在庆丰链霉菌中质粒参与庆丰霉素生物合成的遗传研究

本研究表明:庆丰链霉菌生物合成Qm的能力在遗传上是不稳定的。它可以自发或诱发丧失而产生不合成Qn、的q~-突变株,而q~-突变株的遗传性却十分稳定。试验了大约10~(10)个q~-菌株的孢子,没有发现有自发或诱发生成的q~ 菌落。但将q~ 及q~-菌株接种在同一斜面上混合培养,用药物抗性或营养缺陷型作为选择性标记,选择混合孢子液,我们发现q~ 菌株可以把Qm的合成能力转移给q~-突变株而产生转移接合子。据此,我们认为Qm的生物合成有质粒的参与。     

庆丰链霉菌中SQP1质粒控制致育性的遗传证明

我们以前的工作已经证明,野生型庆丰链霉菌生物合成Qm的过程,有sQP1质粒参与(SQP1 ),它可以受质粒消除剂的作用,以1.8一19％的频率消除而产生不能合成Qm的突变株(SQP1~-);它们的营养缺陷型互补对菌株杂交,可以发生基因交换而生成原养型重组子。以后又观察到重组的频率因亲株携带SQP1质粒的状态不同而有明显的差异,SQP1~ ×SQP1~-(或SQP1~ ×SQP1~ )杂交,产生重组子的数目要比SQP1~-×SQP1~-杂交高100—1000倍。本文报道的实验数据,指出庆丰链霉菌的致育性受SQP1质粒所控制。     

庆丰链霉菌SQP1质粒的种间转移和表达

庆丰链霉菌A201菌株的SQP1质粒可以通过混合培养接合转移到井冈链霉菌VA4菌株的细胞中,转移频率为2—8％。接合子p菌株的形态特征和亲株VA4相似,但却获得了产生抑制细菌的抗生素的能力,这种抑制细菌的能力在遗传上是稳定的。高温预培养能使接合子P2菌株抑细菌活性受到消除,消除频率达10％以上。鉴定P2接合子的发酵产物证明包含二个抗菌物质,一个是它本来的产物井冈霉素,另一个是新获得的抑制细菌物质庆丰霉素,后者的产生是由于SQP1进入新寄主细胞的结果。     

SQP1质粒上庆丰霉素生物合成基因的变异和重组

通过原生质体形成与再生手段可以获得庆丰链霉菌SQPI质粒上庆丰霉素生物合成基因发生突变的菌株(Qmrq-)。这些突变株,每两个为一对在斜面上混合培养,使之发生杂交,在所得到的子代菌落中,能检出相当数量回复了庆丰霉素生物合成能力的菌落。推测这些菌落的出现是庆丰霉素合成基因不同突变位点发生遗传重组的结果。     

新霉素产生菌Streptomyces fradiae高效价菌株的选育

我们试验了常用的诱变因素紫外线及氮芥子气对新霉菌所引起的死亡率及变异率的影响,其中以氮芥子气引起的变异率较大。从单一氮芥子气处理中,获得61—7—12菌株此原种产生抗菌素的能力有明显提高。经初筛及复试,在摇瓶发酵中较U1—19菌株提高100—120％。61一7一12菌株在粽合斜面培养基及几种合成斜面培养基上的生长速度厦菌落形态与原种均有明显的区刖：生长极为缓慢,在28℃时绠培养10一12天;孢手颜色较U1—19菌株稍深。在对不同碳源利用的生理特性比较中,67—12菌株亦与Ul一19菌株不同。     

庆丰链霉菌原生质体的形成、再生及融合重组的研究

庆丰链霉菌生长在不含甘氨酸的培养基中,其细胞壁能很好地被溶菌酶溶解,释放出原生质体。原生质体不仅可以在R_2、RM和RG培养基上再生,而且在高渗庆丰链霉菌斜面孢子培养基上也能再生,孢子也比较丰满。A54菌株的再生频率是30.5％,A201菌株为38％。原生质体在4℃贮存过夜,再生频率降低30％以上。PEG能有效地诱导庆丰链霉菌原生质体融合重组,不同分子量的PEG诱导效果不一样,PEG1000的效果最好,重组频率可达10~(-2),和常规杂交相比,重组频率可以提高10—1000倍。用PEG诱导原生质体融合重组时,性因子的存在与否对重组频率没有明显的影响。     

庆丰链霉菌的致死接合现象

庆丰链霉菌各种衍生菌株的平板或斜面能自发产生麻点现象(pock),而当种内或种间杂交时,这种现象出现得更频繁。从麻点中心和周围孢子中可分别分离到具有产生麻点能力的菌株(Ltz~+)和本身虽然不能产生麻点但却可以作为检测麻点产生的指示菌株(Ltz~-)。 本文的研究结果表明,庆丰链霉菌的麻点现象是Ltz~+菌株和作为指示菌的Ltz~-菌株细胞之间在接合过程中的一种致死接合作用(lethal zygosis),致死率可达99％以上。决定这种致死能力的遗传因子能感染转移,可用已知质粒消除因子(如吖啶黄、高温预培养)处理及原生质体再生过程诱发消除。据此,我们认为庆丰链霉菌中产生麻点的能力很可能由质粒基因所决定。对于这种质粒的可能来源进行了讨论。     

用AFLP技术检测慢生型花生根瘤茵竞争结瘤的研究

以5株慢生型花生根瘤菌和天府3号花生为材料,用AFLP技术研究了慢生型花生根瘤菌Spr2—9、Spr3—3、Spr3—5、Spr4—5和Spr7—1的遗传特性和竞争结瘤能力。结果显示,供试条件下,传代次数对菌株的遗传性状无明显影响,28C培养条件下,花生根瘤菌连续传96代,其AFLP指纹未发生明显变化;37C培养,仅Spr3—3和Spr3—5能够存活并正常生长,其AFLP指纹也未发生明显改变,然而其它菌株不能生长。将供试慢生型花生根瘤菌分别接种天府3号花生。光照培养30d后,随机各取4个根瘤,从根瘤中提取类菌体DNA进行AFLP分析,各根瘤类菌体DNA的AFLP指纹图谱与该菌株纯培养物AFLP指纹相同。将5个菌株混合接种天府3号花生,不同菌株的占瘤率存在差异,Spr3—3和Spr3—5的竞争结瘤能力最强,两菌株的占瘤率之和为85．4％;Spr4—5的占瘤率为12．2％;Spr7—1为2．4％;而Spr2—9的竞争结瘤能力最差。本试验结果说明,AFLP技术用于根瘤菌生态和竞争结瘤能力研究,具有下列优点：简易、快速、准确;直接取豆科植物的根瘤提取DNA,进行原位研究;在不改变菌株遗传特性,即不使用突变株的前提下,可以直接测定已知菌株的竞争结瘤能力。     

利用淀粉直接发酵生产肌苷菌株的构建

以肌苷生产菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TF_2为受体菌,利用质粒DNA的原生质体转化法,将携带糖化型α-淀粉酶基因的重组质粒pBX96导入肌苷产生菌TF_2中,转化频率为5.7×10^(-6),获得一株能以淀粉为碳源生产肌苷的转化子T140(pBX96),该工程菌株能在以淀粉为碳源的培养基上平均积累肌苷4.64g/L,经过92代,质粒自发丢失率为0.78％。培养48h后,工程菌株的糖化型α—淀粉酶活力为受体菌的7.79倍。并对工程菌株TI40(pBX96)的发酵条件做了初步摸索。     

庆丰霉素的研究 Ⅵ.庆丰霉素的深层发酵

本研究的目的是探索庆丰霉素深层发酵的适宜条件。结果指出:庆丰霉素深层发酵的最适培养基成份为:玉米淀粉4％,糊精0.3％,黄豆饼粉2.0％,花生饼粉2.5％,硝酸钾0.2％,氯化钠0.3％,碳酸钙0.4％。适量的花生饼粉和硝酸钾对庆丰霉素的产生均有明显的促进作用,最适发酵温度为33℃。用庆丰链霉菌M15菌株进行摇瓶及发酵罐发酵,庆丰霉素的效价均达4500～5000微克/毫升。 铁对庆丰霉素产生有抑制作用,培养基中加入葡萄糖表现出葡萄糖效应。 对花生饼粉及硝酸钾促进庆丰霉素合成和铁及葡萄糖抑制庆丰霉素合成的可能作用机理进行了讨论。     

大豆基因工程根瘤菌田间结瘤和共生固氮效应

利用三亲本接合转移方法,将快生型大豆根病菌B_(52)的基因文库克隆转移到受体菌慢生型大豆根瘤菌2210中,获得4株大豆基因工程根瘤菌(32.43、B—2—6、B—3—8)。田间接种试验表明:在大豆分枝期(V2),43和32结瘤效分别比不接种对照增加117.9％和100.4％;在初花期(R_1),32和B—2—6结瘤数分别比对照增加122.5％和91.6％,根瘤固氮酶活性增加233.3％和195.6％;在结荚始期(R3),B—2—6和32结瘤数比对照增加78.5％和70.1％,根瘤固氟酶活性43和B—2—6分别比对照增加53.4％和49.3％。产量统计表明:32、B—2—6和43比对照分别增产16.8％、14.3％和12.2％,亩增收大豆分别为28.2、24.1和20.6公斤。以上三个菌株均比受体菌株2210增产率高。     

血清7型胸膜肺炎放线杆菌apxⅡC-/apxⅠA+基因缺失重组菌株的构建与鉴定

通过接合转移和SacB负向筛选方法,成功构建了一株apxⅡC缺失的血清7型胸膜肺炎放线杆菌重组菌株。首先构建重组转移质粒pEHA1。将pEHA1转化供体菌大肠杆菌(E.coliβ2155),并将其与野生型APP血清7型亲本菌混合培养约5h,然后涂到含氯霉素抗性的培养基培养,挑取阳性克隆,接种到无抗性液体培养基,培养后涂于含有蔗糖的的固体培养基,培养一定时间后挑取蔗糖抗性的克隆,即可得到目的突变株。通过PCR、遗传稳定性、外毒素分泌、重组位点序列分析证明重组菌构建成功。通过对重组菌生物学特性进行初步研究,表明突变株生长能力未受影响,对小鼠毒力显著降低。该突变株构建体系的建立为猪传染性胸膜肺炎减毒活疫苗的开发及对胸膜肺炎放线杆菌新基因的功能研究奠定了良好基础。     

黄瓜膨胀素的重组表达及活性分析

目的:提高纤维素的酶水解效率和开发高效的纤维素酶水解过程。方法:采用RT-PCR方法从黄瓜胚轴细胞中分离了膨胀素S1的cDNA,并使之与毕赤酵母表达质粒pPICZ(A连接,形成重组质粒pPICZ(A-exs1。通过电转化方法,用质粒pPICZ(A-exs1转化巴氏毕赤酵母GS115,得到重组菌株P.pastoris-exs1。在该重组菌株中,膨胀素的基因通过同源重组整合在毕赤酵母的染色体上,并处于毕赤酵母甲醇氧化酶启动子的下游。重组菌株P.pastoris-exs1在甲醇诱导下可合成并分泌膨胀素。结果:培养上清液没有纤维素酶活性,但具有破坏滤纸纤维素结晶结构的能力。培养上清液与里氏木霉纤维素酶等量混合后,可使纤维素酶的滤纸酶活力提高50%。结论:采用巴氏毕赤酵母GS115重组成功表达了黄瓜膨胀素,其表达产物可以促进纤维素酶对滤纸的水解。     

血清7型胸膜肺炎放线杆菌apxⅡC-/apxⅠA+基因缺失重组菌株的构建与鉴定

通过接合转移和SacB负向筛选方法,成功构建了一株apxⅡC缺失的血清7型胸膜肺炎放线杆菌重组菌株。首先构建重组转移质粒pEHA1。将pEHA1转化供体菌大肠杆菌(E.coliβ2155),并将其与野生型APP血清7型亲本菌混合培养约5h,然后涂到含氯霉素抗性的培养基培养,挑取阳性克隆,接种到无抗性液体培养基,培养后涂于含有蔗糖的的固体培养基,培养一定时间后挑取蔗糖抗性的克隆,即可得到目的突变株。通过PCR、遗传稳定性、外毒素分泌、重组位点序列分析证明重组菌构建成功。通过对重组菌生物学特性进行初步研究,表明突变株生长能力未受影响,对小鼠毒力显著降低。该突变株构建体系的建立为猪传染性胸膜肺炎减毒活疫苗的开发及对胸膜肺炎放线杆菌新基因的功能研究奠定了良好基础。     

基因重组菌质粒稳定性的提高与苯丙氨酸发酵的研究

本研究用具有苯丙氨酸生产抗反馈抑制基因pheA^FR、aroF^FR及温度敏感型阻遏基因CI857的质粒pSYl30—14和具有分配机能的低拷贝质粒pSYl6,重组构建了具有苯丙氨酸生产基因系统的质粒：psY200一14,然后使其转化到大肠杆菌AT2471中,育成了基因重组菌株AT247l／psY200—14。试验表明,该菌株质粒稳定性比原菌株AT2471／psYl30—14有较大的提高,当存在选择压时,在30～42℃范围内维持100％的高稳定性。应用此重组菌株,在2．5L通气搅拌罐进行发酵试验,在搅拌转速850rpm,通气速率1．Ovvm,38．5℃和pH7．O的条件下,发酵48h苯丙氨酸生成量达14．2g／L,比原株增产l1．8％。     

混合培养对光合细菌生长量的影响

采用光合细菌不同菌株,光合细菌株与异养细胞株间混合培养,比较它们与单株培养物生长量的差异。试验结果表明,不同组合的混合培养物春生长量均不同程度高于单株培养物。光合细菌株间混合培养物生长量约高于对照０．３６－１７．４％;多数增长１１％以上。光合细菌株与异养细胞     

卷枝毛霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的高效表达

为获得产高γ—亚麻酸的酿酒酵母工程菌株,应用RT—PCR技术,从卷枝毛霉中扩增出△^6—脂肪酸脱氢酶基因,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2．0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYES412,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母缺陷型菌株INVScl中,在SC—ura合成培养基中筛选到转化酵母,在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体,通过气相色谱对转化酵母进行脂肪酸色谱分析,结果表明：γ—亚麻酸占总脂肪的50．07％。迄今为止,这是国内外△^6—脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母表达量最高的报道。     

一种高效、稳定的分泌型原核表达载体的构建及应用

以本室构建的原核表达载体pTO-T7为基础载体,PCR合成ompT引导序列,插入该载体多克隆位点上游,构建了分泌型原核表达载体pTO—OT。将2个外源基因克隆至pTO—OT,2个重组质粒在大肠杆菌中均得以高效表达,表达量为25％～30％。Western印迹分析证实了重组蛋白在大肠杆菌中表达后可被信号肽酶有效识别,切割后的重组蛋白具有良好的免疫学活性。对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的遗传稳定性,显示了该原核表达载体在基因工程中的应用价值。     

nisin Z部分操纵子基因超表达对nisin Z合成的影响

目的:构建表达载体pMG76e-nisABTCI,合成重组菌,分析nisin合成基因簇中的nisABTCI超表达对nisin生物合成的影响。方法:将nisABTCI基因克隆与表达载体pMG76e酶切后连接转化,并通过Bio-Rad Gene Pulsor电穿孔法将重组质粒载体转入Lactococcus Lactis N401中,得到重组菌株N401C。对比工程菌和原始产生菌的nisin Z产量。以16S rRNA为内参基因,通过半定量RT-PCR方法,比较分析原始菌株N401和3株重组菌株中nisin合成基因簇中的11个基因的表达情况。结果:成功构建重组菌株,重组菌株的nisin Z产量提高了70%左右。半定量RT-PCR结果表明不同菌株的nisin合成基因的表达表现出了不同的特征。与菌株N401相比,3株重组菌株的大部分基因上调了。结论:nisABTCI超表达明显地提高nisin产量约70%。上调的基因可能对nisin合成效率的提高具有关键作用。     

酰基高丝氨酸内脂合成酶LasI对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响

【背景】禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli, APEC)是禽类主要病原菌之一,群体感应(Quorumsensing,QS)系统可通过信号分子调控其生物学特性。在APEC中信号分子AHL对其生物学特性的影响目前尚不清楚。【目的】研究信号分子AHL对APEC生物学特性的影响。【方法】将含铜绿假单胞菌酰基高丝氨酸内脂合成酶(Acyl-homoserine-lactone synthase,lasI)基因的表达质粒转化至APEC菌株DE17中,构建重组菌株DE17-lasI,利用LasI在DE17中合成AHL。比较野生株和重组菌株产生AHL信号分子、生长特性、生物被膜形成能力、运动性以及耐药性等生物学特性的差异;运用Real-timePCR技术,比较野生株和重组菌株中与生物被膜形成、运动性以及毒力因子相关基因的转录水平。【结果】对重组菌株AHL信号分子检测表明,DE17-lasI能够产生AHL信号分子,与野生株DE17相比,DE17-lasI生物被膜形成能力和运动性显著降低(P0.01),但其生长特性和耐药性无显著变化(P0.05);Real-time PCR检测结果表明,重组菌株的毒力因子fimH转录水平上调了58.8倍,而ompA、iss分别下调了95.4%、77.3%。与生物被膜形成相关基因agn43下调了75%,鞭毛合成基因flhA下调了80.8%。此外,AHL受体sdiA的转录水平上调了19.8倍。【结论】转化lasI至APEC中,能促进其在APEC中合成信号分子AHL,并显著影响APEC的部分生物学特性,为进一步探讨AHL型群体感应系统对APEC的调控作用提供参考。