子的表达情况,并与原型ｐＲＬ－ｒｈ ＴＮＦａ的表达进行比较。结果表明,去掉３’端非翻译区的ｐＲＬ－ｒｈＴＮＦａ２能稳定表达ｒｈＴＮＦａ,其发酵及纯化产品的生物学特征均等同于原型的,且其表达量比原型的有提高,提示ｅ‘     

Sox2基因3'非翻译区保守元件对基因表达的调控作用

转录因子Sox2是脊椎动物早期发育中最早表达的神经系统特异性基因之一,同时在干细胞的维持中也起着关键作用。通过生物信息学分析,作者发现在脊椎动物Sox2 mRNA 3'非翻译区中存在4段非常保守的富含AU的区域。将这些片段按照不同的组合克隆到GFP和荧光素酶两种报告基因载体中,在非洲爪蟾胚胎和培养细胞中检测了这些片段对报告基因表达的影响。结果显示,Sox2的3'UTR可影响报告基因的表达水平,特别是其中的保守片段2可显著提高报告基因的表达水平,表明Sox2 3'非翻译区有可能参与Sox2表达的转录后调控。     

一种新的非翻译区剪接位点识别方法

为提高非翻译区剪接位点识别的精度,提出一种统计概率与支持向量机相结合的识别方法 .该方法主要分为两个阶段,第一阶段应用统计学方法对非翻译区(UTR)序列进行描述,将序列中各碱基之间的相关性、位置特异性、保守性等特征用概率形式描述,以概率参数作为第二阶段支持向量机的输入向量,第二阶段应用带有多项式核函数的支持向量机(SVM)对剪接位点进行识别.通过对人类5′UTR剪接位点数据集进行测试,结果表明:该方法对非翻译区剪接位点的识别取得了很好的效果.     

4株SARS冠状病毒基因组5’端序列的分析与比较

利用5′RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS-CoV基因组5′端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至T easy vector。扩增片段的序列测定结果表明:所分离的4株SARS-CoV基因组5′端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大。同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游-197 nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5′-CUAAAC-3′。     

依赖于5′端非编码区高级结构的真核生物mRNA翻译调控

翻译水平的调控是真核基因表达调控的重要环节.近年来的研究表明,许多真核基因的翻译依赖于RNA5′端非编码区的结构元件.一些小结构元件,如铁离子反应元件,具有1个茎环结构,由铁离子介导控制转铁蛋白的翻译.核糖开关通过结合特定代谢分子在2种结构状态下切换,调控可变剪接和翻译起始.另1个高度结构化的mRNA元件是内部核糖体进入位点,通过富集核糖体和起始因子促进基因的表达.本文综述了依赖于小结构元件、内部核糖体进入位点和核糖开关的真核基因翻译起始调控相应的研究成果和研究方法.对于研究的前景以及可能存在的挑战也作出阐述.     

依赖于5′端非编码区高级结构的真核生物mRNA翻译调控

翻译水平的调控是真核基因表达调控的重要环节.近年来的研究表明,许多真核基因的翻译依赖于RNA 5′端非编码区的结构元件.一些小结构元件,如铁离子反应元件,具有1个茎环结构,由铁离子介导控制转铁蛋白的翻译. 核糖开关通过结合特定代谢分子在2种结构状态下切换,调控可变剪接和翻译起始.另1个高度结构化的mRNA元件是内部核糖体进入位点,通过富集核糖体和起始因子促进基因的表达.本文综述了依赖于小结构元件、内部核糖体进入位点和核糖开关的真核基因翻译起始调控相应的研究成果和研究方法.对于研究的前景以及可能存在的挑战也作出阐述.     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)mRNA5′端非翻译区(UTR)对其表达的调控

运用反转录-PCR技术,从黑色素瘤细胞中扩增出t—PA cDNA 5′末端460bp的片段,再经重组获得含完整5′-UTR的t—PA cDNA克隆,在兔网织红细胞裂解物中翻译和COS-7细胞中表达发现,t—PA mRNA 5′—UTR对其表达有明显的抑制作用。将t—PA mRNA 5′—UTR用苜蓿病毒RNA 5′—UTR替换,使t—PA的表达水平提高3-7倍,mRNA翻译起始区二级结构分析结果表明,翻译起始区的二级结构与t-PA的表达水平有关。     

3′端非翻译区对重组人肝细胞生成素表达不均一性的影响

在工程菌pBV－hHPO／DH5α中表达的人肝细胞生成素（hHPO）以两种分子形式存在,经分析可能是由于表态质粒中hHPO基因的终止密码子TAG的通读造成的。表达载体经改构后,去掉质粒子hHPO基因终止密码子后的非翻译区,采用TAA作终止密码子,结果改构后的表达载体只表达单一形式的hHPO。     

丙型肝炎病毒5'非翻译区不同结构域对其启动子活性的影响

在前期工作已证实HCV基因组5'UTR DNA序列具有启动子活性的基础上,分别构建5'UTR 不同结构域的DNA序列驱动虫荧光素酶基因表达的质粒pGL3-5'UTR,转染HepG2细胞以及用全长的5'UTR cDNA构建质粒分别转染HepG2、Hela、HEK293、L02细胞,用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平,逆转录聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因mRNA水平,并与相应对照作比较.结果显示当四个结构域都具备时,荧光素酶相对活性为5.91±0.65,为SV40启动子的18.7%;失去结构域I以后,荧光素酶相对活性为9.52±0.32;失去结构域I和II以后,荧光素酶相对活性为2.64±0.25;失去结构域III和IV以后,荧光素酶相对活性为0.32±0.09;失去结构域IV以后,荧光素酶相对活性为2.72±0.45,逆转录聚合酶链反应结果与之相符;全长5'UTR cDNA在L02、hepG2、HEK293、Hela细胞中荧光素酶相对活性分别为0.75,0.49,0.23,0.14. 结果提示结构域III是HCV5'UTR DNA序列具备启动子活性的核心结构,结构域I对其5'UTR DNA序列的启动子活性具有抑制效应,而结构域II和IV可增强5'UTR DNA序列的启动子活性;HCV5'UTR cDNA的启动子功能无组织特异性,但在正常的肝细胞(L02)中表达最高.     

Sabin2型脊髓灰质炎病毒适应人胚肺二倍体细胞不同代次病毒滴度与5'端非编码区变异关系

脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)是一类无包膜单股正链RNA病毒,基因组长约7.5kb.其5'端非编码区由约742个核苷酸长,主要与病毒RNA复制、蛋白翻译起始、病毒颗粒的装配及病毒的细胞适应减毒及神经毒力密切相关[1].     

黑曲霉糖化酶高产和低产菌株糖化酶基因调控区的克隆及其分析比较

以PCR合成的糖化酶高产菌株黑曲霉(Asp. Niger)T21糖化酶基因5’近端非编码区588bp(EcoRI-BamHI)的序列为探针,从T21染色体DNA中克隆到近2.0kb的糖化酶基因5’端非编码区序列,并以此序列为探针从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T21的诱变出发株)的染色体DNA中克隆到1.5kb的糖化酶基因5’端非编码区序列。该二序列的分析测定结果表明,其结构特征与文献报道的黑曲霉糖化酶基因5’端非编码区的基本一致,被称为“核心启动子”(Core promoter)的TATAAAT框及GCAAT框,分别在翻译起始点的-109bp及-178bp处。此外,在曲霉amdS,amyB基因中已发现有调控功能的CCAAT序列存在于-449bp和-799bp处。高产和低产菌株糖化酶基因5’端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化。此实验结果为进一步研究黑曲霉糖化酶基因在转录水平上的调控规律打下了基础。