C2株贾第虫SBDS基因的原核表达与生物信息学分析

目的:克隆、原核表达C2株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)的Shwachman-Bodian-Diamond syndrome(SBDS),并对其进行生物信息学分析。方法:以C2株贾第虫基因组DNA为模板获得SBDS基因编码区,克隆入原核表达载体p ET-28a(+),测序并进行生物信息学分析,将重组质粒p ET-28a(+)-SBDS在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,SDSPAGE及Western blot验证表达效果。结果:成功构建了C2株贾第虫SBDS原核表达载体并在在大肠杆菌中得到了高效表达,SDS-PAGE及Western blot显示,在相对分子量约29k Da的位置出现目的蛋白条带,与理论值相符;生物信息学分析显示贾第虫SBDS蛋白在空间上形成三个结构域,在进化上与其它现存真核生物亲缘关系较远。结论:原核表达并分析了贾第虫SBDS蛋白,为贾第虫SBDS的进一步研究提供了基础。     

C2株贾第虫醛糖还原酶的原核表达与生物信息学分析北大核心

[目的]克隆、原核表达、纯化C2株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)醛糖还原酶(Aldose reductase,AR)基因,并进行生物信息学分析。[方法]从C2株贾第虫基因组DNA中克隆贾第虫AR编码区,双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),酶切和测序进行验证,并进行生物信息学分析;将构建成功的重组质粒pET-28a(+)-AR转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并进行诱导表达,SDS-PAGE及Western Blot验证表达效果;镍亲和层析纯化AR蛋白,SDS-PAGE观察纯化效果。[结果]成功克隆了C2株贾第虫AR蛋白编码区并构建了原核表达载体,SDS-PAGE及Western Blot显示,AR表达载体转化的大肠杆菌经诱导可表达出相对分子量约37.2k Da的目的蛋白,与预期一致;重组蛋白通过亲和层析获得了高效纯化;生物信息学分析显示贾第虫AR蛋白主要二级结构为无规则卷曲,整体为一个NADPH依赖的氧化还原酶结构域。AR蛋白在真核生物中相当保守,贾第虫AR蛋白在进化上相对独立。[结论]证实了贾第虫AR蛋白的存在并明确了其结构和进化上的特征,为贾第虫AR抗体的制备和功能的研究提供了基础。     

C2株贾第虫醛糖还原酶的原核表达与生物信息学分析

[目的]克隆、原核表达、纯化C2株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)醛糖还原酶(Aldose reductase,AR)基因,并进行生物信息学分析。[方法]从C2株贾第虫基因组DNA中克隆贾第虫AR编码区,双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),酶切和测序进行验证,并进行生物信息学分析;将构建成功的重组质粒pET-28a(+)-AR转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并进行诱导表达,SDS-PAGE及Western Blot验证表达效果;镍亲和层析纯化AR蛋白,SDS-PAGE观察纯化效果。[结果]成功克隆了C2株贾第虫AR蛋白编码区并构建了原核表达载体,SDS-PAGE及Western Blot显示,AR表达载体转化的大肠杆菌经诱导可表达出相对分子量约37.2k Da的目的蛋白,与预期一致;重组蛋白通过亲和层析获得了高效纯化;生物信息学分析显示贾第虫AR蛋白主要二级结构为无规则卷曲,整体为一个NADPH依赖的氧化还原酶结构域。AR蛋白在真核生物中相当保守,贾第虫AR蛋白在进化上相对独立。[结论]证实了贾第虫AR蛋白的存在并明确了其结构和进化上的特征,为贾第虫AR抗体的制备和功能的研究提供了基础。     

从基因组分析贾第虫的核糖体合成系统

为探讨贾第虫细胞核内核糖体合成系统,及与典型的真核生物有何差异,首先,确定在典型真核生物中参与核糖体合成的129条共有的保守蛋白,然后用这些蛋白搜索贾第虫基因组以调查它们在贾第虫中的直系同源蛋白的情况,以对贾第虫的核糖体合成系统作一了解。结果表明：贾第虫具有89条这些蛋白的直系同源蛋白,包括参与rRNA甲基化和假尿嘧啶化的蛋白复合体成员,以及存在于90S、40S和60S复合体中的蛋白。贾第虫的核糖体合成系统与典型的真核生物相似,但还有40条蛋白在贾第虫基因组中找不到同源蛋白。这意味着贾第虫的核糖体合成系统较典型的真核生物简单。贾第虫虽然没有核仁结构,但其核糖体亚基合成的途径和机制可能与真核细胞相似,参与的成分不同于无核仁结构的原核生物,可能相对简单。     

以ITS1-5.8 SrDNA-ITS2为标记的蓝氏贾第鞭毛虫分子系统发育研究

蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,又称Gi-ardiaintestinalis或Giardia duodenalis,以下简称贾第虫)是一种广为关注的源真核生物(Archezoa),在生物进化中处于原核生物和真核生物的过渡阶段。在医学上,贾第虫是一种重要的导致腹泻的病原体,其宿主广泛,包括人和大多数脊椎动物。研     

生物素标记贾第虫全基因组DNA探针的制备及其特异性敏感性测定

用生物素标记的贾第虫全基因组ＤＮＡ探针,在斑点杂交试验中显示高度的敏感性和特异性。用它可检出１０ｎｇ贾第虫ＤＡ,１０＾３个贾第虫滋养体或包囊,且不与阴道毛滴虫、溶组织内阿米巴、弓形虫和ＢＡＢＬ／ｃ小鼠肝细胞ＤＮＡ,以及贾第虫患者粪便上清液发生交叉反应。本探针可用于贾第虫病病原体检测和虫株鉴定研究。     

蓝氏贾第虫无义mRNA的降解

无义介导的mRNA降解途径（nonsense-mediated mRNA decay,NMD）作为细胞内的一种重要的mRNA质量监控机制,可以降解含有提前终止密码子（premature termination codon,PTC）的异常转录本,从而避免截短蛋白质对细胞的毒害,但其详细的分子机制有待进一步阐释。蓝氏贾第虫（Giardia lamblia)作为一种寄生性单细胞原生动物,进化地位特殊,对其NMD途径的研究有利于阐明基因表达调控的分子和进化机制。本研究通过酵母双杂交及体外pull-down实验分析了贾第虫NMD途径因子上游移码蛋白1(Giardia lamblia up-frameshift 1,GlUPF1)、贾第虫RNA结合蛋白（Giardia lamblia HRP1, GlHRP1）、贾第虫核糖核酸外切酶（Giardia lamblia Ski7p,GlSki7p、Giardia lamblia XRN1,GlXRN1）之间的相互作用关系。结果表明,GlUPF1全长与GlHRP1、GlXRN1(1~500 aa)、GlSki7p间均可发生相互作用。而且GlUPF1的CH结构域和C端结构域分别与GlHRP1、GlXRN1（1~500 aa）、GlSki7p相互作用。说明GlUPF1在贾第虫NMD途径中作为招募平台,在无义mRNA识别和降解过程中发挥重要作用。为此,结合本实验室之前的研究结果,我们提出原生动物贾第虫的NMD途径：在提前终止密码子处SURF(SMG1-UPF1-eRF1-eRF3)复合物形成后,GlUPF1被磷脂酰肌醇3-激酶(suppressor with morphogenetic effect on genitalia 1,SMG1)磷酸化修饰, NMD途径激活,随后GlUPF1与HRP1相互作用,将转录本标记为NMD底物;GlUPF1进而招募下游贾第虫5′-3′核糖核酸降解酶GlXRN1、贾第虫3′-5′ 核糖核酸降解因子GlSki7p,最终降解靶标mRNA。     

蓝氏贾第虫核纤层蛋白基因的初步研究

贾第虫一度被认为是迄今已知的最原始的真核细胞,但近来争议日盛。利用PCR和测序等技术,对蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)的核纤层蛋白(lamin)基因进行了研究。结果表明：蓝氏贾第虫基因组中存在一个编码具有明显lamin特征的基因序列。如该基因序列的3’一端具有编码与核内膜亲和的特征性模体(motif)CaaX的序列;具有B型lamin基因所特有的高度保守的27bp片段,该片段编码高度保守的位于a螺旋杆状区的9氨基酸片段等。同时,这些序列特征又与多细胞的后生动物存在一定差异。这些事实说明在贾第虫中已经进化产生了典型真核细胞的B型lamin(基因)或至少是类似B型的lamin(基因),该生物的进化地位可能并非过去所认为的那么原始。     

贾第虫（Giardia）原始特性的研究进展

贾第虫（Ｇｉａｒｄｉａ）原始特性的研究进展沈剑钊（首都医科大学寄生虫学教研室北京１０００５４）关键词源真核生物,贾第虫,原始特性贾第虫属（Ｇｉａｒｄｉａ）是一类双核寄生性鞭毛虫,它的宿主可为人、哺乳动物、某些鸟类和两栖类。本虫简单的生活周期共分为两个...     

斯氏并殖吸虫乳酸脱氢酶,苹果酸脱氢酶及酯酶同工酶的研究

本文采用Disc-PAGE电泳,首次对我国独有的斯氏并殖吸虫(Paragonimus skrjabini Chen,1959)成虫、童虫、囊蚴的乳酸脱氢酶(以下简称LDH)、苹果酸脱氢酶(以下简称MDH)和酯酶(以下简称EST)同工酶进行了研究。 在成虫、童虫、囊蚴间,LDH、MDH、EST同工酶在酶带数、排列型式、Rf值、相对活性和优势酶带的位置都存在差异。 根据虫体和宿主组织同工酶谱的不同,可以认为是本虫本身所具有。 同工酶作为其分类指标时,不仅要比较不同虫种成虫稳定的同工酶谱,也要比较同工酶在个体发育型式间的差异。     

蓝氏贾第虫核小体的初步研究

最原始的真核生物蓝氏贾第虫虽已有五种组蛋白,但以微球菌核酸酶水解却得不到规则的DNA片段。鉴于贾第虫的特殊进化地位,探讨其是否具有核小体结构,对于研究核小体的起源和进化具有重要的意义。采用改进的染色质铺展技术制备核小体并进行透射电镜观察。结果表明蓝氏贾第虫已有了直径约l0nm的核小体结构。作者认为核小体的形成可追溯到真核生物形成的初期甚至更早,核小体的完善则在真核生物形成之后。     

武汉动物园金丝猴贾第鞭毛虫感染初报

贾第鞭毛虫(Giardia)是寄生于人和动物体内的一种寄生虫,可引起贾第鞭毛虫病。而金丝猴(Rhinopthecus roxellanae)的贾第鞭毛虫感染,迄今尚未见报道。1986年在武汉动物园检查来自湖北神农架林区的金丝猴肠道寄生虫时,发现该猴有贾第鞭毛虫(Giardia sp.)感染,现予报道。此次检查,未能从金丝猴排出的粪便中找到贾第鞭毛虫的滋养体。光镜下包囊呈卵圆形,大小均匀,折光性较强。经卢戈氏碘液着色后,呈棕黄色,可见囊内虫体的部分结构。采用肖丁氏液固定、铁苏木素染色后,油镜下呈椭圆形。大小为10.00～11.50×5.00～7.00微米。囊内虫体长椭圆形,…     

蓝氏贾第虫组蛋白的初步研究

本文初步比较分析了贾第虫组蛋白的存在及其基本组成。通过甲醇固定,两次０．３ｍｏｌ／ＬＨＣｌ抽提及丙酮沉淀,提取贾第虫酸溶性蛋白,利用亲和层析制取总ＤＮＡ结合蛋白,经酸性尿素系统及ＳＤＳ系统电泳分析表明,贾第虫已存在５种组蛋白,其在两种不同性质电泳系统中的电泳行为与相应的小牛胸腺组蛋白有近似的对应关系。说明贾第虫的组蛋白已发生了分化,并已初步形成了性质不同的几个组份,从而在一定程度上支持核小体组蛋白在真核生物的原核祖先阶段就已产生了分化的假说。     

螅状独缩虫自然种群同工酶的研究

利用聚丙烯酰氨凝胶电泳技术,对采自武汉沙湖螅状独缩虫自然种群的酯酶(EST)、苹果酸脱氢酶(MDH)、乳酸脱氢酶(LDH)和酸性磷酸酶(ACP)四种同工酶酶系进行了研究。实验表明:EST同工酶酶系由六个基因座位(Est1-Est6)控制,其中Est1、Est2、Est3和Est5为杂合基因座位,而Est4和Est6为纯合基因座位。螅状独缩虫物种中EST同工酶四级结构既有单体也有二聚体;MDH同工酶酶系由五个基因座位(Mdh1-Mdh5)控制,其中Mdh2和Mdh3为杂合基因座位,而Mdh1、Mdh4和Mdh5为纯合基因座位。螅状独缩虫苹果酸脱氢酶存在明显的上清液型(sMDH)和线粒体型(mMDH)酶带;LDH同工酶酶系较其他原生动物发达,由5条明显酶带组成。与高等动物研究结果比较分析认为,螅状独缩虫乳酸脱氢酶同工酶酶系可能为一个杂合基因座位AB控制;ACP同工酶酶系简单,为一个纯合基因座位编码。取得的结果为揭示螅状独缩虫酶学特征及其自然种群的遗传特征等问题提供了基础资料。       

SMG1-UPF1-eRF1-eRF3复合体参与贾第虫无义介导的mRNA降解激活

无义介导的mRNA降解（NMD）是一种重要的真核生物mRNA质量监控途径。NMD可识别并降解含有提前终止密码子（PTC）的异常mRNA（PTC-mRNA）。但NMD途径对PTC-mRNA的识别和降解机制尚无阐明。蓝氏贾第虫（Giardia lamblia）是一种寄生性的原生动物,进化上处于真核生物基部,对其NMD途径的研究有利于了解NMD途径的机制与进化。本研究通过双分子荧光互补实验、酵母双杂交实验和体外pull-down实验,分析了贾第虫的UPF1 (GlUPF1)、SMG1 (GlSMG1)和肽链释放因子（GleRF1、GleRF3）之间的相互作用关系。结果表明,贾第虫的肽链释放因子都能够与GlUPF1发生相互作用,且GlUPF1的CH结构域与GleRF3能够形成较稳定的复合体,而GlSMG1的激酶结构域PIKK能与UPF1的C端和N端结构域相互作用。进一步研究证实,GlSMG1的PIKK结构域能使GlUPF1两种截短体GlUPF1（1~500 aa）和GlUPF1（501~1 304 aa）发生磷酸化修饰,说明GlUPF1 的N端和C端均有GlSMG1的磷酸化位点。进一步分析证实,T111是GlUPF1上的1个磷酸化位点。我们的研究结果表明,贾第虫NMD途径起始阶段,首先在mRNA的PTC处的核糖体上形成SMG1-UPF1-eRF1-eRF3(SURF)复合体,并且GlSMG1磷酸化修饰GlUPF1,由此激活NMD途径,可能招募XRN1和SKI7d等酶参与无义mRNA的降解。     

源真核生物贾第虫与原细菌着丝粒／动粒蛋白的免疫印迹检查

以抗人着丝粒蛋白Ｂ的单抗和多抗以及抗ＣＨＯ细胞动粒蛋白的单抗对源真核生物（ａｒｃｈｅｚｏａ）蓝氏贾第虫（Ｇｉａｒｄｉａｌａｍｂｌｉａ）和分别代表原细菌的３个枝的３种原细菌（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ、Ｓｕｌｆｏｓｐｈａｅｒｅｌｌｕｓ）作了免疫电泳检查,并以小眼虫和大肠杆菌作为对照。结果表明,３种原细菌都呈阳性反应;而且贾第虫的反应情况显然比纤毛虫、眼虫、典型涡鞭毛虫、尖尾虫（Ｏｘｙｒｒｈｉｓ）等单细胞后真核生物的更接近于原细菌的情况。这不仅从一个新的方面为真核细胞起源于古代的原细菌的学说提供了新的佐证,而且从着丝粒／动粒蛋白方面证明了源真核生物贾第虫的原始性。本工作还为认识着丝粒蛋白Ｂ和动粒蛋白的起源和演化提供了线索。     

四种室内常见(虫非)蠊的酯酶同工酶和苹果酸脱氢酶同工酶的酶谱比较研究

(虫非)蠊,俗名蟑螂,属于昆虫纲,(虫非)蠊目。全世界已知种类约3500多种。在我国见于报道的已有11科,48属,168种以上,其中绝大多数为野外生活的种群,在人居住和工作室内常见的(虫非)蠊仅有七种。这些室内种类不仅传播多种疾病,特别是消化道传染病,而且还能咬坏家庭各种用品,令人厌恶。所以(虫非)蠊之害不亚于苍蝇、蚊虫、老鼠等。 随着调查研究工作的不断深入发展,新的种类也会陆续发现,为了促进这方面工作的发展,我们对我国常见七种室内(虫非)蠊中四种的酯酶同工酶和苹果酸脱氢酶同工酶的酶谱作了比较研究,可供分类的参考。本文报告我们的实验研究结果。     

核仁进化研究取得进展

核仁(nucleolus)是普遍存在于真核细胞间期核中的最显著结构。它是rDNA转录和核糖体亚基组装的场所。如果说核糖体是合成蛋白质的“分子机器”,那么核仁便是制造这一机器的“母机”。中国科学院昆明动物研究所文建凡研究员领导的研究小组先是在一类低等的单细胞真核生物——贾第虫(Giardia)上证实了“不具核仁结构”的现象,那么这类生物是如何进行rDNA转录和核糖体亚基组装呢?     

野生纤毛虫同工酶微量等电聚焦分析探索

微量电泳是用来分离和表征提取于少量生物材料中的核酸和蛋白质的分析技术。作者以缘毛目螅状独缩虫(Carchesium polypinum Linne,1758)为材料,用微量等电聚焦(Microisoelectric focussing)探索了分析野生纤毛虫同工酶的可行性。实验结果表明:(1) 样品量小至两个群体螅状独缩虫(约200个个体)即可进行酯酶同工酶微量等电聚焦分析;(2) 自野外采集材料中立即分离制备的螅状独缩虫匀浆上清液的酯酶同工酶酶谱与实验室内放置10h后分离制备的酶谱几乎一致。因此,野生纤毛虫同工酶可用微量等电聚焦进行分析。     

第七届同工酶国际学术讨论会简讯

第七届同工酶国际学术讨论会于1992年9月6口—13日在俄罗斯新西伯利亚市(俄罗斯科学院远东分院)召开.共有13个国家的70名代表参加大会,我国科学院发育所一名研究人员应邀参加会议. 大会共分9个专题进行报告和讨论.这9个专题是:(1)同工酶研究最新进展(专题发言)。(2)同工酶基因复合物